视网膜新生血管(RNV)是目前世界范围内主要的致盲原因之一,而目前的治疗效果并不理想,因此需要寻找在疾病状态下异常表达的蛋白质标志物,为新生血管性视网膜疾病的治疗提供新的靶点。
目的观察氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型中视网膜血管的形态学特征,筛选并验证差异性表达的蛋白质分子。
方法选取7日龄健康清洁级C57BL/6J幼鼠44只,分为OIR组和正常对照组。OIR组幼鼠先在氧体积分数为(75±2)%的环境下饲养5 d,然后在正常空气环境中饲养5 d,而正常对照组幼鼠仅在正常空气环境下饲养10 d。取17日龄幼鼠经球后静脉注射高分子量异硫氰酸葡聚糖(FITC-dextran),然后制备视网膜铺片,观察视网膜血管的形态并统计视网膜无灌注区相对面积;取各组小鼠眼球行石蜡切片和苏木精-伊红染色,计数突破内界膜的血管内皮细胞核数;采用蛋白芯片法检测蛋白质分子在OIR组和正常对照组小鼠眼球中的差异性表达,并用Western blot法和ELISA法对差异表达蛋白进行验证。
结果视网膜铺片结果显示,OIR组小鼠视网膜周边血管紊乱,静脉血管迂曲,视网膜中央有明显的无灌注区,在视网膜灌注区和无灌注区的交界处有大量新生血管芽,而正常对照组视网膜血管细密,静脉平滑,分布均匀整齐。OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积为(25.53±2.16)%,较正常组无灌注区的相对面积(0.66±0.36)%明显增加,差异有统计学意义(t=-27.61,P<0.01)。石蜡切片苏木精-伊红染色结果表明,OIR组小鼠视网膜平均每张切片突入玻璃体腔的血管内皮细胞核数为(28.41±3.97)/切片,而正常组为(0.16±0.31)/切片,两组间比较差异有统计学意义(t=-54.42,P<0.001)。蛋白芯片检测结果显示,在检测的62个与新生血管和炎症相关的细胞因子中,表达变化达1.5倍以上者10个,包括3个上调因子和7个下调因子;表达变化达2倍以上的细胞因子4个,包括3个下调因子和1个上调因子。对表达差异最显著的6个细胞因子(上调、下调各3个)进行Western blot和ELISA验证,结果表明血小板因子4(PF-4)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、P-选择素(SELP)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)、可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNF-RⅡ)以及趋化因子半胱氨酸-X-半胱氨酸基元配体16(CXCL16)的表达与蛋白芯片检测的表达趋势一致,其中PF-4、SELP和VEGF-A在OIR眼球中表达显著上调,CXCL16、sTNF-RⅡ和VCAM-1在OIR眼球中的表达显著下调,差异均有统计学意义(均P<0.05)。
结论本研究成功建立OIR小鼠模型。细胞因子PF-4、SELP、VEGF-A、CXCL16、sTNF-RⅡ和VCAM-1在OIR模型和正常对照小鼠的眼球组织中的表达存在显著差异,提示OIR状态下血小板系统处于激活状态,而促炎因子表达下调。PF-4可能成为针对RNV的VEGF非依赖型治疗策略的新靶点。