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摘 要 目的：探索Xpert MTB/RIF试验在县（区）基层结核病实验室诊断疑似肺结核中的应用价值。方法：选取2015年3—6月在惠州市博罗县慢性病防治站就诊的疑似肺结核患者的痰样本110份，分别进行涂片抗酸染色法、固体培养法和比例法药敏、Xpert MTB/RIF试验检测。以固体培养法检测结果为标准，评估涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF试验检测痰样本中结核分枝杆菌的敏感度及特异性；以比例法药敏试验检测结果为标准，评估Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药的敏感度和特异性。结果：在110份痰样本中，结核分枝杆菌培养阳性的有48份，阳性率为43.64%。以固体培养法检测结果为标准，涂片抗酸染色法检测的敏感度为83.33%，低于Xpert MTB/RIF试验检测的91.67%，但差异无统计学意义（χ2=1.523 8， P>0.05）；特异性为90.32%，稍高于Xpert MTB/RIF试验检测的88.70%，但差异也无统计学意义（χ2=0.085 9， P>0.05）。以固体培养法检测结果为标准，涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF试验检测的K值分别为0.752和0.821，涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF試验检测结果与固体培养法检测结果均具有较好的一致性。以比例法药敏试验检测结果为标准，Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药的敏感度和特异性分别为87.50%和94.59%。结论：Xpert MTB/RIF试验检测操作简单、快速，可用于检测结核分支杆菌及其对利福平的耐药性，检测结果具有较高的敏感度和特异性，且与固体培养法检测结果有较好的一致性，具有在县（区）基层结核病实验室推广应用的潜力。
关键词 Xpert MTB/RIF试验 结核分枝杆菌 对利福平耐药
中图分类号：R521； R446.5 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）05-0041-03
Applied value of Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis in the primary laboratory
ZHONG Liyun1*， LI Jing2（1. Clinical Laboratory， Chronic Disease Prevention and Control Station of Boluo Country in Huizhou City， Guangdong 516100， China； 2. Clinical Laboratory， Huizhou Institution for Tuberculosis Prevention and Control， Guangdong 516100， China）
ABSTRACT Objective： To discuss the applied value of Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis in the primary laboratory. Methods： One hundred and ten cases of sputum samples collected from patients with suspected pulmonary tuberculosis were analyzed by phlegm smear microscopic exam， plate culture， proportional drug sensitivity test and Xpert MTB/ RIF detection， respectively and their sensitivity and specificity to Mycobacterium tuberculosis in sputum samples were evaluated. Results： There were 48 cases of Mycobacterium tuberculosis positive specimens with positive rate of 43.64%. The sensitivity of phlegm smear microscopic exam was lower while the specificity was a little bit higher than those of Xpert MTB/RIF detection（83.33% vs 91.67% and 90.32% vs 88.70%） when taking plate culture as gold standard， however their differences showed no statistical significance （P>0.05）. The kappa value was 0.752 for phlegm smear microscopic exam and 0.821 for Xpert MTB/ RIF detection， indicating that the detective results of both methods showed a good coincidence with plate culture. The sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF detection were 87.50% and 94.59% when taking proportional drug sensitivity test as standard. Conclusion： The Xpert MTB/RIF detection is fast and easy to operate with high sensitivity and specificity and a good coincidence with plate culture and can effectively detect Mycobacterium tuberculosis and its resistance to rifampicin， and is worthy of clinical use in primary laboratory. KEY WORDS Xpert MTB/RIF test； Mycobacterium tuberculosis； rifampicin resistance
