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摘 要：本实验采用两种不同冲洗液对青霉素粉针剂无菌检查方法进行研究。实验结果表明青霉素粉针剂无菌检查时可采用薄膜过滤法消除抑菌性。最佳方法为每筒采用1500ml 0.1%蛋白胨缓冲液进行冲洗，每次100ml，可以选择大肠埃希菌或金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。
关键词：青霉素粉针剂；无菌；检查
20世纪40年代以前，人类一直未能掌握一种能高效治疗细菌性感染且副作用小的药物。亚历山大·弗莱明由于一次幸运的过失而发现了青霉素。1940年，英国Florey和Chain进一步研究此菌，并从培养液中制出了干燥的青霉素制品。青霉素又被称为青霉素G、盘尼西林、配尼西林、苄青霉素钠、青霉素钾等。青霉素是抗菌素的一种，是由青霉菌中提炼出的抗生素。青霉素属于β-内酰胺类抗生素（β-lactams），是很常用的抗菌药品。青霉素常用于金葡菌等革兰阳性球菌所致的败血症、肺炎、咽炎、扁桃体炎、脑膜炎、中耳炎、猩红热等[1-3]。青霉素类抗生素具有杀菌活性、毒性低、治疗敏感细菌所致感染具满意疗效，在临床上仍占有重要地位[4-5]。本实验采用两种不同冲洗液对青霉素粉针剂无菌检查方法进行研究。
1 试验环境与材料
1.1 试验环境：在环境洁净度为B+A的无菌室中进行。
1.2 仪器：高压灭菌锅MLS-3020（上海赛洋生物科技实业有限公司）；SPX-100b-z生化培养箱（杭州科晓化工仪器设备有限公司）；GRANT超声波清洗器（新生命科技有限公司）；微生物培养箱（常州市万丰仪器制造有限公司）；一次性全封闭集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）；上海舜宇恒平AE124C内校电子分析天平（北京联合科仪科技有限公司）。
1.3 试验用菌株：生孢梭菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌。
1.4 培养基、稀释液及缓冲液
1.4.1 干粉培养基：硫乙醇酸盐培养基（北京朋利驰科技有限公司）、改良马丁琼脂培养基（杭州驰成医药科技有限公司）、玫瑰红钠琼脂培养基（北京朋利驰科技有限公司）、营养琼脂培养基（杭州驰成医药科技有限公司）。
1.4.2 细菌稀释液：氯化钠溶液（德州市富凯化工有限责任公司）。
1.4.3 冲洗用缓冲液：蛋白胨缓冲液（杭州驰成医药科技有限公司）。
2 方法与结果
2.1 菌液制备
2.1.1 取经培养二十四小时的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的肉汤培养物1ml，用生理盐水10倍稀释至10-5～10-7，备用。
2.1.2 取经培养二十四小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基的新鲜培养物1ml，用生理盐水10倍稀释至10-7备用。
2.1.3 取经培养二十四小时的白色念珠菌液体培养物1ml，用生理盐水10倍稀释至10-5～10-6，备用。
2.1.4 取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加3～5ml生理盐水，洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1ml，加生理盐水适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，取1ml稀释后的孢子悬液，用生理盐水10倍稀释至10-4，备用。
2.2 菌液计数
每种菌液接种2个平皿，取其平均值。取白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1 ml，注入约15毫升、45摄氏度改良马丁琼脂平皿，经26摄氏度生化培养箱培养72小时，金黄色葡萄球菌液、枯草芽孢杆菌液、生孢梭菌液、大肠埃希菌液各1ml，注入约15毫升、45摄氏度营养琼脂平皿，经36摄氏度生化培养箱培养48小时，活菌计数。生孢梭菌菌落数69cfu/ml，枯草芽孢杆菌菌落数63cfu/ml，金黄色葡萄球菌菌落数71cfu/ml，白色念珠菌菌落数63cfu/ml，大肠埃希菌菌落数79cfu/ml，黑曲霉菌落数65cfu/ml。
2.3 实验
2.3.1 实验方法1。分别称取青霉素（160万单位）七份，分别加生理盐水200毫升转移至锥形瓶内，溶解，摇匀，分别置于七个滤筒中过滤，每筒采用1500ml 0.1%蛋白胨缓冲液进行冲洗，每次100ml，在最后一次冲洗中分别加入1ml已制备好的上述7株菌液，依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法，加入相应的培养基。
