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【摘要】目的 分析云南省遗传性耳聋分子基础。方法 分析48例GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA直接测序法的异常结果。结果 GJB2基因发现4个突变位点，包括：79G>A、341A>G、109G>A和235delC，12sRNA发现三个突变位点，即：1382 A>C、1438A>G、1555A>G，SLC26A4和GJB3基因均未见突变； 突变频率最高的突变位点是GJB2 79G>A和12sRNA 1438 A>G，其次是GJB2 341A>G。结论 GJB2和12sRNA基因可能是云南省最常见的致聋基因，两个基因的热点突变与国内其它地方报道的有差异。
【关键词】遗传性耳聋；测序； GJB2； SLC26A4； GJB3； 12srRNA
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2016）01-0012-03
耳聋是人类常见的遗传病之一，每1000个儿童里 1.3-2.3名儿童受耳聋困扰，超过50%的儿童期耳聋为遗传性耳聋，在遗传性耳聋中70%以上为非综合征耳聋[1]。研究表明中国人的大部分非综合征性耳聋由几个主要基因的突变引起[2]， 如GJB2、SLC26A4、12srRNA，在此基础上商业公司开发出了高通量的基因芯片法检测。然而耳聋基因突变有一定的地域和种群差异，云南是中国少数民族最多的省份，有关耳聋基因突变的分子生物学研究报道较少，我们利用直接测序法筛选中国人常见的4个耳聋候选基因GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA对48例儿童非综合性耳聋做了分析。
一、资料与方法
1.1.病例资料
48例听力受损儿童均来自云南省内各医院耳鼻咽喉科门诊病例，其中汉族16例，回族9，彝族8例，白族8例，纳西族4，傣族1例，其它2例，年龄1-14岁，平均年龄5.3岁，男8例，女9例。所有病例通过病史调查（包括家族史、耳聋史及耳毒性药物的使用情况等）和听力学检测证实为非综合性耳聋。听力损失程度根据纯听力图，分别计算双耳气导0.5KHz、1 KHz、2 KHz、4 KHz处的平均听阈，按WH O 标准进行分类： 听力正常：≤25dBHL；轻度听力损失： 26～40 dBHL；中度听力损失： 41～70 dBHL； 重度听力损失： 71 ～90 dBHL；极重度听力损失： >90 dBHL。所有患者家长均签署知情同意。
1.2.研究方法
1.2.1.试剂与仪器
血液基因组DNA提取试剂盒及2*pcr-mix均购自Tiangen公司，测序试剂Bigdye3.1为美国AB公司产品，定性PCR仪为BIO-RAD C1000 型； 凝胶扫描仪为UVP EC3Imaging System； 电泳仪为Bio-Rad产品；遗传分析仪AB3500型。
1.2.2.利用primer5.0和oligo7.0设计引物，引物信息见表1，引物经上海生工合，Page纯化。
1.2.3.标本采集与基因组DNA提取
采集静脉全血3ml，EDTA-K2抗凝，所有血样用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，保存于-20℃备用。
1.2.4.PCR扩增
PCR反应体系为：PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2 2.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.75 μL，10pmol/μL引物各0.8μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板2 μL，加水至25 μL；PCR扩增条件：94 ℃ 2 min；94℃20 s，57℃ 20 s，72℃ 30 s，35 个循环；72℃ 5 min；4℃保存。
1.2.5.DNA测序
PCR 产物4μL 在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，紫外观察为清晰明亮的目的扩增条带（无杂带），扩增片段用上、下游引物正反向分别测序。
二、研究结果
2.1测序结果突变类型
GJB2基因发现4个突变位点，包括：79G>A、341A>G、109G>A；12sRNA发现三个突变位点，即：1382 A>C、1438A>G、1555A>G，见图1-5。SLC26A4和GJB3基因均未发现突变。
2.2. 突变基因型、临床表型及突变频率
48例测序发现最常见的突变12sRNA 1438 A>G，和GJB2基因79G>A，其突变频率都达25.68%，其次是GJB2 341A>G，突变频率为18.92%，发现1例GJB2 79G>A、341A>G和12sRNA 1438 A>G复合突变，见表2，3。
三、讨论
