论文部分内容阅读
【摘 要】 国家食品药品监督管理局为考核检验机构的检验能力，组织了沙门氏菌的盲样考核。本文记录并分析了检验沙门氏菌的方法与步骤。
【关键词】 沙门氏菌 盲样考核 方法
【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2017.08.003
1 沙门氏菌简介
沙门氏菌，肠杆菌科肠道杆菌，革兰氏阴性，种类近千种，按其抗原特异性分为甲、乙、丙、丁、戊等。可导致人体患病的沙门氏菌主要有甲组、乙组的副伤寒菌，丙组的副伤寒猪霍乱杆菌，丁组的伤寒杆菌及肠炎杆菌等。伤寒杆菌、副伤寒甲、乙杆菌主要引起人类患病，而副伤寒猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等属于人兽共患病原菌，对人类主要引起急性胃肠炎，出现食物中毒症状。
沙门氏菌在水中可生存2-3周，粪便中可存活1-2个月，冰箱4℃放置3-4个月仍有活力，在自然界可在冰冻土壤中过冬。沙门氏菌在20℃以上即可繁殖，37℃繁殖旺盛。
1.1 生物学性状 （形态、染色及生化反应）
革兰氏阴性菌，大小（0.6～1.0）×（2～4）微米，有菌毛，除鸡沙门氏菌和雏沙门菌外均有鞭毛，无芽胞，一般无荚膜。营养要求低，分离培养常用肠道选择鉴别培养基，形成无色菌落。生化反应结果有重要鉴别意义，如能发酵葡萄糖、甘露糖、麦芽糖，不发酵乳糖和蔗糖，不能分解尿素，不能液化明胶，不产生吲哚，可产酸产气，也有少数菌只产酸不产气；硫化氢阳性或阴性，有赖氨酸脱羧酶；动力阳性；对热敏感，60℃保持20分钟可杀死该菌；在5%的石炭酸中5分钟即失去活力。
1.2 抗原构造及分类
沙门氏菌抗原结构复杂，一般含有菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原和表面（Vi）三种抗原。
1.3 致病因子及所致疾病
沙门氏菌经口进入人体，当具有一定数量，经胃酸、正常菌群及肠道免疫作用后仍有存留，定位于小肠便可引起疾病。沙门氏菌致病因子主要包括直接侵袭、内毒素和肠毒素。沙门氏菌可以直接入侵小肠壁上皮细胞，也可穿过上皮细胞进一步入侵固有层。小肠派氏淋巴结M细胞转运沙门氏菌后，可导致巨噬细胞吞噬，但巨噬细胞杀伤系统对沙门氏菌无效，相反导致进一步增殖。沙门菌属的内毒素导致人体体温升高、白细胞数值下降，也可激活补提，大量内毒素甚至可以导致中毒症状和休克。有些沙门氏菌可产生肠毒素，如鼠伤寒沙门菌。
人类沙门氏菌导致疾病主要包括肠伤寒、急性胃肠炎及沙门氏菌菌血症。
2 沙门氏菌盲样考核的步骤
2016年7月初接到国家食品药品监督管理局组织的沙门氏菌盲样考核样品。
2.1 样品接收
样品正常：10个西林瓶和10个奶粉样品保存完整，编号清晰。编号分别为CODE1、CODE2、CODE3、CODE4、CODE5、CODE6、CODE7、CODE8、CODE9、CODE10。确认签收后按照GB 4789.4-2010《食品安全国家标准 食品微生物检验 沙门氏菌检验》开始样品的检测。
2.2 检验过程
2.2.1 第一天：前增菌
在生物安全柜内将沙门氏菌样品的西林瓶打开，取225mL灭菌BPW增菌液加入到无菌均质袋中，并加入西林瓶内白色小球，混匀溶解。再将与西林瓶编码相同的奶粉样品分别加入到上述BPW增菌液中，充分混匀。将沙门氏菌样品与相同编号的奶粉样品混合，分别编号CODE1、CODE2、CODE3、CODE4、CODE5、CODE6、CODE7、CODE8、CODE9、CODE10。编号后置于36℃培养18h。
