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【摘要】采用微生物农药降解酶解决农药残留污染问题是当前环境科学研究的热点,也是一个较新的研究领域。本实验室从农药厂的污泥中筛选到1株能降解菊酯类农药的菌株Klebsiella sp. ZD112。进一步研究发现，ZD112的胞外粗酶液对氯氰菊酯无降解活性，胞内粗酶液对氯氰菊酯的降解效能较高。胞内粗酶液降解氯氰菊酯最适温度为45 ℃, 最适pH为6.5。以氯氰菊酯为底物,胞内粗酶液的米氏动力常数（Km）为10.25μM,最大反应速率（Vmax）为114.94μM/min。
【关键词】菊酯农药；克雷伯氏菌；降解酶
Krey eldest brother fungus strain ZD112 chrysanthemum ester agricultural chemicals degeneration enzyme characteristic research
WANGZhuoya1LIUYuhuan2LIANGWeiqu2
【Abstract】Uses the microbial pesticide degeneration enzyme solution pesticide residue contamination concern is the current environmental science research hot spot, is also a new research area. This laboratory screens from the insecticide factory sludge to 1 can degrade the chrysanthemum ester agricultural chemicals strain Klebsiella sp. ZD112. The research discovery, outside the ZD112 butcher the thick enzyme fluid to the chlorine cyanogen chrysanthemum ester non-degeneration activeness, in the butcher the thick enzyme fluid is further high to the chlorine cyanogen chrysanthemum ester's degeneration potency. In the butcher the thick enzyme fluid degeneration chlorine cyanogen chrysanthemum ester optimum temperature is 45 ℃, most suitable pH is 6.5. Take the chlorine cyanogen chrysanthemum ester as the substrate, in the butcher the thick enzyme fluid Mie power constant (Km) is 10.25μM, the maximum reaction rate (Vmax) is 114.94μM/min.
【Key words】Chrysanthemum ester agricultural chemicals; Krey eldest brother fungus; Degeneration enzyme
擬除虫菊酯类杀虫剂在家庭卫生和农业生产中的应用已有四十多年的历史，其广泛应用所产生的大量积累和残留，造成环境污染，妨碍生物生长，并直接或间接地危害着人体健康[1]。发展一种有效方法消除或降低食品和环境中的菊酯农药残留已成为当前迫切需要解决的问题。目前广泛使用的拟除虫菊酯类杀虫剂具有光、热稳定性，在自然条件下不易发生降解，其在自然环境中的残留主要由微生物的活动来去除[2]。农药的生物降解实质上是在农药降解酶的作用下完成的[3]，与原始产酶菌剂比起来，农药降解酶制剂具有降解速度快，无毒副作用，更能耐受异常环境条件等多种优点[4,5]。
在过去的研究工作中，本实验室获得了一株能以菊酯为唯一碳源和氮源生长的伯雷克氏菌株Klebsiella sp. ZD112，鉴于直接应用农药降解酶制剂比应用产酶的菌剂更有优势，我们对ZD112所产菊酯农药降解酶特性进行了进一步的研究，以便为降解酶的进一步开发利用打下基础。
1材料和方法
1.1克雷伯氏菌株ZD112：由本实验室从污染地区采样筛选而得。
1.2培养基：各种培养基均按实验手册配制。
1.3菌株Klebsiella sp.ZD112 的降解底物谱研究。
