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[摘要] 目的 探讨环介导等温扩增技术用于检测临床标本乳头瘤病毒HPV18亚型的应用价值。 方法 设计针对HPV18-L1 基因序列中6个区段的4条特异引物，在等温条件下（65℃）进行核酸扩增反应1h，在扩增前加入钙黄绿素作为反应指示剂；利用建立的环介导等温扩增方法进行敏感型检测以及检测正常体检妇女和患者子宫颈分泌物的HPV18亚型。 结果 LAMP检测HPV18 L1基因的敏感度为1000拷贝每微升；阴道炎患者HPV18阳性检出率为5.26%（1/19）；慢性子宫颈炎组HPV18亚型检出率为10%（2/20）；宫颈上皮内瘤变（CINⅠ ～Ⅱ级）阳性检出率33.3%（3/9）；子宫颈癌Ⅰ级阳性检出率为64%（16/25）。 结论 基于目视的环介导等温扩增方法是一种具有经济、快速筛查临床标本中HPV18亚型的诊断工具，可具有在基层医院推广应用的潜能。
[关键词] 人乳头瘤病毒；核酸；环介导等温扩增试验
[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）18-09-03
在妇科恶性肿瘤中，子宫颈癌是仅次于乳腺癌的威胁妇女健康的第二杀手。全球每年大约有47万妇女罹患宫颈癌[1]。HPV病毒几乎在所有子宫颈癌病例中都存在，是引发子宫颈癌的元凶[2]。临床上用于检测HPV的方法包括免疫组化、原位杂交、斑点杂交、核酸印迹和PCR等，PCR检测以基因扩增为基础，灵敏度高，是目前进行HPV基因检测及分型的最好方法[3]，但该技术对实验条件和操作技术要求较高，需要专门的PCR仪器和实验场地，因此不利于在基层医院推广。环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等于2000年研发的一种新颖的恒温核酸扩增方法[4]。这种方法应用针对6～8个靶序列的4～6条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA
聚合酶（Bst）在等温条件下（60～65℃左右）保温1～2h，即可实现核酸的大量扩增，从而保证LAMP技术的特异性，通过肉眼观察扩增产物颜色的变化即可判断样本中是否存在特异性DNA扩增片段。因其敏感、快速、不需特殊仪器设备的优点，LAMP方法已经广泛用于病原体的核酸检测[5-7]。据报道HPV18相关宫颈癌早期诊断率低，感染HPV18相关的宫颈癌癌前病变进程更快，HPV18也是宫颈癌再发的独立危险因素[8]。HPV16或HPV18的女性，其病程发展至宫颈癌前病变的风险远高于未感染者[9]，HPV晚期基因L1编码的病毒主要衣壳蛋白L1是病毒的重要抗原，故本研究拟以HPV18的L1基因为靶基因，建立环介导等温扩增方法，旨在探素可在基层医院操作的核酸筛查方法，从而可以帮助基层医院临床医师更好地找到HPV感染者，判断她们患癌的近期和远期风险，及时发现早期病变，尽早治疗，预防宫颈癌的发生。
1 资料与方法
1.1 一般资料
将2008年5月～2013年5月我院就诊及手术的患者，标本为专用宫颈刷收集的宫颈分泌物，所有病例均经病理证实。实验观察组73例，其中阴道炎患者组19例，慢性宫颈炎组20例，子宫颈上皮内瘤样病变（cIN）I～Ⅱ级9例，子宫颈癌Ⅰ期25例，患者年龄28～72岁，平均47.8岁。对照组60例，年龄25～70岁，平均41.5岁。
1.2 HPV18检测方法
1.2.1 环介导等温扩增实验 取待检妇女的子宫颈涂片，一部分用作经典HPV细菌学检查，另一部分采用QIAamp DNA Kit提取刮片组织DNA，进行核酸扩增实验。分别将HPV病毒DNA、待测样本DNA、去离子水加入到0.2mL无菌微量离心管，按照设计分别依次加入既定浓度的BstDNA聚合酶 （8U）、DNTPS （1.4mmol/L）、Betaine （1.0mol/L）、MgSO4 （6.0mmol/L）、引物对（FIP和BIP各1.6μmol/L，F3和B3各0.2μmol/L）以及钙黄绿素显色剂（1μL），混匀反应体系后将反应管置于65℃水浴孵育60min，肉眼观察各反应管颜色变化，显色后管内溶液颜色变为绿色为阳性，棕色为阴性。