肺结核是一种由结核分枝杆菌感染所引起的肺部感染性疾病，具有传染性、高致死率等特点，严重威胁着人们生命健康，已引起临床的普遍关注。目前，耐多药肺结核病例日益增多，给我国结核病防治工作带来了严峻挑战。世界卫生组织指出，高效和以人为本的检测诊断技术的普及是控制结核病的基础，同时及时、准确和可靠的药敏试验亦有重要意义。近年来，随着分子生物学诊断技术的迅速发展，Xpert MTB/RIF试验在结核病的快速诊断及对利福平耐药检测中的应用受到国内外专家和学者的广泛关注[1-2]。为此，本研究以在惠州市博罗县慢性病防治站就诊的疑似肺结核患者的110份痰样本为对象，分别采用涂片抗酸染色法、固体培养法、比例法药敏试验和Xpert MTB/RIF试验进行检测，以探索Xpert MTB/RIF试验在结核分枝杆菌及其对利福平耐药检测中的应用价值，尤其是用于县（区）基层结核病实验室的潜力，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2015年3—6月在惠州市博罗县慢性病防治站就诊的疑似肺结核患者的痰样本110份，所有样本在采集前患者均未接受过抗结核药物治疗。
1.2 检测方法
对110份疑似肺结核患者的痰样本分别进行涂片抗酸染色法、固体培养法、比例法药敏试验和Xpert MTB/RIF试验检测。Gene Xpert System及其试剂由美国Cepheid公司提供。
1）涂片抗酸染色法检测参照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》中的操作要求[3]进行。
2）固体培养法检测参照《结核病实验室标准化操作与网络建设》中的要求[4]进行，具体操作如下：先用4%的NaOH溶液处理，然后通过无菌操作方法将样本接种在培养基（改良的罗氏培养基）斜面上，于37 ℃下分别培养3和7 d，观察培养基的变化情况，此后每周观察1次，记录细菌的生长情况，直至出现阳性结果。若60 d后无细菌生长，则判断结果为阴性。菌落的生化实验菌种鉴定和比例法药敏试验检测参照《结核病诊断实验室检验规程》[5]进行。
3）Xpert MTB/RIF试验检测的操作方法为：将1 ml痰样本置于前处理管中，加入2倍痰样本体积的痰样本处理液，旋涡振荡器上振荡15 ～ 30 s，静置15 min并使痰样本充分液化，然后取2 ml缓慢转移至反应盒中，将反应盒置于检测系统中进行全自动检测，最后直接在检测系统窗口读取结果。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理，计数资料采用百分比的形式表示，计数资料间的比较采用卡方检验，P>0.05表示差异没有统计学意义。涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF试验检测结果与固体培养法检测结果的一致性比较采用Kappa检验，K≥0.75表示一致性良好。
2 结果
2.1 涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌的结果
在110份痰样本中，结核分枝杆菌培养阳性的有48份，阳性率为43.64%。以固体培养法检查结果为标准，涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌（表1）的敏感度、特異性、阳性预测率、阴性预测率和准确性分别为83.33%、90.32%、86.96%、87.54%和87.27%，而Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌（表2）的敏感度、特异性、阳性预测率、阴性预测率和准确性分别为91.67%、88.70%、86.27%、93.22%和90.00%。涂片抗酸染色法检测的敏感度为83.33%，低于Xpert MTB/RIF试验检测的91.67%，但差异无统计学意义（χ2=1.523 8， P>0.05）；特异性为90.32%，略高于Xpert MTB/RIF试验检测的88.70%，但差异也无统计学意义（χ2=0.085 9， P>0.05）。以固体培养法检测结果为标准，涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF试验检测的K值分别为0.752和0.821，涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF试验检测结果与固体培养法检测结果均具有较好的一致性。
2.2 Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药的结果
经菌种鉴定，在48份阳性样本中，有3份为非结核分枝杆菌，其余45份为结核分枝杆菌。Xpert MTB/RIF试验的耐药检出率为20.00%，稍高于比例法药敏试验的17.78%（表3），但差异无统计学意义（χ2=0.072 5， P>0.05）。以比例法药敏试验检测结果为标准，Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药的敏感度和特异性分别为87.50%和94.59%。
3 讨论