1.4粗酶液的制备：取活化过的菌株接种于LB培养基(氯氰菊酯浓度为100 mg/ml)， 37℃，160 r/min培养2d后，10000 rpm离心10 min，上清液与菌体分开收集。其中上清液经硫酸铵沉淀（饱和度为85%）后4℃盐析过夜。12000 rpm离心15 min收集沉淀，用pH 6.2、0.02M的磷酸盐缓冲液溶解后用同一缓冲液透析至无SO42-得胞外粗酶液。收集的菌体，则用pH6.2、0.02M的磷酸盐缓冲液洗涤3次后，浓缩103倍溶于缓冲液中，配成菌悬液。用超声波破碎仪破碎3次,每次50sec,然后10000rpm离心10min，取上清液，得无细胞胞内粗酶液[6,7]。
1.5 酶活力的测定。
1.5.1由于无色的对硝基苯乙酸酯的水解产物之一是黄色的对硝基苯酚，该产物可在OD405nm测定，因此我们用对硝基苯乙酸酯来测定菌株Klebsiella sp.ZD112的降解酶活。反应体系:
酶(培养液)100 μl 对硝基苯乙酸酯溶液(20mM)100 μl 0.02M、pH6.2 磷酸缓冲液补足体积至1 ml 在42 ℃反应30 min后，测定反应的OD405值变化。酶活单位定义为：42 ℃时每毫升酶液(培养液)每分钟产生1 μM对硝基苯酚所需要的酶量[8]。
酶活力计算公式：酶活办（U）=A消光系数×10-6×t( A为反应体系在一定波长下的光吸收值，t为反应时间 )
1.5.2反应体系统一为:预热的一定pH的含氯氰菊酯农药50mg/L的磷酸盐缓冲液2.7 ml中，加预热粗酶液0.3 ml，其总体积为3 ml，42℃水浴中反应30 min后加0.2 ml,1.0M HCl溶液终止酶反应。每一处理重复3次，以不加酶液的氯氰菊酯农药的磷酸盐缓冲液为对照。用石油醚萃取3次，定容至10 ml，用气相色谱测定含量，求得酶对氯氰菊酯农药的降解率[6]。
1.6酶的最适反应pH值。配制pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的50 mM的磷酸氢二钠-柠檬酸盐缓冲液，pH值分别为7.5、8.0、8.5、9.0的50 mM的Tris-HCl缓冲液以及pH值分别为9.5、10.0、10.5、11.0的50 mM的磷酸氢钠-氢氧化钠缓冲液.将酶液分别加入到上述pH 4.0~11.0缓冲液中，按标准方法测定酶活力，以酶活最高者定为100 %，以相对活力对所对应的pH值作图。
1.7 酶的pH稳定性：同上配制pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0的50 mM的广泛缓冲液，将酶液分别加入到上述缓冲液中，42℃保温1 h后，按标准酶活力测定方法测定残余酶活力，以在最适反应pH下测得的酶活力定为100 %。以相对活力对所对应的pH值作图。
1.8酶的最适反应温度：将酶液和0.02M、pH6.2的磷酸盐缓冲液分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的不同温度的水浴中保温30 min，然后加入底物溶液按照标准方法测定酶活力，得到酶液在不同的反应温度下所具有的酶活力，以酶活力最高者定为100 %，以相对活力对温度作图。
1.9 酶的热稳定性：酶液分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的水浴中保温1h后，然后加入底物溶液按照标准方法测定残余酶活力，以未处理酶液的酶活定为100 %。以相对活力对保温时间作图。
1.10粗酶液中可溶性蛋白含量的测定：蛋白质含量测定，用Beckman蛋白核酸分析仪测定粗酶液中可溶性蛋白含量(OD280) 。
2结果
2.1菌株Klebsiella sp.ZD112的降解底物谱研究。菌株Klebsiella sp.ZD112对各种菊酯类农药都有比较好的降解能力（表1）,特别是对氯氰菊酯、甲氰菊酯的降解作用非常明显,而对氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯的降解作用不太明显,这可能菊酯类农药的化学结构不同所形成的。
表1 菌株Klebsiella sp. ZD112的降解底物谱研究
2.2 酶活性的定位：氯氰菊酯水解酶活性组分的定位是通过收集完整细胞、破碎细胞，然后分别测定细胞和上清的酶活力确定的。以完整细胞的酶活力为100 %，计算各组分的相对活力。结果表明，培养液的上清没有酶活性，说明菌株Klebsiella sp.ZD112产生的水解酶位于细胞内（表2）。
2.3酶反应的最适pH。实验结果表明，该酶的适宜pH范围在6.0~7.5之间,降解率都在80 %以上, 最适反应pH是6.5（图1）。
图1pH对Klebsiella sp.ZD112的氯氰菊酯水解酶的活性和稳定性的影响
（ □表示活性，●代表稳定性 ）
2.4酶在不同pH条件下的稳定性：酶在pH6.0~7.5范围内，42℃处理1 h后，仍保持酶活力达80 %以上，酶在偏酸性环境下较为稳定，结果（图1）。
2.5 酶的最适反应温度：该酶的适宜温度是40℃-55℃,最适反应温度是45℃（图2）。
图 2温度对Klebsiella sp.ZD112的氯氰菊酯水解酶的活性和稳定性的影响