随着人类基因组计划的实施和完成，耳聋致病基因的发现和克隆也取得了很大的进展，遗传性耳聋的致病基因及同一基因的突变位点在不同种族，甚至同一种族不同地区的人群中不尽相同，有很强的种族特异性。全国性耳聋分子流行病学调查显示我国感音神经性聋患者由几个主要基因主几热点突变引起，包括：GJB2基因（35delG、176del16、235delC、299delAT）、SLC26A4基因（2168A>G 、 IVS7-2A>G）、GJB3 基因（538C>T）以及12sRNA（1494C>T、1555A>G）等。我们设计合成的5对引物其PCR扩增片段包含了以上4个基因的热点突变位点。GJB2 基因是最常见的致聋基因，高达21. 01%的耳聋患者携带该基因突变；其次是大前庭水管综合征的责任基因SLC26A4 ，其在耳聋人群中的检出率占15% 以上；另外，對氨基糖苷类抗生素异常敏感而至聋的12sRNA 1555A>G 和1494C>T检出率分别3. 43% 和1. 03%。本文48例耳聋基因测序结果异常但临床表型正常的有4例，为先证者的兄弟（或姐妹），实际临床患有耳聋为42例，GJB2基因检出率为69.05%（29/42）；12sRNA检测出率为52.38%（12/22）。这和全国的调查结果有差异，这可能和云南特有民族结构的分布有关，也有可能本文收集病例数较少，有些病例是同一个家系内的样本有关。
本文检出的GJB2 79G>A和341 A>G导致编码的第27 位和114位分别从缬氨酸突变为异亮氨酸和谷氨酸转变为甘氨酸，尽管有6例GJB2 79G>A和341 A>G临床表现为正常，但它和其它耳聋基因突变组成复合突变时临床表现中度或轻度听力损失，表明携带GJB2 79G>A和341 A>G突变对遗传性非综合征性耳聋的发生具有密切的相关性，对于非综合征性耳聋发病有较高风险，这与文献报道一致。
本文发现的GJB2 109G>A，12sRNA 1382A>C国内文献报道不明。GJB2 109G>A为突变杂合子，导致第37位缬氨酸突变为异亮氨酸，临床上表现中度听力损失，提示该位点突变为该病例的关键因素，可能是云南民族耳聋致病基因特有的突变位点，其致病机制需要更进一步研究。12sRNA 1382A>C检出2例突变，其中1例与12sRNA 1555A>G组合成复合突变，临床上表现重度耳聋，2例均有氨基糖苷类抗生素用药史，提示该位点亦是导致药物性耳聋的作用靶点。
参考文献：
[1] H V Toriello， W Reardon， R J Gorlin. Hereditary hearing loss and its syndromes[M]. Oxford University Press，2004. 67-69.
[2]戴朴，刘于飞，等。18 个省市聋校学生非综合征性聋病分子流行病学研究-GJB2 235delC 和线粒体DNA 12SrRNA A1555G 突变筛查报告[J]。中华耳科学杂志，2006，1（4）：1-5。
[3]李琦，戴朴，黄德亮，等。SLC26A4 基因IVS7-2A>G 突变在中国不同地区和民族重度感音性聋患者中分布频率的观察[J]. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007，42（12）：893-897.
[4] Reardon W. Genetic Deafness. J Med Genet. 1992， 29：521-526
【关键词】遗传性耳聋；测序； GJB2； SLC26A4； GJB3； 12srRNA
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2016）01-0012-03
耳聋是人类常见的遗传病之一，每1000个儿童里 1.3-2.3名儿童受耳聋困扰，超过50%的儿童期耳聋为遗传性耳聋，在遗传性耳聋中70%以上为非综合征耳聋[1]。研究表明中国人的大部分非综合征性耳聋由几个主要基因的突变引起[2]， 如GJB2、SLC26A4、12srRNA，在此基础上商业公司开发出了高通量的基因芯片法检测。然而耳聋基因突变有一定的地域和种群差异，云南是中国少数民族最多的省份，有关耳聋基因突变的分子生物学研究报道较少，我们利用直接测序法筛选中国人常见的4个耳聋候选基因GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA对48例儿童非综合性耳聋做了分析。
一、资料与方法
1.1.病例资料
48例听力受损儿童均来自云南省内各医院耳鼻咽喉科门诊病例，其中汉族16例，回族9，彝族8例，白族8例，纳西族4，傣族1例，其它2例，年龄1-14岁，平均年龄5.3岁，男8例，女9例。所有病例通过病史调查（包括家族史、耳聋史及耳毒性药物的使用情况等）和听力学检测证实为非综合性耳聋。听力损失程度根据纯听力图，分别计算双耳气导0.5KHz、1 KHz、2 KHz、4 KHz处的平均听阈，按WH O 标准进行分类： 听力正常：≤25dBHL；轻度听力损失： 26～40 dBHL；中度听力损失： 41～70 dBHL； 重度听力损失： 71 ～90 dBHL；极重度听力损失： >90 dBHL。所有患者家长均签署知情同意。
1.2.研究方法
1.2.1.试剂与仪器
血液基因组DNA提取试剂盒及2*pcr-mix均购自Tiangen公司，测序试剂Bigdye3.1为美国AB公司产品，定性PCR仪为BIO-RAD C1000 型； 凝胶扫描仪为UVP EC3Imaging System； 电泳仪为Bio-Rad产品；遗传分析仪AB3500型。
1.2.2.利用primer5.0和oligo7.0设计引物，引物信息见表1，引物经上海生工合，Page纯化。
