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[摘 要] 目的：寻找适用此药品的检验方法。方法：取本品10g，用PH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制成1：10的供试液。细菌数取供试液，低速离心（500r/min 5min）弃去沉淀，取上清液，采用培养基稀释法（0.2ml/皿）依法检查定。结论：利胆片微生物限度检验，“细菌数计数”用“低速离心沉淀法＋培养基稀释法（0.2ml/皿）”“真菌数计数”用“常规法”检验可消除样品的抑菌活性。
[关键词] 利胆片 检验方法 验证
一、前言
大部分中成药都含有抑菌成分，在药品微生限度检查或无菌检查中不如排这些抑菌分的干扰，就是法真实的反映中成药中的实际含菌量，因而会给药品质量带来潜在风险。中成药的微生物限度检验方法学验证与评估工作是降低药品质量风险，保证药品质量安全的必要工作。本文以抑菌活性较强的中成药制剂利胆片为例，进行检定菌的微生物限度检查方法的考查与探讨，以求得举一反三的较果。
二、方法
菌液制备
1.分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的营养琼脂斜面或菌液培养物至10ml新鲜营养肉汤培养基中，30-35℃培养18-24小时；上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50-cfu的菌悬液。菌数测定采用营养琼脂培养基平皿法。
2.接种白色念珠菌菌种至新鲜改良马丁培养基中，23-28℃培养24-48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50-cfu的菌悬液。菌数测定采用改良马丁琼脂培养基平皿法。
3.接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上，23-28℃培养5-7天至产生大量孢子，加入无菌玻璃珠滚动几下在加3—5ml0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50-cfu的孢子菌悬液。孢子测定采用改良马丁琼脂培养基平皿法。
供试液制备
取供试品10g或10ml加PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1:10的供试液。
1.常规法
(1)实验组：最1：10供试液1ml（平行2份）和1ml含50-100cfu的实验菌分别注入平皿中，立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。(每株实验菌各制备2份平板)
(2)菌液组：取菌液1ml注入平皿内（平行2份），立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。（每株实验菌各2个平板）。
(3)供试品对照组：取1：10供试液各1ml（平行2份）至直径90mm的4个无菌平皿中，分别注入15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。
（4）结果判定：在3次独立的平行实验中，若实验组的菌回收率（实验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌（实验完毕）；若任一次实验中实验组的菌回收率低于70%，必须采用培养基稀释法，消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
2.培养基稀释法
2.1（二倍稀释法，0.5ml/皿）
（1）实验组：取1：10的供试液0.5ml注入平皿内（平行2份），每皿加入1ml（含实验菌50-100cfu）实验菌液，立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。(每株实验菌为一组,每组2份平板)
（2）供试品对照组：取1：10的供试液0.5ml注入平皿内（平行制备2份），立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。(平行各2份平板)
（3）菌液组：取菌液1ml注入平皿内（平行2份），立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。(每株实验菌制备2份)
（4）方法判定：在3次独立的平行实验中，若实验组的菌回收率（实验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌（实验完毕）；若任一次实验中实验组的菌回收率低于70%，必须采用离心沉淀集菌法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
2.2五倍稀释法，0.2ml/皿
（1）实验组：取1：10的供试液0.2ml，注入平皿内（平行制备2份），每皿加入1ml（含实验菌50-100cfu）实验菌液，立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。(每株实验菌为一组,每组2份平板)
（2）供试品对照组：取1：10的供试液0.2ml，注入平皿內（平行2份），立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。(各制备2份)
（3）菌液组：取菌液1ml注入平皿内（平行2份），立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。(每株2份)
（4）结果判定：在3次独立的平行实验中，若实验组的菌回收率（同上）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌（实验完毕）；若任一次实验中实验组的菌回收率低于70%，必须采用离心沉淀集菌消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证
3、离心沉淀集菌法
取1:10的供试液20ml离心（500r/min5min），弃去沉淀，取上清液，依法检查。
(1)实验组：取上述供试液1ml，注入平皿内（平行2份），每皿加入1ml（含实验菌50—100cfu）实验菌液，立即倾入15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。（每株实验菌为一组，每组2份）
（2）供试品对照组：取上述供试液1ml，注入平皿内（平行2份），立即倾注15—20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。（每株实验菌为一组，每组2份）
（3）菌液组：取实验菌液1ml，注入平皿内（平行2份），立即倾注15—20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时所需培养基混匀、待凝、倒置培养点计菌落数。（每株实验菌为一组，每组2份）
（4）结果判定：在3次独立的平行实验中，若实验组的菌回收率（同上）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌（实验完毕）；若任一次实验中实验组的菌回收率低于70%，必须采用离心沉淀集菌＋培养基稀释法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
