目的:建立基于实时定量PCR的线粒体DNA(mt DNA)拷贝数的检测方法,并利用所建立的方法初步检测和探讨mt DNA在肾脏疾病诊断中的应用。方法:设计mt DNA PCR扩增引物,PCR扩增获得mt DNA片段,与T载体质粒连接,构建mt DNA定量标准品。采用SYBR Green-Ⅰ染料法实时定量PCR方法建立mt DNA定量的标准曲线,检验定量方法的重复性与特异性。利用所建立的方法检测局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者血清mt DNA和尿液微囊泡(MV)mt DNA的变化;此外,还对体外嘌呤霉素氨基核苷(PAN)刺激的足细胞所分泌的MV中mt DNA进行了检测。结果:(1)选取mt DNA特异性引物,通过SYBRGreen-Ⅰ实时定量PCR建立mt DNA拷贝数绝对定量的检测方法具有良好的特异度、灵敏度和重复性;(2)检测10例FSGS患者和6例正常对照血清mt DNA水平发现,FSGS患者血清mt DNA水平明显低于正常对照(P<0.05);(3)检测5例FSGS患者与5例健康对照一定体积尿液中MV mt DNA含量发现,FSGS患者高于健康对照,但FSGS患者尿液MV的含量也显著高于健康对照;(4)受PAN刺激的足细胞,其分泌的MV中mt DNA含量下降,与足细胞内mt DNA含量变化相一致。结论 :本方法为探索mt DNA作为肾脏疾病诊断的生物标志物的可能性提供了有效的实验手段。