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摘要 [目的] 通过对从湖北省某猪场分离获得的伪狂犬病毒的gE基因克隆和测序，分析其遗传变化规律。[方法]参考GenBank中猪伪狂犬病病毒（Porcine pseudorabies Virus，PRV）gE基因的序列设计1对引物，对PRV湖北株gE基因进行PCR扩增和序列分析，PCR产物克隆到pMD 18T载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序，与GenBank收录的国内外其他地区的标准参考毒株进行同源性分析和比较。[结果]与标准参考毒株的核苷酸序列同源性为95.0%～98.0%，进化树分析表明，PRVHBXS2014株与河南焦作株EU561349China同属于一个分支，亲缘关系较近，但存在个别位点的基因突变。[结论] 为有效防控该病提供参考。
关键词 猪伪狂犬病毒；gE基因；PCR扩增；克隆；序列分析
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）25-08502-02
Abstract [Objective] Based on cloning and sequencing of Hubei strain gE gene of porcine pseudorabies virus isolated from a pig farms in Hubei Province， their genetic variation was analyzed. [Method]A pairs of primers were designed and the sequence of gE gene of pseudorabies virus in the reference GenBank，PCR amplification and sequence analysis of PRV Hubei strain gE gene was done，and the PCR product was cloned into pMD 18T vector.By restriction enzyme analysis and sequencing of recombinant plasmid， homology analysis and comparison with the other regions included in GenBank standard reference strains at home and abroad.[Result]The results showed that with the standard reference strains， the nucleotide sequence homology of 95.0%-98.0%， phylogenetic tree analysis showed that，PRVHBXS2014 strain and Jiaozuo EU561349China in Henan strain belonged to the same branch， close relationship，but there are some gene mutation，and the results were consistent with the reported in the literature.[Conclusion] The study provided a reference for effective prevention and control of the disease.
Key words Porcine pseudorabies virus；gE gene；PCR amplification；Cloning；Sequence analysis
伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（PRV）引起的多种家畜和野生动物均可感染的急性传染病，以发热、流产、死产、奇痒（猪除外）和脑脊髓炎为主要症状，其中对猪的危害最大，且猪是唯一的自然宿主[1]。
PRV属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科，为双链DNA，全长约150 kb，基因组GC含量最高达73%，包括70多个开放性阅读框，可以编码70～100种病毒蛋白。gE基因对PRV体内毒力表达、侵袭神经和沿着神经传递起着决定性的作用。目前gE缺失疫苗在病毒侵入神经系统方面被认为比其他单个非必需糖蛋白缺失苗更安全，同时gE不会影响病毒的复制和中和抗体的产生，且gE是所有野毒株均表达的一类糖蛋白。因此gE可作为PR净化过程中标志基因，可区别感染动物和接种动物，以剔除阳性的野毒感染动物[2-3]。
2012年以来，我国许多省市暴发临床症状疑似伪狂犬病的传染病，尤其一些免疫过gE缺失疫苗的猪场也暴发该病，主要表现为猪群gE抗体阳性率显著升高，母猪产弱仔、死胎，仔猪出现神经症状及死亡等，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。笔者通过对从湖北省某猪场分离获得的伪狂犬病毒的gE基因继续克隆和测序，分析其遗传变化规律，为有效防控该病提供参考。
1 材料与方法
1.1 病毒与细胞 伪狂犬湖北株PRVHBXS2014株（武汉大学菌种库保藏号：CCTCC V201420），BHK21细胞与大肠杆菌DH5α均为湖北省农业科学研究院动物胚胎工程分子育种湖北省重点实验室冻存。