（ □表示活性，●代表稳定性 ）
2.6 酶的热稳定性：酶的热稳定性测定结果表明(图2)，酶在45℃以下稳定性良好，50℃、60℃、70℃下保温lh，酶活力随着温度的升高而下降加剧，70℃下剩余最高酶活的12 %左右。
2.7粗酶液中可溶性蛋白含量的测定：粗酶液中可溶性蛋白含量的测定结果表明，粗酶液中可溶性蛋白含量为0.365 mg/ml。
2.8酶的动力学常数测定：经粗提酶的米氏常数Km和最大反应速率测定，做出酶對氯氰菊酯的Lineweaver-Burk图(图3)。其反应速率倒数(y)与底物浓度倒数(x)的线性方程为y = 0.0892x + 0.0087。因此酶对氯氰菊酯的米氏常数Km= 10.25μM，最大反应速率Vmax= 114.94μM/min。
图3菌株ZD112水解酶的Lineweaver-Burk图
3讨论
由于农药的微生物降解实质上就是酶促降解，而且酶可以在常温、常压等温和的反应条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也能顺利完成。因此从微生物中提取降解酶并在室内纯培养条件下研究菌株适宜的产酶条件，酶的提取纯化条件、粗酶液及纯酶的温度、pH稳定性及保持其降解活性的最适条件,对于农药降解酶的开发利用打下了很好的理论基础。
Klebsiella sp. ZD112产生的菊酯类农药降解酶具有较宽的pH适应范围和较好的热稳定性，可进一步进行酶的分离纯化和提取工艺的研究，为降解酶的应用开发打下基础。
参考文献
[1]虞云龙，樊德方等．农药微生物降解的研究现状与发展策略．环境科学进展， 1996，4：28 - 34
[2]郭杰炎，蔡武城．微生物酶．北京：科学技术出版社，1986
[3]郑善良，胡宝龙等．微生物学基础．北京：化学工业出版社，1992
[4]虞云龙，陈鹤鑫，樊德方等.拟除虫菊酯类杀虫剂的酶促降解,环境科学，1998，19(3):66-69
[5]虞云龙，盛国英，傅家漠.杀灭菊醋的微生物降解及酶促降解,环境科学，1997，18(2):5-8
作者单位：510006广东药学院基础学院1
510027中山大学生命科学院2
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
【关键词】菊酯农药；克雷伯氏菌；降解酶
Krey eldest brother fungus strain ZD112 chrysanthemum ester agricultural chemicals degeneration enzyme characteristic research
WANGZhuoya1LIUYuhuan2LIANGWeiqu2
【Abstract】Uses the microbial pesticide degeneration enzyme solution pesticide residue contamination concern is the current environmental science research hot spot, is also a new research area. This laboratory screens from the insecticide factory sludge to 1 can degrade the chrysanthemum ester agricultural chemicals strain Klebsiella sp. ZD112. The research discovery, outside the ZD112 butcher the thick enzyme fluid to the chlorine cyanogen chrysanthemum ester non-degeneration activeness, in the butcher the thick enzyme fluid is further high to the chlorine cyanogen chrysanthemum ester's degeneration potency. In the butcher the thick enzyme fluid degeneration chlorine cyanogen chrysanthemum ester optimum temperature is 45 ℃, most suitable pH is 6.5. Take the chlorine cyanogen chrysanthemum ester as the substrate, in the butcher the thick enzyme fluid Mie power constant (Km) is 10.25μM, the maximum reaction rate (Vmax) is 114.94μM/min.