1.2.2 HPV18 -L1基因的LAMP扩增引物 F3： CCTAAGAAACGTAAACGTGTT； B3： CAGGAACCCTAAAATATGGATT； FIP：AGGAGGTGGAAGATATACGGTATTCCCTATTTTTTTGCAGATGGC； BIP：GGCAAGAGTTGTAAATACCGATGACCAACAGTTAATAATCTAGAGCT。
2 结果
2.1 环介导等温扩增技术检测HPV18的敏感性
纯化和定量后的含HPV18 L1基因的质粒进行系列稀释为106、105、104、103、500和100拷贝/μL，LAMP检测HPV18 L1基因的敏感度为1000拷贝每微升，见图1。
2.2 环介导等温扩增技术检测临床标本的效果
本研究采用环介导等温扩增技术检测60例正常体检妇女和患者人群宫颈刮片中HPV18感染情况，正常对照组60例，HPV18阳性为0；实验组中，阴道炎患者19例，HPV18阳性1例，阳性率为5.26%；慢性子宫颈炎组20例，HPVl8阳性2例，阳性率为10%；CIN I级5例中感染1例，CINⅡ级4例中感染2例，宫颈上皮内瘤变阳性检出率33.3%；阳性率子宫颈癌I级25例感染16例，阳性检出率为64%，随着病情加重，HPV18感染率增高，各组间差异有统计学意义（P<0.05），图2A、2B、2C反应了LAMP检测各组样本的显色图，反应管内棕黄色表示阴性，绿色表示阳性。
A：阴道炎患者和子宫颈炎患者样本。1～4：部分子宫颈炎患者标本，2、3阳性显色，1、4 阴性反应；5～8：部分阴道炎患者标本，6阳性显色，5、7、8 阴性反应；B：部分宫颈上皮内瘤变患者样本。1、2阳性显色，3～8，阴性反应；C： 阳性率子宫颈癌患者样本。1、2、5阳性显色，3、4、8阴性反应，6、阳性对照，8、阴性对照 3 讨论
流行病学调查发现，与高级别宫颈癌相比，早期宫颈癌和宫颈上皮内瘤变预后相对较好。因此， 在病原学因素方面找到可以早期快速诊断、有效治疗宫颈癌的方法至关重要并且切实可行。目前通过宫颈细胞涂片来筛查宫颈腺癌的方法有一定局限性， 容易漏诊和误诊，灵敏性及特异性均不高。LAMP方法是近年来兴起的一种快速检测核酸的分子生物学方法，其反应特异性显著高于常规PCR。芦春斌等[10]建立了基于颜色判定的环介导等温扩增方法检测HPV6和HPV16，提示利用该技术可以早期检测HPVDNA。我们利用该技术对60例健康体检妇女和73例不同妇科疾患人群进行HPV18检测，结果显示正常对照组中未检出HPV18感染；而在阴道炎、子宫颈炎等妇科炎症中检出了HPV18感染，随着病情加重，宫颈上皮内瘤变和子宫颈癌变标本中HPVl8检出阳性率增高。由此可见，对HPVl8 DNA 早期检测为更好地判断病变性质、发展趋势以及进一步的治疗和预防提供了重要依据。
目前妇女HPV感染及其混合感染率增高亚临床和潜伏型HPV感染，因缺乏形态学变化临床上迫切需要使用高敏感的DNA检测方法。我们在国内外相关研究基础上发展了LAMP法对临床标本HPV18的DNA检测，LAMP法在试验条件下能检测出1000拷贝的HPV18 DNA，且对于宫颈病变的临床标本能较为敏感的检测出HPV18，LAMP法在反应体系中加入了显色剂，结果可以通过目视即可以鉴定（绿色可判定为阳性，阴性呈棕黄色反应），检测时间60min，与常规的PCR方法相比，因此LAMP更为简便迅速、易于操作。我们将进一步利用建立的目视LAMP法检测更多临床样本，为完善基于目视LAMP法用于HPV病毒的检测在基层医院的推广应用鉴定坚实的实验依据。
[参考文献]
[1] zurHausen H.Papillomavinlses causing cancer：evasion from host-cell control in early events in carcinogenesis[J].J Nad Cancer Inst，2000，92（9）：690-698.