1.2 主要试剂 细胞培养基MEM和无菌小牛血清购自GIBCO公司；2×EasyTaq PCRMix购自全式金生物技术有限公司；限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ、pMD 18T载体及其连接试剂、DL2000 Marker购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖购自北京鼎国生物技术有限公司；胶回收试剂盒和DNA小提试剂盒购自爱思进生物技术有限公司。
1.3 病毒培养 将伪狂犬毒株用BHK21细胞培养，培养液为含10%小牛血清的MEM培养液，维持液为含2%小牛血清的MEN培养液。待细胞长至90%以上时加入适量病毒液，37 ℃吸附1 h，加入适量维持液，37 ℃培养，在细胞病变达到80%以上时停止培养，反复冻融3次后收获病毒培养液。 1.4 引物的设计与合成 参考GenBank中已报道的猪伪狂犬病毒gE基因序列设计，上游引物P1：5’GCGGCCCTTTCTGCTGCG3’；下游引物P2：5’AGCGGGGCAGGACATCAA3’。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.5 DNA的提取 采用爱思进生物技术有限公司DNA小提试剂盒提取并于-20 ℃保存。
1.6 PCR扩增 PCR反应体系体积为50 μl，其中10 μmol/L上下引物各1 μl，DNA 模板5 μl，2×EasyTaq PCRMix 25 μl，剩下添加ddH2O至50 μl。反应程序：97 ℃ 10 min，72 ℃ 4 min；95 ℃ 1 min，65 ℃退火 2 min，72 ℃ 2.5 min，34个循环；72 ℃ 10 min。
1.7 PCR产物克隆和测序 PCR产物的克隆与鉴定连接反应体系为10 μl，依次加入PCR产物5 μl、pMD18T载体1 μl、连接缓冲液4 μl，16 ℃连接4 h。取5 μl连接产物转化至制备好的DH5α感受态细胞，涂于含氨苄青霉素的LB平板，37 ℃培养 12～16 h。从平板上挑取单菌落接种于3 ml含氨苄青霉素的LB培养液，37 ℃振荡培养16～20 h。提取质粒，用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切质粒后电泳，按分子量大小初步筛选阳性菌株，鉴定阳性重组质粒。将酶切鉴定为阳性的重组质粒送到上海生工生物工程有限公司测序，然后利用基因分析软件DNAStar对测序结果进行分析比较。
2 结果与分析
2.1 gE基因的PCR扩增 以伪狂犬病毒湖北株DNA为模板，进行PCR扩增后得到1 626 bp的片段，与预期相符（图1）。
2.2 重组质粒的酶切鉴定
提取重组质粒后选用限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，获得2条大小为2 692和1 626 bp左右的片段，分别与预期基因片段大小相符（图2）。
2.3 gE基因的序列测定及其分析 利用DNAStar软件将测出的HBXS2014gE基因全序列（图3）与国内外报道的PRV分离株（AY183124、湖北Ea株AF171937、广东SH株EF552427、AF207700、美国Becker株AY368490、FJ605135、JF460026、JX417716、Fa株AF403049、河南焦作株EU561349China、Malaysia株FJ176390、GZZ1株HQ832846、西班牙NiA3株EU502923、Rice株M14336、MINA株AY170318）进行核苷酸同源性比较分析。
3 讨论
近年来，猪伪狂犬病席卷全国大部分省份，临床病例呈逐渐上升趋势。目前表现为临床症状不明显，仔猪少见神经症状，母猪主要表现为流产和死胎，发病出现急性死亡，犬猫大量死亡；免疫不同厂家不同毒株疫苗依然发病；临床抗体检测免疫效果好的猪场依然发病；猪伪狂犬病毒野毒的感染率在70%～80%。目前已给我国养猪业造成了巨大的经济损失。
该研究通过PCR技术成功克隆出了PRVHBXS2014株的gE基因，序列全长为1 626 bp，通过与国内外已公布序列对比发现，该毒株与EU561349China株同源性最高，同属于一个分支，通过核苷酸序列对比发现存在一定的基因突变现象。
参考文献
[1] STRAW B E，ZIMERMAN J J，D’ALLARE S，等.猪病学[M].赵德明， 张仲秋， 沈建忠， 译.北京：中国农业大学出版社， 2008：423-445.
[2] BARBARA G K，RALF N，THOMAS C M.Pseudorabies Virus Glycoprotein M Inhibits Membrane Fusion[J].J Virol， 2000， 74（15）：6760-6768.
[3] METTENLEITER T C.PRV：the virus and molecular Pathogenesis[J].Vet Res， 2000，31：99-115.
[4] 占松鹤，殷冬冬，姜安安，等.猪伪狂犬病毒安徽株gE 基因的克隆和序列分析[J].中国动物传染病学报，2013，21（5）：63-67.
[5] 陆芹章，覃广胜，黄伟坚，等.伪狂犬病病毒广西B、W株gE基因的扩增、克隆及序列分析[J].畜牧兽医学报，2005，36（10）：1106-1110.