1.2.3.标本采集与基因组DNA提取
采集静脉全血3ml，EDTA-K2抗凝，所有血样用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，保存于-20℃备用。
1.2.4.PCR扩增
PCR反应体系为：PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2 2.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.75 μL，10pmol/μL引物各0.8μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板2 μL，加水至25 μL；PCR扩增条件：94 ℃ 2 min；94℃20 s，57℃ 20 s，72℃ 30 s，35 个循环；72℃ 5 min；4℃保存。
1.2.5.DNA测序
PCR 产物4μL 在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，紫外观察为清晰明亮的目的扩增条带（无杂带），扩增片段用上、下游引物正反向分别测序。
二、研究结果
2.1测序结果突变类型
GJB2基因发现4个突变位点，包括：79G>A、341A>G、109G>A；12sRNA发现三个突变位点，即：1382 A>C、1438A>G、1555A>G，见图1-5。SLC26A4和GJB3基因均未发现突变。
2.2. 突变基因型、临床表型及突变频率
48例测序发现最常见的突变12sRNA 1438 A>G，和GJB2基因79G>A，其突变频率都达25.68%，其次是GJB2 341A>G，突变频率为18.92%，发现1例GJB2 79G>A、341A>G和12sRNA 1438 A>G复合突变，见表2，3。
三、讨论
随着人类基因组计划的实施和完成，耳聋致病基因的发现和克隆也取得了很大的进展，遗传性耳聋的致病基因及同一基因的突变位点在不同种族，甚至同一种族不同地区的人群中不尽相同，有很强的种族特异性。全国性耳聋分子流行病学调查显示我国感音神经性聋患者由几个主要基因主几热点突变引起，包括：GJB2基因（35delG、176del16、235delC、299delAT）、SLC26A4基因（2168A>G 、 IVS7-2A>G）、GJB3 基因（538C>T）以及12sRNA（1494C>T、1555A>G）等。我们设计合成的5对引物其PCR扩增片段包含了以上4个基因的热点突变位点。GJB2 基因是最常见的致聋基因，高达21. 01%的耳聋患者携带该基因突变；其次是大前庭水管综合征的责任基因SLC26A4 ，其在耳聋人群中的检出率占15% 以上；另外，對氨基糖苷类抗生素异常敏感而至聋的12sRNA 1555A>G 和1494C>T检出率分别3. 43% 和1. 03%。本文48例耳聋基因测序结果异常但临床表型正常的有4例，为先证者的兄弟（或姐妹），实际临床患有耳聋为42例，GJB2基因检出率为69.05%（29/42）；12sRNA检测出率为52.38%（12/22）。这和全国的调查结果有差异，这可能和云南特有民族结构的分布有关，也有可能本文收集病例数较少，有些病例是同一个家系内的样本有关。
本文检出的GJB2 79G>A和341 A>G导致编码的第27 位和114位分别从缬氨酸突变为异亮氨酸和谷氨酸转变为甘氨酸，尽管有6例GJB2 79G>A和341 A>G临床表现为正常，但它和其它耳聋基因突变组成复合突变时临床表现中度或轻度听力损失，表明携带GJB2 79G>A和341 A>G突变对遗传性非综合征性耳聋的发生具有密切的相关性，对于非综合征性耳聋发病有较高风险，这与文献报道一致。
本文发现的GJB2 109G>A，12sRNA 1382A>C国内文献报道不明。GJB2 109G>A为突变杂合子，导致第37位缬氨酸突变为异亮氨酸，临床上表现中度听力损失，提示该位点突变为该病例的关键因素，可能是云南民族耳聋致病基因特有的突变位点，其致病机制需要更进一步研究。12sRNA 1382A>C检出2例突变，其中1例与12sRNA 1555A>G组合成复合突变，临床上表现重度耳聋，2例均有氨基糖苷类抗生素用药史，提示该位点亦是导致药物性耳聋的作用靶点。
参考文献：
[1] H V Toriello， W Reardon， R J Gorlin. Hereditary hearing loss and its syndromes[M]. Oxford University Press，2004. 67-69.
[2]戴朴，刘于飞，等。18 个省市聋校学生非综合征性聋病分子流行病学研究-GJB2 235delC 和线粒体DNA 12SrRNA A1555G 突变筛查报告[J]。中华耳科学杂志，2006，1（4）：1-5。
[3]李琦，戴朴，黄德亮，等。SLC26A4 基因IVS7-2A>G 突变在中国不同地区和民族重度感音性聋患者中分布频率的观察[J]. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007，42（12）：893-897.
[4] Reardon W. Genetic Deafness. J Med Genet. 1992， 29：521-526