[2] Sankaranarayanan R，Nene BM，Shastri SS，et al.HPV screening for cervical cancer in Rural India [J]. N Engl J Med，2009，360（14）：1385-1394.
[3] Takacs T，Jeney C，Kovacs L，et al. Molecular beacon-based real-time PCR method for detection of 15 high risk and 5 low- risk HPV types[J]. J Virol Methods，2008，149（1）：153-162.
[4] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Res，2000，28（2）：e63.
[5] Fan H，Long B，Wu X，et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Cronobacter sakazaki[J].Virol J，2012，9（12）：321.
[6] Tsai MA，Wang PC，Yoshida T，et al. Development of a sensitive and specific LAMP PCR assay for detection of fish pathogen Lactococcus garvieae[J].Dis Aquat Organ，2013，102（3）：225-235.
[7] Bühlmann A，Pothier JF，Rezzonico F，et al. Erwinia amylovora loop-mediated isothermal amplification （LAMP） assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight[J].J Microbiol Methods，2013，92（3）：332-339.
[8] 郑曙民，陈星籍，海红，等.子宫颈癌患者人乳头瘤病毒16、18检测[J].肿瘤研究与临床，2008，20（1）：48-49.
[9] Parviz M，Mohammad R，Bahram K，et al. Detection of human papillomavirus type 16 and 18 in pathologic samples from patients with cervical cancer by PCR and RFLP methods [J].DARU，2006，14（2）：78-81.
[10] 芦春斌，罗乐，杨梦婕，等.基于颜色判定的环介导等温扩增技术检测HPV6 和HPV16[J].病毒学报，2011，27（1）： 64-69.
（收稿日期：2013-08-03）
[关键词] 人乳头瘤病毒；核酸；环介导等温扩增试验
[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）18-09-03
在妇科恶性肿瘤中，子宫颈癌是仅次于乳腺癌的威胁妇女健康的第二杀手。全球每年大约有47万妇女罹患宫颈癌[1]。HPV病毒几乎在所有子宫颈癌病例中都存在，是引发子宫颈癌的元凶[2]。临床上用于检测HPV的方法包括免疫组化、原位杂交、斑点杂交、核酸印迹和PCR等，PCR检测以基因扩增为基础，灵敏度高，是目前进行HPV基因检测及分型的最好方法[3]，但该技术对实验条件和操作技术要求较高，需要专门的PCR仪器和实验场地，因此不利于在基层医院推广。环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等于2000年研发的一种新颖的恒温核酸扩增方法[4]。这种方法应用针对6～8个靶序列的4～6条特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA
聚合酶（Bst）在等温条件下（60～65℃左右）保温1～2h，即可实现核酸的大量扩增，从而保证LAMP技术的特异性，通过肉眼观察扩增产物颜色的变化即可判断样本中是否存在特异性DNA扩增片段。因其敏感、快速、不需特殊仪器设备的优点，LAMP方法已经广泛用于病原体的核酸检测[5-7]。据报道HPV18相关宫颈癌早期诊断率低，感染HPV18相关的宫颈癌癌前病变进程更快，HPV18也是宫颈癌再发的独立危险因素[8]。HPV16或HPV18的女性，其病程发展至宫颈癌前病变的风险远高于未感染者[9]，HPV晚期基因L1编码的病毒主要衣壳蛋白L1是病毒的重要抗原，故本研究拟以HPV18的L1基因为靶基因，建立环介导等温扩增方法，旨在探素可在基层医院操作的核酸筛查方法，从而可以帮助基层医院临床医师更好地找到HPV感染者，判断她们患癌的近期和远期风险，及时发现早期病变，尽早治疗，预防宫颈癌的发生。
1 资料与方法
1.1 一般资料
将2008年5月～2013年5月我院就诊及手术的患者，标本为专用宫颈刷收集的宫颈分泌物，所有病例均经病理证实。实验观察组73例，其中阴道炎患者组19例，慢性宫颈炎组20例，子宫颈上皮内瘤样病变（cIN）I～Ⅱ级9例，子宫颈癌Ⅰ期25例，患者年龄28～72岁，平均47.8岁。对照组60例，年龄25～70岁，平均41.5岁。
1.2 HPV18检测方法
1.2.1 环介导等温扩增实验 取待检妇女的子宫颈涂片，一部分用作经典HPV细菌学检查，另一部分采用QIAamp DNA Kit提取刮片组织DNA，进行核酸扩增实验。分别将HPV病毒DNA、待测样本DNA、去离子水加入到0.2mL无菌微量离心管，按照设计分别依次加入既定浓度的BstDNA聚合酶 （8U）、DNTPS （1.4mmol/L）、Betaine （1.0mol/L）、MgSO4 （6.0mmol/L）、引物对（FIP和BIP各1.6μmol/L，F3和B3各0.2μmol/L）以及钙黄绿素显色剂（1μL），混匀反应体系后将反应管置于65℃水浴孵育60min，肉眼观察各反应管颜色变化，显色后管内溶液颜色变为绿色为阳性，棕色为阴性。
1.2.2 HPV18 -L1基因的LAMP扩增引物 F3： CCTAAGAAACGTAAACGTGTT； B3： CAGGAACCCTAAAATATGGATT； FIP：AGGAGGTGGAAGATATACGGTATTCCCTATTTTTTTGCAGATGGC； BIP：GGCAAGAGTTGTAAATACCGATGACCAACAGTTAATAATCTAGAGCT。
2 结果
2.1 环介导等温扩增技术检测HPV18的敏感性
纯化和定量后的含HPV18 L1基因的质粒进行系列稀释为106、105、104、103、500和100拷贝/μL，LAMP检测HPV18 L1基因的敏感度为1000拷贝每微升，见图1。
2.2 环介导等温扩增技术检测临床标本的效果
本研究采用环介导等温扩增技术检测60例正常体检妇女和患者人群宫颈刮片中HPV18感染情况，正常对照组60例，HPV18阳性为0；实验组中，阴道炎患者19例，HPV18阳性1例，阳性率为5.26%；慢性子宫颈炎组20例，HPVl8阳性2例，阳性率为10%；CIN I级5例中感染1例，CINⅡ级4例中感染2例，宫颈上皮内瘤变阳性检出率33.3%；阳性率子宫颈癌I级25例感染16例，阳性检出率为64%，随着病情加重，HPV18感染率增高，各组间差异有统计学意义（P<0.05），图2A、2B、2C反应了LAMP检测各组样本的显色图，反应管内棕黄色表示阴性，绿色表示阳性。
A：阴道炎患者和子宫颈炎患者样本。1～4：部分子宫颈炎患者标本，2、3阳性显色，1、4 阴性反应；5～8：部分阴道炎患者标本，6阳性显色，5、7、8 阴性反应；B：部分宫颈上皮内瘤变患者样本。1、2阳性显色，3～8，阴性反应；C： 阳性率子宫颈癌患者样本。1、2、5阳性显色，3、4、8阴性反应，6、阳性对照，8、阴性对照 3 讨论
流行病学调查发现，与高级别宫颈癌相比，早期宫颈癌和宫颈上皮内瘤变预后相对较好。因此， 在病原学因素方面找到可以早期快速诊断、有效治疗宫颈癌的方法至关重要并且切实可行。目前通过宫颈细胞涂片来筛查宫颈腺癌的方法有一定局限性， 容易漏诊和误诊，灵敏性及特异性均不高。LAMP方法是近年来兴起的一种快速检测核酸的分子生物学方法，其反应特异性显著高于常规PCR。芦春斌等[10]建立了基于颜色判定的环介导等温扩增方法检测HPV6和HPV16，提示利用该技术可以早期检测HPVDNA。我们利用该技术对60例健康体检妇女和73例不同妇科疾患人群进行HPV18检测，结果显示正常对照组中未检出HPV18感染；而在阴道炎、子宫颈炎等妇科炎症中检出了HPV18感染，随着病情加重，宫颈上皮内瘤变和子宫颈癌变标本中HPVl8检出阳性率增高。由此可见，对HPVl8 DNA 早期检测为更好地判断病变性质、发展趋势以及进一步的治疗和预防提供了重要依据。
