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【摘 要】 目的：观察九龙虫对自然衰老大鼠卵巢氧自由基及凋亡相关蛋白的影响。方法：15月龄SD雌性大鼠随机分为模型组、阳性对照组、九龙虫低、中、高剂量组，4月龄大鼠为青年组。给药42d后，测定卵巢SOD、GSH-PX活性及MDA含量，采用免疫组织化学分析方法检测卵巢凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达。结果：与青年组比较，模型组SOD、GSH-PX活性和Bax表达降低，MDA含量和Bcl-2表达增加，差异有统计学意义（P<001），阳性对照组和九龙虫各剂量组的上述指标均得到改善。结论：九龙虫抗衰老作用可能通过改善卵巢氧自由基及凋亡相关蛋白表达而实现。
【关键词】 九龙虫；卵巢；氧自由基；凋亡相关蛋白
【中图分类号】R2855 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）05-0017-02
Effects of Jiulong Insect on Oxyen Free Radicals and Apoptosis-associated Protein of Ovary in Natural-aging Rats
ZHU Changguo1，PAN Chaowang2
1Ezhou third hospital，Ezhou 436000， China；2Ezhou Polytechnic，Ezhou 436000， China
Abstract：[WTHZ]Objective[WTBZ] To observe the effects of Jiulong insect on Oxyen free radicals and apoptosis-associated protein of ovary in natural-aging rats.[WTHZ]Methods[WTBZ] SD female rats of 15 months old were divided randomly into model group，positive control group，Jiulong Insect high dosage group，Jiulong Insect medium dosage group and Jiulong Insect low dosage group.SD female rats of 4 months old formed a youth group.42 days later，The activities of SOD and GSH-PX，content of MDA in ovary were measured，the expression of apoptosis-associated Bax and Bcl-2 were detected by immunocytochemistry.[WTHZ]Results[WTBZ] The SOD，GSH-PX and Bax were decreased，the MDA and Bcl-2 were increased in model group，compared with youth group（P<001）.The above index were ameliorated in treatment groups.[WTHZ]Conclusion[WTBZ] The anti-aging activity of Jiulong insect is achieved by improving the SOD，GSH-PX，Bax and lowering the MDA and Bcl-2 of ovary.
Keywords：Jiulong insectp；Ovary；Oxyen free radicals；apoptosis-associated protein
衰老是指机体各器官功能普遍的、逐渐降低的过程，对于女性而言，卵巢尤为明显。本实验旨在研究九龙虫对自然衰老大鼠卵巢氧自由基及凋亡相关蛋白的影响，探讨其延缓衰老机制。
1 材料与仪器
11 动物 SPF级SD雌性大鼠，由三峡大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鄂）2011-0012；4月龄10只，体重（200±20）g；15月龄50只，体重（350±30）g。
12 药品与试剂 九龙虫散（自制，用前配成混悬液）；维生素E（批号：20120422，海南养生堂保健品有限公司）；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）试剂盒（批号：20120516）、考马斯亮蓝试剂盒（批号：20120409）、超氧化物歧化酶（SOD ）试剂盒（批号：20120314）、丙二醛（MDA）试剂盒（批号：20120324）均购自南京建成生物工程研究所；SP免疫组织化学检测试剂盒（上海研卉生物科技有限公司）；DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
13 仪器 UV754紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；高速离心机（上海安亭科学仪器公司）；超薄切片机（上海五相仪器仪表有限公司）。
2 方法
21 动物造模及分组给药 50只15月龄雌性老龄模型大鼠，随机分为模型组、阳性对照组、九龙虫低剂量、九龙虫中剂量、九龙虫高剂量组，每组10只；4月龄大鼠为青年组。九龙虫低、中、高剂量组灌胃给予九龙虫混悬液0007、0014、0028g/（kg·d），阳性对照组给予维生素E 15mg/（kg·d），模型组、青年组给予生理盐水15ml/（kg·d），连续42d。末次给药24h后，称重，进行相应指标检测。
22 卵巢SOD、GSH-PX活性及MDA含量的测定 将大鼠用3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，取左侧卵巢，称重后加9倍重量生理盐水制备匀浆，按试剂盒说明进行SOD、GSH-PX活力和MDA含量的测定。 23 卵巢凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的测定 取大鼠右侧卵巢，立即用10%甲醛液固定，石蜡包埋切片，片厚5μm。按照试剂盒说明书步骤作SP法免疫组化染色。以PBS替代一抗作为阴性对照。细胞浆有棕黄色弥散细颗粒者为阳性反应细胞。每张切片随机选取组织结构保存较好的部位，选取10个视野计数。采用 Motic60数据医学图像分析系统进行光密度法分析。