[6] 郭小参，高晓云，陈红英，等，猪伪狂犬病毒原阳株 gE全基因的克隆与序列分析[J].国外畜牧学-猪与禽，2014，34（2）：58-60.
[7] 童武，张青占，郑浩，等.免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J].中国动物传染病学报，2013，21（3）：1-7.
关键词 猪伪狂犬病毒；gE基因；PCR扩增；克隆；序列分析
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）25-08502-02
Abstract [Objective] Based on cloning and sequencing of Hubei strain gE gene of porcine pseudorabies virus isolated from a pig farms in Hubei Province， their genetic variation was analyzed. [Method]A pairs of primers were designed and the sequence of gE gene of pseudorabies virus in the reference GenBank，PCR amplification and sequence analysis of PRV Hubei strain gE gene was done，and the PCR product was cloned into pMD 18T vector.By restriction enzyme analysis and sequencing of recombinant plasmid， homology analysis and comparison with the other regions included in GenBank standard reference strains at home and abroad.[Result]The results showed that with the standard reference strains， the nucleotide sequence homology of 95.0%-98.0%， phylogenetic tree analysis showed that，PRVHBXS2014 strain and Jiaozuo EU561349China in Henan strain belonged to the same branch， close relationship，but there are some gene mutation，and the results were consistent with the reported in the literature.[Conclusion] The study provided a reference for effective prevention and control of the disease.
Key words Porcine pseudorabies virus；gE gene；PCR amplification；Cloning；Sequence analysis
伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病毒（PRV）引起的多种家畜和野生动物均可感染的急性传染病，以发热、流产、死产、奇痒（猪除外）和脑脊髓炎为主要症状，其中对猪的危害最大，且猪是唯一的自然宿主[1]。
PRV属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科，为双链DNA，全长约150 kb，基因组GC含量最高达73%，包括70多个开放性阅读框，可以编码70～100种病毒蛋白。gE基因对PRV体内毒力表达、侵袭神经和沿着神经传递起着决定性的作用。目前gE缺失疫苗在病毒侵入神经系统方面被认为比其他单个非必需糖蛋白缺失苗更安全，同时gE不会影响病毒的复制和中和抗体的产生，且gE是所有野毒株均表达的一类糖蛋白。因此gE可作为PR净化过程中标志基因，可区别感染动物和接种动物，以剔除阳性的野毒感染动物[2-3]。
2012年以来，我国许多省市暴发临床症状疑似伪狂犬病的传染病，尤其一些免疫过gE缺失疫苗的猪场也暴发该病，主要表现为猪群gE抗体阳性率显著升高，母猪产弱仔、死胎，仔猪出现神经症状及死亡等，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。笔者通过对从湖北省某猪场分离获得的伪狂犬病毒的gE基因继续克隆和测序，分析其遗传变化规律，为有效防控该病提供参考。
1 材料与方法
1.1 病毒与细胞 伪狂犬湖北株PRVHBXS2014株（武汉大学菌种库保藏号：CCTCC V201420），BHK21细胞与大肠杆菌DH5α均为湖北省农业科学研究院动物胚胎工程分子育种湖北省重点实验室冻存。
1.2 主要试剂 细胞培养基MEM和无菌小牛血清购自GIBCO公司；2×EasyTaq PCRMix购自全式金生物技术有限公司；限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ、pMD 18T载体及其连接试剂、DL2000 Marker购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖购自北京鼎国生物技术有限公司；胶回收试剂盒和DNA小提试剂盒购自爱思进生物技术有限公司。