2.2.2 第二天：增菌
按照标准每个样品移取1mL接种于10mLTTB内，于42℃培养24h。同时，每个样品另取1mL接种于10mLSC内，36℃培养24h。
2.2.3 第三、四天：分离
各取增菌培养物1环，分别划线接种于一个BS琼脂平板（36℃培养48h）和一个沙门氏菌显示培养基平板（36℃培养24h），同时将沙门氏菌阳性菌株和阴性对照菌株大肠埃希氏菌接种显色培养基；36℃培养24h。见第91页表3。
根据沙门氏菌在选择性培养基上的菌落特征，初步判定CODE3、CODE5、CODE6、CODE9中存在沙门氏菌。
2.2.4 第五天：纯化
挑取CODE3、CODE5、CODE6、CODE9在显色培养基的淡紫色菌落在营养琼脂平板上进行纯化培养。36℃培养24h。
2.2.5 第六天：生化试验和血清学鉴定
（1）从CODE3、CODE5、CODE6、CODE9純化板上挑取2个以上可疑菌落，进行生化试验。本实验室使用的是北京陆桥生产的沙门氏菌干制生化鉴定试剂盒。
（2）血清学鉴定
CODE3、CODE5、CODE6、CODE9均判定为沙门氏菌。
2.2.6 检测结果
综合形态学鉴定和生化鉴定，得出本次样品检测结果：
CODE3、CODE5、CODE6、CODE9检出沙门氏菌；
CODE1、CODE2、CODE4、CODE7、CODE8、CODE10未检出沙门氏菌。
作者简介
高元，研究生，中级职称，现任锦州市产品质量监督检验所微生物室主任。
刘畅，本科，中级职称，现任锦州市产品质量监督检验所中心检验部副部长。
冯琳琳，研究生在读，助理工程师，现任锦州市产品质量监督检验所微生物室检验员。
【关键词】 沙门氏菌 盲样考核 方法
【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2017.08.003
1 沙门氏菌简介
沙门氏菌，肠杆菌科肠道杆菌，革兰氏阴性，种类近千种，按其抗原特异性分为甲、乙、丙、丁、戊等。可导致人体患病的沙门氏菌主要有甲组、乙组的副伤寒菌，丙组的副伤寒猪霍乱杆菌，丁组的伤寒杆菌及肠炎杆菌等。伤寒杆菌、副伤寒甲、乙杆菌主要引起人类患病，而副伤寒猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等属于人兽共患病原菌，对人类主要引起急性胃肠炎，出现食物中毒症状。
沙门氏菌在水中可生存2-3周，粪便中可存活1-2个月，冰箱4℃放置3-4个月仍有活力，在自然界可在冰冻土壤中过冬。沙门氏菌在20℃以上即可繁殖，37℃繁殖旺盛。
1.1 生物学性状 （形态、染色及生化反应）
革兰氏阴性菌，大小（0.6～1.0）×（2～4）微米，有菌毛，除鸡沙门氏菌和雏沙门菌外均有鞭毛，无芽胞，一般无荚膜。营养要求低，分离培养常用肠道选择鉴别培养基，形成无色菌落。生化反应结果有重要鉴别意义，如能发酵葡萄糖、甘露糖、麦芽糖，不发酵乳糖和蔗糖，不能分解尿素，不能液化明胶，不产生吲哚，可产酸产气，也有少数菌只产酸不产气；硫化氢阳性或阴性，有赖氨酸脱羧酶；动力阳性；对热敏感，60℃保持20分钟可杀死该菌；在5%的石炭酸中5分钟即失去活力。
1.2 抗原构造及分类
沙门氏菌抗原结构复杂，一般含有菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原和表面（Vi）三种抗原。