2.3.2 实验方法2。分别称取青霉素（160万单位）七份，分别加生理盐水200毫升转移至锥形瓶内，溶解，摇匀，分别置于七个滤筒中过滤，每筒采用1500ml 含有0.3%吐温-80的0.1%蛋白胨缓冲液进行冲洗，每次100ml，在最后一次冲洗中分别加入1ml已制备好的上述7株菌液，依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法，加入相应的培养基。
2.3.3 对照组。另取7个滤筒，分别加入1ml相应的试验菌，再加入相应等量培养基，作为对照，依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法培养14天。
2.3.4 供试品对照组。称取青霉素（160万单位）两份，分别加生理盐水200毫升转移至锥形瓶内，溶解，摇匀，置于滤筒中过滤，分别采用1500ml 含有0.3%吐温-80的0.1%蛋白胨缓冲液和1500ml 0.1%蛋白胨缓冲液进行冲洗，每次100ml，依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法，加入相应的培养基。
2.3.5 空白对照组。取试验用硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法培养14天。
2.3.6 阴性对照组。取冲洗用0.1%蛋白胨缓冲液、0.3%吐温-80的0.1%蛋白胨缓冲液、生理盐水适量，分置于六个滤筒中过滤，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法培养14天。
3 结果
青霉素粉针剂无菌检查时可采用薄膜过滤法消除抑菌性。结果表明，两种方法均能消除青霉素粉针剂的抑菌活性，但方法2加入吐温后易产生较多泡沫，不宜操作，所以选择方法1为青霉素粉针剂无菌检查方法。
参考文献
[1]戴德银，徐力，刘英.青霉素类药物抗菌作用及其临床应用进展[J].现代临床医学，2008（2）.
[2]牟恺，韩涛.青霉素类抗生素临床应用有关问题探析[J].黑龙江科技信息，2010（18）.
[3]杨光，张鑫鑫.浅谈青霉素的药理、作用及其过敏反应[J].黑龙江科技信息，2009（33）.
[4]刘天秀.青霉素类抗生素临床应用有关问题探讨[J].中国医疗前沿，2009（10）.
[5]薛闻俊，王颖.小议青霉素的发展历程与临床应用[J].黑龙江科技信息，2008（7）.
[6]刘士敬，朱倩.青霉素类抗生素概述[J].中国社区医师，2010（3）.
关键词：青霉素粉针剂；无菌；检查
20世纪40年代以前，人类一直未能掌握一种能高效治疗细菌性感染且副作用小的药物。亚历山大·弗莱明由于一次幸运的过失而发现了青霉素。1940年，英国Florey和Chain进一步研究此菌，并从培养液中制出了干燥的青霉素制品。青霉素又被称为青霉素G、盘尼西林、配尼西林、苄青霉素钠、青霉素钾等。青霉素是抗菌素的一种，是由青霉菌中提炼出的抗生素。青霉素属于β-内酰胺类抗生素（β-lactams），是很常用的抗菌药品。青霉素常用于金葡菌等革兰阳性球菌所致的败血症、肺炎、咽炎、扁桃体炎、脑膜炎、中耳炎、猩红热等[1-3]。青霉素类抗生素具有杀菌活性、毒性低、治疗敏感细菌所致感染具满意疗效，在临床上仍占有重要地位[4-5]。本实验采用两种不同冲洗液对青霉素粉针剂无菌检查方法进行研究。
1 试验环境与材料
1.1 试验环境：在环境洁净度为B+A的无菌室中进行。
1.2 仪器：高压灭菌锅MLS-3020（上海赛洋生物科技实业有限公司）；SPX-100b-z生化培养箱（杭州科晓化工仪器设备有限公司）；GRANT超声波清洗器（新生命科技有限公司）；微生物培养箱（常州市万丰仪器制造有限公司）；一次性全封闭集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）；上海舜宇恒平AE124C内校电子分析天平（北京联合科仪科技有限公司）。
1.3 试验用菌株：生孢梭菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌。
1.4 培养基、稀释液及缓冲液
1.4.1 干粉培养基：硫乙醇酸盐培养基（北京朋利驰科技有限公司）、改良马丁琼脂培养基（杭州驰成医药科技有限公司）、玫瑰红钠琼脂培养基（北京朋利驰科技有限公司）、营养琼脂培养基（杭州驰成医药科技有限公司）。
1.4.2 细菌稀释液：氯化钠溶液（德州市富凯化工有限责任公司）。
1.4.3 冲洗用缓冲液：蛋白胨缓冲液（杭州驰成医药科技有限公司）。
2 方法与结果
2.1 菌液制备