【Key words】Chrysanthemum ester agricultural chemicals; Krey eldest brother fungus; Degeneration enzyme
擬除虫菊酯类杀虫剂在家庭卫生和农业生产中的应用已有四十多年的历史，其广泛应用所产生的大量积累和残留，造成环境污染，妨碍生物生长，并直接或间接地危害着人体健康[1]。发展一种有效方法消除或降低食品和环境中的菊酯农药残留已成为当前迫切需要解决的问题。目前广泛使用的拟除虫菊酯类杀虫剂具有光、热稳定性，在自然条件下不易发生降解，其在自然环境中的残留主要由微生物的活动来去除[2]。农药的生物降解实质上是在农药降解酶的作用下完成的[3]，与原始产酶菌剂比起来，农药降解酶制剂具有降解速度快，无毒副作用，更能耐受异常环境条件等多种优点[4,5]。
在过去的研究工作中，本实验室获得了一株能以菊酯为唯一碳源和氮源生长的伯雷克氏菌株Klebsiella sp. ZD112，鉴于直接应用农药降解酶制剂比应用产酶的菌剂更有优势，我们对ZD112所产菊酯农药降解酶特性进行了进一步的研究，以便为降解酶的进一步开发利用打下基础。
1材料和方法
1.1克雷伯氏菌株ZD112：由本实验室从污染地区采样筛选而得。
1.2培养基：各种培养基均按实验手册配制。
1.3菌株Klebsiella sp.ZD112 的降解底物谱研究。
1.4粗酶液的制备：取活化过的菌株接种于LB培养基(氯氰菊酯浓度为100 mg/ml)， 37℃，160 r/min培养2d后，10000 rpm离心10 min，上清液与菌体分开收集。其中上清液经硫酸铵沉淀（饱和度为85%）后4℃盐析过夜。12000 rpm离心15 min收集沉淀，用pH 6.2、0.02M的磷酸盐缓冲液溶解后用同一缓冲液透析至无SO42-得胞外粗酶液。收集的菌体，则用pH6.2、0.02M的磷酸盐缓冲液洗涤3次后，浓缩103倍溶于缓冲液中，配成菌悬液。用超声波破碎仪破碎3次,每次50sec,然后10000rpm离心10min，取上清液，得无细胞胞内粗酶液[6,7]。
1.5 酶活力的测定。
1.5.1由于无色的对硝基苯乙酸酯的水解产物之一是黄色的对硝基苯酚，该产物可在OD405nm测定，因此我们用对硝基苯乙酸酯来测定菌株Klebsiella sp.ZD112的降解酶活。反应体系:
酶(培养液)100 μl 对硝基苯乙酸酯溶液(20mM)100 μl 0.02M、pH6.2 磷酸缓冲液补足体积至1 ml 在42 ℃反应30 min后，测定反应的OD405值变化。酶活单位定义为：42 ℃时每毫升酶液(培养液)每分钟产生1 μM对硝基苯酚所需要的酶量[8]。
酶活力计算公式：酶活办（U）=A消光系数×10-6×t( A为反应体系在一定波长下的光吸收值，t为反应时间 )
1.5.2反应体系统一为:预热的一定pH的含氯氰菊酯农药50mg/L的磷酸盐缓冲液2.7 ml中，加预热粗酶液0.3 ml，其总体积为3 ml，42℃水浴中反应30 min后加0.2 ml,1.0M HCl溶液终止酶反应。每一处理重复3次，以不加酶液的氯氰菊酯农药的磷酸盐缓冲液为对照。用石油醚萃取3次，定容至10 ml，用气相色谱测定含量，求得酶对氯氰菊酯农药的降解率[6]。
1.6酶的最适反应pH值。配制pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的50 mM的磷酸氢二钠-柠檬酸盐缓冲液，pH值分别为7.5、8.0、8.5、9.0的50 mM的Tris-HCl缓冲液以及pH值分别为9.5、10.0、10.5、11.0的50 mM的磷酸氢钠-氢氧化钠缓冲液.将酶液分别加入到上述pH 4.0~11.0缓冲液中，按标准方法测定酶活力，以酶活最高者定为100 %，以相对活力对所对应的pH值作图。
1.7 酶的pH稳定性：同上配制pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0的50 mM的广泛缓冲液，将酶液分别加入到上述缓冲液中，42℃保温1 h后，按标准酶活力测定方法测定残余酶活力，以在最适反应pH下测得的酶活力定为100 %。以相对活力对所对应的pH值作图。
1.8酶的最适反应温度：将酶液和0.02M、pH6.2的磷酸盐缓冲液分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的不同温度的水浴中保温30 min，然后加入底物溶液按照标准方法测定酶活力，得到酶液在不同的反应温度下所具有的酶活力，以酶活力最高者定为100 %，以相对活力对温度作图。