24 统计学处理 数据用SPSS160软件进行统计处理，各实验组数据均采用均数±标准差（x±s）表示，用t检验，P<005时表示差异有统计学意义。
3 结果
31 对卵巢SOD、GSH-PX活性及MDA含量的影响 与青年组比较，模型组SOD、GSH-PX活性降低，MDA含量升高，差异有高度统计学意义（P<001）；阳性对照组和九龙虫各剂量组与模型组比较，SOD、GSH-PX活力升高，MDA含量降低（P<005或P<001）。见表1。
32 对卵巢凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的影响 与青年组比较，模型组Bcl-2降低，Bax升高，差异有高度统计学意义（P<001）；阳性对照组和九龙虫各剂量组与模型组比较，Bcl-2升高，Bax降低（P<005或P<001）。见表2。
4 讨论
卵巢作为女性的性腺，在维持正常生育功能的同时，对女性的生长发育、抵御疾病等方面具有非常重要的作用，女性机体衰老是从卵巢衰老开始的。衰老的自由基学说为目前国际学术界所公认，有研究证明[1]，衰老小鼠卵巢SOD活性较正常小鼠明显降低，MDA含量则明显升高；氧自由基的变化可促使活性氧对蛋白、膜脂和DNA的损伤，在不同程度上引起卵巢功能的减退[2]。本研究表明，与青年大鼠相比，老年大鼠卵巢SOD、GSH-PX活性明显降低，而MDA含量则明显升高，并发现九龙虫可以抑制老年大鼠卵巢SOD、GSH-PX活性的降低，并能降低MDA含量。
B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）蛋白家族是一个特别的家族，目前已发现20多种Bcl-2家族同源蛋白，根据功能不同分为两组，一组为促凋亡蛋白，如Bax、Bid等，另一组为抗凋亡蛋白，如Bcl-2、Bcl-x等[3]。Bcl-2通过编码蛋白发挥调控作用，是重要的凋亡抑制基因，可与Bax形成能阻遏细胞凋亡异源二聚体。Bax过量表达时，可自身结合成同源二聚体，促进凋亡的发生。李亚丽[4]等研究表明，D-半乳糖衰老大鼠较正常大鼠卵巢细胞Bcl-2表达量减少，Bax表达量增加，提示衰老可能跟促进卵巢细胞凋亡有关；我们对自然衰老大鼠的研究也得到同样结果，并发现九龙虫促进Bcl-2表达，抑制Bax表达。
综上所述，九龙虫可通过影响卵巢氧自由基的产生及凋亡相关蛋白的表达，增加SOD、GSH-PX活性和Bax表达，减少MDA含量和Bcl-2表达而起到抗衰老作用。
参考文献
[1]敖恩宝力格，包秋华，王金妞，等.蒙药高尤-9对衰老大鼠卵巢抗氧化活性及端粒酶活性的影响[J].中国老年学杂志，2011，31（20）：3997-3999.
[2]St-Pierre J，Buckinghan JA，Roebuck SJ，et al.Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain [J].J Biol Chem，2002，277（47）：44784.
[3]Xu D，Wang Z N，Zhu W J，et al.Effects of local testicular heating on Bcl-2 and Bax protein expression in spermatogenic cells in rats [J].J Reprod Contrac，2005，16（1）：23-28.
[4]李亚丽，楚伟，王方娜，等.何首乌饮对衰老大鼠卵巢组织凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2及Caspase-3表达的影响[J].中国新药杂志，2011，20（18）：1791-1794.
（收稿日期：20141205）
【关键词】 九龙虫；卵巢；氧自由基；凋亡相关蛋白
【中图分类号】R2855 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）05-0017-02
Effects of Jiulong Insect on Oxyen Free Radicals and Apoptosis-associated Protein of Ovary in Natural-aging Rats
ZHU Changguo1，PAN Chaowang2
1Ezhou third hospital，Ezhou 436000， China；2Ezhou Polytechnic，Ezhou 436000， China
Abstract：[WTHZ]Objective[WTBZ] To observe the effects of Jiulong insect on Oxyen free radicals and apoptosis-associated protein of ovary in natural-aging rats.[WTHZ]Methods[WTBZ] SD female rats of 15 months old were divided randomly into model group，positive control group，Jiulong Insect high dosage group，Jiulong Insect medium dosage group and Jiulong Insect low dosage group.SD female rats of 4 months old formed a youth group.42 days later，The activities of SOD and GSH-PX，content of MDA in ovary were measured，the expression of apoptosis-associated Bax and Bcl-2 were detected by immunocytochemistry.[WTHZ]Results[WTBZ] The SOD，GSH-PX and Bax were decreased，the MDA and Bcl-2 were increased in model group，compared with youth group（P<001）.The above index were ameliorated in treatment groups.[WTHZ]Conclusion[WTBZ] The anti-aging activity of Jiulong insect is achieved by improving the SOD，GSH-PX，Bax and lowering the MDA and Bcl-2 of ovary.