结核分支杆菌的固体培养法、涂片抗酸染色法等检测方法是临床上诊断结核病的经典方法，其中固体培养法是检测结核分枝杆菌的金标准方法，具有较高的敏感度和特异性，但需时过长。涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌虽然快捷、简便，但对样本的含菌量有要求，如是含菌量较低的肺外样本，则易出现漏诊。此外，涂片抗酸染色法检测亦不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。比例法药敏试验是目前临床上用来检测结核分枝杆菌是否对利福平耐药的金标准方法，但其检测需时非常长，可能对患者治疗产生一定的负面影响。Xpert MTB/RIF试验是一种集样品准备、定量聚合酶链反应扩增和荧光检测于一身的体外检测方法，其采用一次性试剂盒，自动完成检测，操作简便且仅需时2 h左右，同时检测过程中不易受到干扰，可用作临床上检测结核分枝杆菌及其对利福平耐药情况的首选方法[6]。世界卫生组织已推荐Xpert MTB/RIF试验为中低收入国家结核病和耐多药结核病检测的主要方法[7]。 本研究结果显示，在110份痰样本中，结核分枝杆菌培养阳性的有48份，阳性率为43.64%。以固体培养法检测结果为标准，涂片抗酸染色法检测的敏感度为83.33%，低于Xpert MTB/RIF试验检测的91.67%；特异性为90.32%，稍高于Xpert MTB/RIF试验检测的88.70%。这说明，Xpert MTB/RIF试验检测结核分支杆菌的敏感度和特异性均较好，与涂片抗酸染色法检测结果相当（差异没有统计学意义）。以固体培养法检测结果为标准，涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF试验检测的K值分别为0.752和0.821，涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF试验检测结果与固体培养法检测结果的一致性也均较好。以比例法药敏试验检测结果为标准，Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药的敏感度和特异性分别为87.50%和94.59%，与国内其他研究结果相似。81 bp核心突变区是耐利福平结核分枝杆菌耐药基因的主要集中区域，Xpert MTB/RIF试验正是通过检查rpoB基因的该核心突变区而检测耐利福平结核分枝杆菌的。Xpert MTB/RIF试验检测平均需时约2 h，而涂片抗酸染色法检测平均需时1 d，固体培养法检测需时1个月以上，比例法药敏试验检测则需时2个多月才能得到结果。显然，Xpert MTB/RIF试验检测的时间成本更低、效率更高。本研究结果说明，Xpert MTB/RIF试验检测操作简单、快速，可有效检测结核分支杆菌及其对利福平的耐药情况，具有较高的敏感度和特异性，且与固体培养法检测结果有较好的一致性，适合在县（区）基层结核病实验室中应用，有助于结核病的早期篩查、早期诊断和早期治疗。
参考文献
[1] 刘家云， 郝晓柯. 结核病实验室诊断方法新进展[J]. 临床检验杂志， 2013， 31（2）： 115-117.
[2] 刘建侠. Xpert MTB/RIF技术在基层定点医院肺结核病诊断中的应用价值[J]. 中国实验诊断学， 2016， 20（6）： 928-930.
[3] 赵雁林， 姜广路. 痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册[M]. 北京： 中国协和医科大学出版社， 2009： 4-9.
[4] 赵雁林， 刘志敏. 结核病实验室标准化操作与网络建设[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2013： 227-280.
[5] 中国防痨协会基础专业委员会. 结核病诊断实验室检验规程[M]. 北京： 中国教育文化出版， 2006： 17-18.
[6] 高文凤， 龙波， 杨筠， 等. Xpert MTB/RIF技术在结核病诊断及耐药检测中的应用[J]. 中国卫生检验杂志， 2016， 26（13）： 1858-1859.
[7] 徐礼锋， 祝进， 朱晟梅， 等. Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌和利福平耐药性的应用研究[J]. 中华临床感染病杂志， 2016， 9（1）： 66-68.
关键词 Xpert MTB/RIF试验 结核分枝杆菌 对利福平耐药
中图分类号：R521； R446.5 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）05-0041-03
Applied value of Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis in the primary laboratory
ZHONG Liyun1*， LI Jing2（1. Clinical Laboratory， Chronic Disease Prevention and Control Station of Boluo Country in Huizhou City， Guangdong 516100， China； 2. Clinical Laboratory， Huizhou Institution for Tuberculosis Prevention and Control， Guangdong 516100， China）