1.9 酶的热稳定性：酶液分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的水浴中保温1h后，然后加入底物溶液按照标准方法测定残余酶活力，以未处理酶液的酶活定为100 %。以相对活力对保温时间作图。
1.10粗酶液中可溶性蛋白含量的测定：蛋白质含量测定，用Beckman蛋白核酸分析仪测定粗酶液中可溶性蛋白含量(OD280) 。
2结果
2.1菌株Klebsiella sp.ZD112的降解底物谱研究。菌株Klebsiella sp.ZD112对各种菊酯类农药都有比较好的降解能力（表1）,特别是对氯氰菊酯、甲氰菊酯的降解作用非常明显,而对氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯的降解作用不太明显,这可能菊酯类农药的化学结构不同所形成的。
表1 菌株Klebsiella sp. ZD112的降解底物谱研究
2.2 酶活性的定位：氯氰菊酯水解酶活性组分的定位是通过收集完整细胞、破碎细胞，然后分别测定细胞和上清的酶活力确定的。以完整细胞的酶活力为100 %，计算各组分的相对活力。结果表明，培养液的上清没有酶活性，说明菌株Klebsiella sp.ZD112产生的水解酶位于细胞内（表2）。
2.3酶反应的最适pH。实验结果表明，该酶的适宜pH范围在6.0~7.5之间,降解率都在80 %以上, 最适反应pH是6.5（图1）。
图1pH对Klebsiella sp.ZD112的氯氰菊酯水解酶的活性和稳定性的影响
（ □表示活性，●代表稳定性 ）
2.4酶在不同pH条件下的稳定性：酶在pH6.0~7.5范围内，42℃处理1 h后，仍保持酶活力达80 %以上，酶在偏酸性环境下较为稳定，结果（图1）。
2.5 酶的最适反应温度：该酶的适宜温度是40℃-55℃,最适反应温度是45℃（图2）。
图 2温度对Klebsiella sp.ZD112的氯氰菊酯水解酶的活性和稳定性的影响
（ □表示活性，●代表稳定性 ）
2.6 酶的热稳定性：酶的热稳定性测定结果表明(图2)，酶在45℃以下稳定性良好，50℃、60℃、70℃下保温lh，酶活力随着温度的升高而下降加剧，70℃下剩余最高酶活的12 %左右。
2.7粗酶液中可溶性蛋白含量的测定：粗酶液中可溶性蛋白含量的测定结果表明，粗酶液中可溶性蛋白含量为0.365 mg/ml。
2.8酶的动力学常数测定：经粗提酶的米氏常数Km和最大反应速率测定，做出酶對氯氰菊酯的Lineweaver-Burk图(图3)。其反应速率倒数(y)与底物浓度倒数(x)的线性方程为y = 0.0892x + 0.0087。因此酶对氯氰菊酯的米氏常数Km= 10.25μM，最大反应速率Vmax= 114.94μM/min。
图3菌株ZD112水解酶的Lineweaver-Burk图
3讨论
由于农药的微生物降解实质上就是酶促降解，而且酶可以在常温、常压等温和的反应条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也能顺利完成。因此从微生物中提取降解酶并在室内纯培养条件下研究菌株适宜的产酶条件，酶的提取纯化条件、粗酶液及纯酶的温度、pH稳定性及保持其降解活性的最适条件,对于农药降解酶的开发利用打下了很好的理论基础。
Klebsiella sp. ZD112产生的菊酯类农药降解酶具有较宽的pH适应范围和较好的热稳定性，可进一步进行酶的分离纯化和提取工艺的研究，为降解酶的应用开发打下基础。
参考文献
[1]虞云龙，樊德方等．农药微生物降解的研究现状与发展策略．环境科学进展， 1996，4：28 - 34
[2]郭杰炎，蔡武城．微生物酶．北京：科学技术出版社，1986
[3]郑善良，胡宝龙等．微生物学基础．北京：化学工业出版社，1992
[4]虞云龙，陈鹤鑫，樊德方等.拟除虫菊酯类杀虫剂的酶促降解,环境科学，1998，19(3):66-69
[5]虞云龙，盛国英，傅家漠.杀灭菊醋的微生物降解及酶促降解,环境科学，1997，18(2):5-8
作者单位：510006广东药学院基础学院1
510027中山大学生命科学院2
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。