2.1.1 取经培养二十四小时的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的肉汤培养物1ml，用生理盐水10倍稀释至10-5～10-7，备用。
2.1.2 取经培养二十四小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基的新鲜培养物1ml，用生理盐水10倍稀释至10-7备用。
2.1.3 取经培养二十四小时的白色念珠菌液体培养物1ml，用生理盐水10倍稀释至10-5～10-6，备用。
2.1.4 取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加3～5ml生理盐水，洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1ml，加生理盐水适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，取1ml稀释后的孢子悬液，用生理盐水10倍稀释至10-4，备用。
2.2 菌液计数
每种菌液接种2个平皿，取其平均值。取白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1 ml，注入约15毫升、45摄氏度改良马丁琼脂平皿，经26摄氏度生化培养箱培养72小时，金黄色葡萄球菌液、枯草芽孢杆菌液、生孢梭菌液、大肠埃希菌液各1ml，注入约15毫升、45摄氏度营养琼脂平皿，经36摄氏度生化培养箱培养48小时，活菌计数。生孢梭菌菌落数69cfu/ml，枯草芽孢杆菌菌落数63cfu/ml，金黄色葡萄球菌菌落数71cfu/ml，白色念珠菌菌落数63cfu/ml，大肠埃希菌菌落数79cfu/ml，黑曲霉菌落数65cfu/ml。
2.3 实验
2.3.1 实验方法1。分别称取青霉素（160万单位）七份，分别加生理盐水200毫升转移至锥形瓶内，溶解，摇匀，分别置于七个滤筒中过滤，每筒采用1500ml 0.1%蛋白胨缓冲液进行冲洗，每次100ml，在最后一次冲洗中分别加入1ml已制备好的上述7株菌液，依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法，加入相应的培养基。
2.3.2 实验方法2。分别称取青霉素（160万单位）七份，分别加生理盐水200毫升转移至锥形瓶内，溶解，摇匀，分别置于七个滤筒中过滤，每筒采用1500ml 含有0.3%吐温-80的0.1%蛋白胨缓冲液进行冲洗，每次100ml，在最后一次冲洗中分别加入1ml已制备好的上述7株菌液，依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法，加入相应的培养基。
2.3.3 对照组。另取7个滤筒，分别加入1ml相应的试验菌，再加入相应等量培养基，作为对照，依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法培养14天。
2.3.4 供试品对照组。称取青霉素（160万单位）两份，分别加生理盐水200毫升转移至锥形瓶内，溶解，摇匀，置于滤筒中过滤，分别采用1500ml 含有0.3%吐温-80的0.1%蛋白胨缓冲液和1500ml 0.1%蛋白胨缓冲液进行冲洗，每次100ml，依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法，加入相应的培养基。
2.3.5 空白对照组。取试验用硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法培养14天。
2.3.6 阴性对照组。取冲洗用0.1%蛋白胨缓冲液、0.3%吐温-80的0.1%蛋白胨缓冲液、生理盐水适量，分置于六个滤筒中过滤，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，依照2010年版《中国药典》二部附录无菌检查法培养14天。
3 结果
青霉素粉针剂无菌检查时可采用薄膜过滤法消除抑菌性。结果表明，两种方法均能消除青霉素粉针剂的抑菌活性，但方法2加入吐温后易产生较多泡沫，不宜操作，所以选择方法1为青霉素粉针剂无菌检查方法。
参考文献
[1]戴德银，徐力，刘英.青霉素类药物抗菌作用及其临床应用进展[J].现代临床医学，2008（2）.
[2]牟恺，韩涛.青霉素类抗生素临床应用有关问题探析[J].黑龙江科技信息，2010（18）.
[3]杨光，张鑫鑫.浅谈青霉素的药理、作用及其过敏反应[J].黑龙江科技信息，2009（33）.
[4]刘天秀.青霉素类抗生素临床应用有关问题探讨[J].中国医疗前沿，2009（10）.
[5]薛闻俊，王颖.小议青霉素的发展历程与临床应用[J].黑龙江科技信息，2008（7）.
[6]刘士敬，朱倩.青霉素类抗生素概述[J].中国社区医师，2010（3）.