三、结论
利胆片微生物限度检验，“细菌数计数”用“低速离心沉淀法＋培养基稀释法（0.2ml/皿）”“真菌数计数”用“常规法”检验可消除样品的抑菌活性。■
参 考 文 献
[1]中华人民共和国国家药典委员会，中国药典2005年版一部附录ⅩⅢC
[关键词] 利胆片 检验方法 验证
一、前言
大部分中成药都含有抑菌成分，在药品微生限度检查或无菌检查中不如排这些抑菌分的干扰，就是法真实的反映中成药中的实际含菌量，因而会给药品质量带来潜在风险。中成药的微生物限度检验方法学验证与评估工作是降低药品质量风险，保证药品质量安全的必要工作。本文以抑菌活性较强的中成药制剂利胆片为例，进行检定菌的微生物限度检查方法的考查与探讨，以求得举一反三的较果。
二、方法
菌液制备
1.分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的营养琼脂斜面或菌液培养物至10ml新鲜营养肉汤培养基中，30-35℃培养18-24小时；上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50-cfu的菌悬液。菌数测定采用营养琼脂培养基平皿法。
2.接种白色念珠菌菌种至新鲜改良马丁培养基中，23-28℃培养24-48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50-cfu的菌悬液。菌数测定采用改良马丁琼脂培养基平皿法。
3.接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上，23-28℃培养5-7天至产生大量孢子，加入无菌玻璃珠滚动几下在加3—5ml0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50-cfu的孢子菌悬液。孢子测定采用改良马丁琼脂培养基平皿法。
供试液制备
取供试品10g或10ml加PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1:10的供试液。
1.常规法
(1)实验组：最1：10供试液1ml（平行2份）和1ml含50-100cfu的实验菌分别注入平皿中，立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。(每株实验菌各制备2份平板)
(2)菌液组：取菌液1ml注入平皿内（平行2份），立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。（每株实验菌各2个平板）。
(3)供试品对照组：取1：10供试液各1ml（平行2份）至直径90mm的4个无菌平皿中，分别注入15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。
（4）结果判定：在3次独立的平行实验中，若实验组的菌回收率（实验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌（实验完毕）；若任一次实验中实验组的菌回收率低于70%，必须采用培养基稀释法，消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
2.培养基稀释法
2.1（二倍稀释法，0.5ml/皿）
（1）实验组：取1：10的供试液0.5ml注入平皿内（平行2份），每皿加入1ml（含实验菌50-100cfu）实验菌液，立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。(每株实验菌为一组,每组2份平板)
（2）供试品对照组：取1：10的供试液0.5ml注入平皿内（平行制备2份），立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。(平行各2份平板)
（3）菌液组：取菌液1ml注入平皿内（平行2份），立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。(每株实验菌制备2份)
（4）方法判定：在3次独立的平行实验中，若实验组的菌回收率（实验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌（实验完毕）；若任一次实验中实验组的菌回收率低于70%，必须采用离心沉淀集菌法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
2.2五倍稀释法，0.2ml/皿
（1）实验组：取1：10的供试液0.2ml，注入平皿内（平行制备2份），每皿加入1ml（含实验菌50-100cfu）实验菌液，立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。(每株实验菌为一组,每组2份平板)
（2）供试品对照组：取1：10的供试液0.2ml，注入平皿內（平行2份），立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。(各制备2份)
（3）菌液组：取菌液1ml注入平皿内（平行2份），立即倾注15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。(每株2份)
（4）结果判定：在3次独立的平行实验中，若实验组的菌回收率（同上）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌（实验完毕）；若任一次实验中实验组的菌回收率低于70%，必须采用离心沉淀集菌消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证
3、离心沉淀集菌法
取1:10的供试液20ml离心（500r/min5min），弃去沉淀，取上清液，依法检查。
(1)实验组：取上述供试液1ml，注入平皿内（平行2份），每皿加入1ml（含实验菌50—100cfu）实验菌液，立即倾入15-20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。（每株实验菌为一组，每组2份）
（2）供试品对照组：取上述供试液1ml，注入平皿内（平行2份），立即倾注15—20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时，点计菌数。（每株实验菌为一组，每组2份）
（3）菌液组：取实验菌液1ml，注入平皿内（平行2份），立即倾注15—20ml温度不超过45℃已溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固倒置培养48和72小时所需培养基混匀、待凝、倒置培养点计菌落数。（每株实验菌为一组，每组2份）
（4）结果判定：在3次独立的平行实验中，若实验组的菌回收率（同上）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌（实验完毕）；若任一次实验中实验组的菌回收率低于70%，必须采用离心沉淀集菌＋培养基稀释法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
三、结论
利胆片微生物限度检验，“细菌数计数”用“低速离心沉淀法＋培养基稀释法（0.2ml/皿）”“真菌数计数”用“常规法”检验可消除样品的抑菌活性。■
参 考 文 献
[1]中华人民共和国国家药典委员会，中国药典2005年版一部附录ⅩⅢC