1.3 致病因子及所致疾病
沙门氏菌经口进入人体，当具有一定数量，经胃酸、正常菌群及肠道免疫作用后仍有存留，定位于小肠便可引起疾病。沙门氏菌致病因子主要包括直接侵袭、内毒素和肠毒素。沙门氏菌可以直接入侵小肠壁上皮细胞，也可穿过上皮细胞进一步入侵固有层。小肠派氏淋巴结M细胞转运沙门氏菌后，可导致巨噬细胞吞噬，但巨噬细胞杀伤系统对沙门氏菌无效，相反导致进一步增殖。沙门菌属的内毒素导致人体体温升高、白细胞数值下降，也可激活补提，大量内毒素甚至可以导致中毒症状和休克。有些沙门氏菌可产生肠毒素，如鼠伤寒沙门菌。
人类沙门氏菌导致疾病主要包括肠伤寒、急性胃肠炎及沙门氏菌菌血症。
2 沙门氏菌盲样考核的步骤
2016年7月初接到国家食品药品监督管理局组织的沙门氏菌盲样考核样品。
2.1 样品接收
样品正常：10个西林瓶和10个奶粉样品保存完整，编号清晰。编号分别为CODE1、CODE2、CODE3、CODE4、CODE5、CODE6、CODE7、CODE8、CODE9、CODE10。确认签收后按照GB 4789.4-2010《食品安全国家标准 食品微生物检验 沙门氏菌检验》开始样品的检测。
2.2 检验过程
2.2.1 第一天：前增菌
在生物安全柜内将沙门氏菌样品的西林瓶打开，取225mL灭菌BPW增菌液加入到无菌均质袋中，并加入西林瓶内白色小球，混匀溶解。再将与西林瓶编码相同的奶粉样品分别加入到上述BPW增菌液中，充分混匀。将沙门氏菌样品与相同编号的奶粉样品混合，分别编号CODE1、CODE2、CODE3、CODE4、CODE5、CODE6、CODE7、CODE8、CODE9、CODE10。编号后置于36℃培养18h。
2.2.2 第二天：增菌
按照标准每个样品移取1mL接种于10mLTTB内，于42℃培养24h。同时，每个样品另取1mL接种于10mLSC内，36℃培养24h。
2.2.3 第三、四天：分离
各取增菌培养物1环，分别划线接种于一个BS琼脂平板（36℃培养48h）和一个沙门氏菌显示培养基平板（36℃培养24h），同时将沙门氏菌阳性菌株和阴性对照菌株大肠埃希氏菌接种显色培养基；36℃培养24h。见第91页表3。
根据沙门氏菌在选择性培养基上的菌落特征，初步判定CODE3、CODE5、CODE6、CODE9中存在沙门氏菌。
2.2.4 第五天：纯化
挑取CODE3、CODE5、CODE6、CODE9在显色培养基的淡紫色菌落在营养琼脂平板上进行纯化培养。36℃培养24h。
2.2.5 第六天：生化试验和血清学鉴定
（1）从CODE3、CODE5、CODE6、CODE9純化板上挑取2个以上可疑菌落，进行生化试验。本实验室使用的是北京陆桥生产的沙门氏菌干制生化鉴定试剂盒。
（2）血清学鉴定
CODE3、CODE5、CODE6、CODE9均判定为沙门氏菌。
2.2.6 检测结果
综合形态学鉴定和生化鉴定，得出本次样品检测结果：
CODE3、CODE5、CODE6、CODE9检出沙门氏菌；
CODE1、CODE2、CODE4、CODE7、CODE8、CODE10未检出沙门氏菌。
作者简介
高元，研究生，中级职称，现任锦州市产品质量监督检验所微生物室主任。
刘畅，本科，中级职称，现任锦州市产品质量监督检验所中心检验部副部长。
冯琳琳，研究生在读，助理工程师，现任锦州市产品质量监督检验所微生物室检验员。