观察黄芪甲苷(AS-IV)在肿瘤坏死因子(TNF-α)的诱导下,对离体大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)基质金属蛋白酶(MMPs)表达的影响。
方法(1)采用组织贴块法培养大鼠血管平滑肌细胞,倒置相差显微镜和平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)进行细胞形态学和免疫组织化学鉴定;(2)以重组大鼠TNF-α(100 μg/L)作为刺激因素,建立体外平滑肌细胞增殖模型,并分组如下:①对照组;② TNF-α组;③ TNF-α+AS-IV 0.5 mg/L;④ TNF-α+AS-IV 5 mg/L;⑤ TNF-α+AS-IV 25 mg/L;⑥ TNF-α+AS-IV 50 mg/L;(3)应用CCK-8法检测AS-IV对TNF-α诱导的VSMCs增殖能力影响;(4)应用实时PCR和Western-blot实验分别检测AS-IV对VSMCs分泌的MMP-2及其抑制因子(TIMP-2)mRNA和蛋白表达水平的影响。
结果(1)在TNF-α刺激下,VSMCs增殖活性、迁移距离、侵袭能力与对照组相比均明显提高(P<0.01),提示TNF-α可促进VSMCs的增殖、迁移,成功建立了体外细胞实验模型。(2)CCK-8实验结果显示,细胞经TNF-α孵育至预定时间后,细胞增殖明显,吸光度(A)值上升(P<0.01)。经药物预处理后,各浓度组细胞增殖均受到抑制,与同期TNF-α组相比A值降低(P<0.05),且随着药物浓度和作用时间的增加,细胞生长抑制更加明显,提示AS-IV以时间和浓度依赖方式抑制了TNF-α诱导的VSMCs增殖。(3)实时荧光定量PCR和Western-blot结果显示,TNF-α能够通过诱导act MMP-2的合成,对proMMP-2及TIMP-2的表达无明显影响来改变MMPs与TIMPs的比例,进而促进ECM的降解。经药物干预后,AS-IV以浓度依赖方式通过下调TNF-α诱导的MMP-2过表达,上调TIMP-2的mRNA及蛋白表达,恢复MMPs与TIMPs的比例,使ECM降解减少,从而实现对VSMCs增殖、迁移的抑制作用。
结论黄芪甲苷能够以时间和浓度依赖方式抑制TNF-α诱导的VSMCs增殖、迁移;黄芪甲苷通过下调TNF-α诱导的MMP-2过表达,上调TIMP-2的表达,恢复MMPs与TIMPs的比例,使ECM降解减少,限制了VSMCs的迁移、增殖,从而实现对经皮冠状脉介入治疗术术后再狭窄的防治作用。