ABSTRACT Objective： To discuss the applied value of Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis in the primary laboratory. Methods： One hundred and ten cases of sputum samples collected from patients with suspected pulmonary tuberculosis were analyzed by phlegm smear microscopic exam， plate culture， proportional drug sensitivity test and Xpert MTB/ RIF detection， respectively and their sensitivity and specificity to Mycobacterium tuberculosis in sputum samples were evaluated. Results： There were 48 cases of Mycobacterium tuberculosis positive specimens with positive rate of 43.64%. The sensitivity of phlegm smear microscopic exam was lower while the specificity was a little bit higher than those of Xpert MTB/RIF detection（83.33% vs 91.67% and 90.32% vs 88.70%） when taking plate culture as gold standard， however their differences showed no statistical significance （P>0.05）. The kappa value was 0.752 for phlegm smear microscopic exam and 0.821 for Xpert MTB/ RIF detection， indicating that the detective results of both methods showed a good coincidence with plate culture. The sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF detection were 87.50% and 94.59% when taking proportional drug sensitivity test as standard. Conclusion： The Xpert MTB/RIF detection is fast and easy to operate with high sensitivity and specificity and a good coincidence with plate culture and can effectively detect Mycobacterium tuberculosis and its resistance to rifampicin， and is worthy of clinical use in primary laboratory. KEY WORDS Xpert MTB/RIF test； Mycobacterium tuberculosis； rifampicin resistance
肺结核是一种由结核分枝杆菌感染所引起的肺部感染性疾病，具有传染性、高致死率等特点，严重威胁着人们生命健康，已引起临床的普遍关注。目前，耐多药肺结核病例日益增多，给我国结核病防治工作带来了严峻挑战。世界卫生组织指出，高效和以人为本的检测诊断技术的普及是控制结核病的基础，同时及时、准确和可靠的药敏试验亦有重要意义。近年来，随着分子生物学诊断技术的迅速发展，Xpert MTB/RIF试验在结核病的快速诊断及对利福平耐药检测中的应用受到国内外专家和学者的广泛关注[1-2]。为此，本研究以在惠州市博罗县慢性病防治站就诊的疑似肺结核患者的110份痰样本为对象，分别采用涂片抗酸染色法、固体培养法、比例法药敏试验和Xpert MTB/RIF试验进行检测，以探索Xpert MTB/RIF试验在结核分枝杆菌及其对利福平耐药检测中的应用价值，尤其是用于县（区）基层结核病实验室的潜力，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2015年3—6月在惠州市博罗县慢性病防治站就诊的疑似肺结核患者的痰样本110份，所有样本在采集前患者均未接受过抗结核药物治疗。
1.2 检测方法
对110份疑似肺结核患者的痰样本分别进行涂片抗酸染色法、固体培养法、比例法药敏试验和Xpert MTB/RIF试验检测。Gene Xpert System及其试剂由美国Cepheid公司提供。
1）涂片抗酸染色法检测参照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》中的操作要求[3]进行。
2）固体培养法检测参照《结核病实验室标准化操作与网络建设》中的要求[4]进行，具体操作如下：先用4%的NaOH溶液处理，然后通过无菌操作方法将样本接种在培养基（改良的罗氏培养基）斜面上，于37 ℃下分别培养3和7 d，观察培养基的变化情况，此后每周观察1次，记录细菌的生长情况，直至出现阳性结果。若60 d后无细菌生长，则判断结果为阴性。菌落的生化实验菌种鉴定和比例法药敏试验检测参照《结核病诊断实验室检验规程》[5]进行。
3）Xpert MTB/RIF试验检测的操作方法为：将1 ml痰样本置于前处理管中，加入2倍痰样本体积的痰样本处理液，旋涡振荡器上振荡15 ～ 30 s，静置15 min并使痰样本充分液化，然后取2 ml缓慢转移至反应盒中，将反应盒置于检测系统中进行全自动检测，最后直接在检测系统窗口读取结果。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理，计数资料采用百分比的形式表示，计数资料间的比较采用卡方检验，P>0.05表示差异没有统计学意义。涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF试验检测结果与固体培养法检测结果的一致性比较采用Kappa检验，K≥0.75表示一致性良好。
2 结果
2.1 涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌的结果