目前妇女HPV感染及其混合感染率增高亚临床和潜伏型HPV感染，因缺乏形态学变化临床上迫切需要使用高敏感的DNA检测方法。我们在国内外相关研究基础上发展了LAMP法对临床标本HPV18的DNA检测，LAMP法在试验条件下能检测出1000拷贝的HPV18 DNA，且对于宫颈病变的临床标本能较为敏感的检测出HPV18，LAMP法在反应体系中加入了显色剂，结果可以通过目视即可以鉴定（绿色可判定为阳性，阴性呈棕黄色反应），检测时间60min，与常规的PCR方法相比，因此LAMP更为简便迅速、易于操作。我们将进一步利用建立的目视LAMP法检测更多临床样本，为完善基于目视LAMP法用于HPV病毒的检测在基层医院的推广应用鉴定坚实的实验依据。
[参考文献]
[1] zurHausen H.Papillomavinlses causing cancer：evasion from host-cell control in early events in carcinogenesis[J].J Nad Cancer Inst，2000，92（9）：690-698.
[2] Sankaranarayanan R，Nene BM，Shastri SS，et al.HPV screening for cervical cancer in Rural India [J]. N Engl J Med，2009，360（14）：1385-1394.
[3] Takacs T，Jeney C，Kovacs L，et al. Molecular beacon-based real-time PCR method for detection of 15 high risk and 5 low- risk HPV types[J]. J Virol Methods，2008，149（1）：153-162.
[4] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Res，2000，28（2）：e63.
[5] Fan H，Long B，Wu X，et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Cronobacter sakazaki[J].Virol J，2012，9（12）：321.
[6] Tsai MA，Wang PC，Yoshida T，et al. Development of a sensitive and specific LAMP PCR assay for detection of fish pathogen Lactococcus garvieae[J].Dis Aquat Organ，2013，102（3）：225-235.
[7] Bühlmann A，Pothier JF，Rezzonico F，et al. Erwinia amylovora loop-mediated isothermal amplification （LAMP） assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight[J].J Microbiol Methods，2013，92（3）：332-339.
[8] 郑曙民，陈星籍，海红，等.子宫颈癌患者人乳头瘤病毒16、18检测[J].肿瘤研究与临床，2008，20（1）：48-49.
[9] Parviz M，Mohammad R，Bahram K，et al. Detection of human papillomavirus type 16 and 18 in pathologic samples from patients with cervical cancer by PCR and RFLP methods [J].DARU，2006，14（2）：78-81.
[10] 芦春斌，罗乐，杨梦婕，等.基于颜色判定的环介导等温扩增技术检测HPV6 和HPV16[J].病毒学报，2011，27（1）： 64-69.
（收稿日期：2013-08-03）