虾虎鱼类体态变异大、体型小、种类多,形态鉴定及谱系分类较为困难。为深入开展虾虎鱼类的鉴定、分类及遗传进化等研究,文章对已获得的26种虾虎鱼线粒体全基因组进行分析。结果发现,虾虎鱼类线粒体基因组的基因组成及排列模式与大多数脊椎动物线粒体基因组特征基本一致;由于不同物种的控制区存在不同数量的重复序列而导致基因组序列长度存在明显的差异;26种虾虎鱼线粒体全基因组序列及不同基因中A+T的含量均超过50%,并存在碱基G偏倚现象。基于37个编码基因序列,利用Kimura双参数法计算遗传距离,发现矛尾刺虾虎鱼与斑尾刺虾虎鱼、斑纹舌虾虎鱼与钝吻舌虾虎鱼分别为同种异名。通过对26种虾虎鱼线粒体基因组控制区序列的比较,识别了终止结合序列区、中央保守区及保守序列区。利用26种虾虎鱼线粒体基因组的36个编码基因序列构建系统发育树,发现部分聚类结果不同于传统的形态学分类方式,虾虎鱼科中的5个亚科出现了明显的分化,近盲虾虎鱼亚科、背眼虾虎鱼亚科、瓢虾虎鱼亚科亲缘关系较近而聚成一大支,然后与拟虾虎鱼亚科种类形成姐妹类群,虾虎鱼亚科与其它的4个亚科亲缘关系较远,单独成为一个类群。根据分子钟估算结果推测虾虎鱼科物种可能起源于始新世晚期至渐新世时段,在中新世进一步分化为具有现代表征的虾虎鱼种类。