在110份痰样本中，结核分枝杆菌培养阳性的有48份，阳性率为43.64%。以固体培养法检查结果为标准，涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌（表1）的敏感度、特異性、阳性预测率、阴性预测率和准确性分别为83.33%、90.32%、86.96%、87.54%和87.27%，而Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌（表2）的敏感度、特异性、阳性预测率、阴性预测率和准确性分别为91.67%、88.70%、86.27%、93.22%和90.00%。涂片抗酸染色法检测的敏感度为83.33%，低于Xpert MTB/RIF试验检测的91.67%，但差异无统计学意义（χ2=1.523 8， P>0.05）；特异性为90.32%，略高于Xpert MTB/RIF试验检测的88.70%，但差异也无统计学意义（χ2=0.085 9， P>0.05）。以固体培养法检测结果为标准，涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF试验检测的K值分别为0.752和0.821，涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF试验检测结果与固体培养法检测结果均具有较好的一致性。
2.2 Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药的结果
经菌种鉴定，在48份阳性样本中，有3份为非结核分枝杆菌，其余45份为结核分枝杆菌。Xpert MTB/RIF试验的耐药检出率为20.00%，稍高于比例法药敏试验的17.78%（表3），但差异无统计学意义（χ2=0.072 5， P>0.05）。以比例法药敏试验检测结果为标准，Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药的敏感度和特异性分别为87.50%和94.59%。
3 讨论
结核分支杆菌的固体培养法、涂片抗酸染色法等检测方法是临床上诊断结核病的经典方法，其中固体培养法是检测结核分枝杆菌的金标准方法，具有较高的敏感度和特异性，但需时过长。涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌虽然快捷、简便，但对样本的含菌量有要求，如是含菌量较低的肺外样本，则易出现漏诊。此外，涂片抗酸染色法检测亦不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。比例法药敏试验是目前临床上用来检测结核分枝杆菌是否对利福平耐药的金标准方法，但其检测需时非常长，可能对患者治疗产生一定的负面影响。Xpert MTB/RIF试验是一种集样品准备、定量聚合酶链反应扩增和荧光检测于一身的体外检测方法，其采用一次性试剂盒，自动完成检测，操作简便且仅需时2 h左右，同时检测过程中不易受到干扰，可用作临床上检测结核分枝杆菌及其对利福平耐药情况的首选方法[6]。世界卫生组织已推荐Xpert MTB/RIF试验为中低收入国家结核病和耐多药结核病检测的主要方法[7]。 本研究结果显示，在110份痰样本中，结核分枝杆菌培养阳性的有48份，阳性率为43.64%。以固体培养法检测结果为标准，涂片抗酸染色法检测的敏感度为83.33%，低于Xpert MTB/RIF试验检测的91.67%；特异性为90.32%，稍高于Xpert MTB/RIF试验检测的88.70%。这说明，Xpert MTB/RIF试验检测结核分支杆菌的敏感度和特异性均较好，与涂片抗酸染色法检测结果相当（差异没有统计学意义）。以固体培养法检测结果为标准，涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF试验检测的K值分别为0.752和0.821，涂片抗酸染色法和Xpert MTB/RIF试验检测结果与固体培养法检测结果的一致性也均较好。以比例法药敏试验检测结果为标准，Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药的敏感度和特异性分别为87.50%和94.59%，与国内其他研究结果相似。81 bp核心突变区是耐利福平结核分枝杆菌耐药基因的主要集中区域，Xpert MTB/RIF试验正是通过检查rpoB基因的该核心突变区而检测耐利福平结核分枝杆菌的。Xpert MTB/RIF试验检测平均需时约2 h，而涂片抗酸染色法检测平均需时1 d，固体培养法检测需时1个月以上，比例法药敏试验检测则需时2个多月才能得到结果。显然，Xpert MTB/RIF试验检测的时间成本更低、效率更高。本研究结果说明，Xpert MTB/RIF试验检测操作简单、快速，可有效检测结核分支杆菌及其对利福平的耐药情况，具有较高的敏感度和特异性，且与固体培养法检测结果有较好的一致性，适合在县（区）基层结核病实验室中应用，有助于结核病的早期篩查、早期诊断和早期治疗。
参考文献
[1] 刘家云， 郝晓柯. 结核病实验室诊断方法新进展[J]. 临床检验杂志， 2013， 31（2）： 115-117.
[2] 刘建侠. Xpert MTB/RIF技术在基层定点医院肺结核病诊断中的应用价值[J]. 中国实验诊断学， 2016， 20（6）： 928-930.
[3] 赵雁林， 姜广路. 痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册[M]. 北京： 中国协和医科大学出版社， 2009： 4-9.
[4] 赵雁林， 刘志敏. 结核病实验室标准化操作与网络建设[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2013： 227-280.
[5] 中国防痨协会基础专业委员会. 结核病诊断实验室检验规程[M]. 北京： 中国教育文化出版， 2006： 17-18.
[6] 高文凤， 龙波， 杨筠， 等. Xpert MTB/RIF技术在结核病诊断及耐药检测中的应用[J]. 中国卫生检验杂志， 2016， 26（13）： 1858-1859.
[7] 徐礼锋， 祝进， 朱晟梅， 等. Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌和利福平耐药性的应用研究[J]. 中华临床感染病杂志， 2016， 9（1）： 66-68.