1.3 病毒培养 将伪狂犬毒株用BHK21细胞培养，培养液为含10%小牛血清的MEM培养液，维持液为含2%小牛血清的MEN培养液。待细胞长至90%以上时加入适量病毒液，37 ℃吸附1 h，加入适量维持液，37 ℃培养，在细胞病变达到80%以上时停止培养，反复冻融3次后收获病毒培养液。 1.4 引物的设计与合成 参考GenBank中已报道的猪伪狂犬病毒gE基因序列设计，上游引物P1：5’GCGGCCCTTTCTGCTGCG3’；下游引物P2：5’AGCGGGGCAGGACATCAA3’。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.5 DNA的提取 采用爱思进生物技术有限公司DNA小提试剂盒提取并于-20 ℃保存。
1.6 PCR扩增 PCR反应体系体积为50 μl，其中10 μmol/L上下引物各1 μl，DNA 模板5 μl，2×EasyTaq PCRMix 25 μl，剩下添加ddH2O至50 μl。反应程序：97 ℃ 10 min，72 ℃ 4 min；95 ℃ 1 min，65 ℃退火 2 min，72 ℃ 2.5 min，34个循环；72 ℃ 10 min。
1.7 PCR产物克隆和测序 PCR产物的克隆与鉴定连接反应体系为10 μl，依次加入PCR产物5 μl、pMD18T载体1 μl、连接缓冲液4 μl，16 ℃连接4 h。取5 μl连接产物转化至制备好的DH5α感受态细胞，涂于含氨苄青霉素的LB平板，37 ℃培养 12～16 h。从平板上挑取单菌落接种于3 ml含氨苄青霉素的LB培养液，37 ℃振荡培养16～20 h。提取质粒，用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切质粒后电泳，按分子量大小初步筛选阳性菌株，鉴定阳性重组质粒。将酶切鉴定为阳性的重组质粒送到上海生工生物工程有限公司测序，然后利用基因分析软件DNAStar对测序结果进行分析比较。
2 结果与分析
2.1 gE基因的PCR扩增 以伪狂犬病毒湖北株DNA为模板，进行PCR扩增后得到1 626 bp的片段，与预期相符（图1）。
2.2 重组质粒的酶切鉴定
提取重组质粒后选用限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，获得2条大小为2 692和1 626 bp左右的片段，分别与预期基因片段大小相符（图2）。
2.3 gE基因的序列测定及其分析 利用DNAStar软件将测出的HBXS2014gE基因全序列（图3）与国内外报道的PRV分离株（AY183124、湖北Ea株AF171937、广东SH株EF552427、AF207700、美国Becker株AY368490、FJ605135、JF460026、JX417716、Fa株AF403049、河南焦作株EU561349China、Malaysia株FJ176390、GZZ1株HQ832846、西班牙NiA3株EU502923、Rice株M14336、MINA株AY170318）进行核苷酸同源性比较分析。
3 讨论
近年来，猪伪狂犬病席卷全国大部分省份，临床病例呈逐渐上升趋势。目前表现为临床症状不明显，仔猪少见神经症状，母猪主要表现为流产和死胎，发病出现急性死亡，犬猫大量死亡；免疫不同厂家不同毒株疫苗依然发病；临床抗体检测免疫效果好的猪场依然发病；猪伪狂犬病毒野毒的感染率在70%～80%。目前已给我国养猪业造成了巨大的经济损失。
该研究通过PCR技术成功克隆出了PRVHBXS2014株的gE基因，序列全长为1 626 bp，通过与国内外已公布序列对比发现，该毒株与EU561349China株同源性最高，同属于一个分支，通过核苷酸序列对比发现存在一定的基因突变现象。
参考文献
[1] STRAW B E，ZIMERMAN J J，D’ALLARE S，等.猪病学[M].赵德明， 张仲秋， 沈建忠， 译.北京：中国农业大学出版社， 2008：423-445.
[2] BARBARA G K，RALF N，THOMAS C M.Pseudorabies Virus Glycoprotein M Inhibits Membrane Fusion[J].J Virol， 2000， 74（15）：6760-6768.
[3] METTENLEITER T C.PRV：the virus and molecular Pathogenesis[J].Vet Res， 2000，31：99-115.
[4] 占松鹤，殷冬冬，姜安安，等.猪伪狂犬病毒安徽株gE 基因的克隆和序列分析[J].中国动物传染病学报，2013，21（5）：63-67.
[5] 陆芹章，覃广胜，黄伟坚，等.伪狂犬病病毒广西B、W株gE基因的扩增、克隆及序列分析[J].畜牧兽医学报，2005，36（10）：1106-1110.
[6] 郭小参，高晓云，陈红英，等，猪伪狂犬病毒原阳株 gE全基因的克隆与序列分析[J].国外畜牧学-猪与禽，2014，34（2）：58-60.
[7] 童武，张青占，郑浩，等.免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J].中国动物传染病学报，2013，21（3）：1-7.