Keywords：Jiulong insectp；Ovary；Oxyen free radicals；apoptosis-associated protein
衰老是指机体各器官功能普遍的、逐渐降低的过程，对于女性而言，卵巢尤为明显。本实验旨在研究九龙虫对自然衰老大鼠卵巢氧自由基及凋亡相关蛋白的影响，探讨其延缓衰老机制。
1 材料与仪器
11 动物 SPF级SD雌性大鼠，由三峡大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（鄂）2011-0012；4月龄10只，体重（200±20）g；15月龄50只，体重（350±30）g。
12 药品与试剂 九龙虫散（自制，用前配成混悬液）；维生素E（批号：20120422，海南养生堂保健品有限公司）；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）试剂盒（批号：20120516）、考马斯亮蓝试剂盒（批号：20120409）、超氧化物歧化酶（SOD ）试剂盒（批号：20120314）、丙二醛（MDA）试剂盒（批号：20120324）均购自南京建成生物工程研究所；SP免疫组织化学检测试剂盒（上海研卉生物科技有限公司）；DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
13 仪器 UV754紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；高速离心机（上海安亭科学仪器公司）；超薄切片机（上海五相仪器仪表有限公司）。
2 方法
21 动物造模及分组给药 50只15月龄雌性老龄模型大鼠，随机分为模型组、阳性对照组、九龙虫低剂量、九龙虫中剂量、九龙虫高剂量组，每组10只；4月龄大鼠为青年组。九龙虫低、中、高剂量组灌胃给予九龙虫混悬液0007、0014、0028g/（kg·d），阳性对照组给予维生素E 15mg/（kg·d），模型组、青年组给予生理盐水15ml/（kg·d），连续42d。末次给药24h后，称重，进行相应指标检测。
22 卵巢SOD、GSH-PX活性及MDA含量的测定 将大鼠用3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，取左侧卵巢，称重后加9倍重量生理盐水制备匀浆，按试剂盒说明进行SOD、GSH-PX活力和MDA含量的测定。 23 卵巢凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的测定 取大鼠右侧卵巢，立即用10%甲醛液固定，石蜡包埋切片，片厚5μm。按照试剂盒说明书步骤作SP法免疫组化染色。以PBS替代一抗作为阴性对照。细胞浆有棕黄色弥散细颗粒者为阳性反应细胞。每张切片随机选取组织结构保存较好的部位，选取10个视野计数。采用 Motic60数据医学图像分析系统进行光密度法分析。
24 统计学处理 数据用SPSS160软件进行统计处理，各实验组数据均采用均数±标准差（x±s）表示，用t检验，P<005时表示差异有统计学意义。
3 结果
31 对卵巢SOD、GSH-PX活性及MDA含量的影响 与青年组比较，模型组SOD、GSH-PX活性降低，MDA含量升高，差异有高度统计学意义（P<001）；阳性对照组和九龙虫各剂量组与模型组比较，SOD、GSH-PX活力升高，MDA含量降低（P<005或P<001）。见表1。
32 对卵巢凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的影响 与青年组比较，模型组Bcl-2降低，Bax升高，差异有高度统计学意义（P<001）；阳性对照组和九龙虫各剂量组与模型组比较，Bcl-2升高，Bax降低（P<005或P<001）。见表2。
4 讨论
卵巢作为女性的性腺，在维持正常生育功能的同时，对女性的生长发育、抵御疾病等方面具有非常重要的作用，女性机体衰老是从卵巢衰老开始的。衰老的自由基学说为目前国际学术界所公认，有研究证明[1]，衰老小鼠卵巢SOD活性较正常小鼠明显降低，MDA含量则明显升高；氧自由基的变化可促使活性氧对蛋白、膜脂和DNA的损伤，在不同程度上引起卵巢功能的减退[2]。本研究表明，与青年大鼠相比，老年大鼠卵巢SOD、GSH-PX活性明显降低，而MDA含量则明显升高，并发现九龙虫可以抑制老年大鼠卵巢SOD、GSH-PX活性的降低，并能降低MDA含量。
B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）蛋白家族是一个特别的家族，目前已发现20多种Bcl-2家族同源蛋白，根据功能不同分为两组，一组为促凋亡蛋白，如Bax、Bid等，另一组为抗凋亡蛋白，如Bcl-2、Bcl-x等[3]。Bcl-2通过编码蛋白发挥调控作用，是重要的凋亡抑制基因，可与Bax形成能阻遏细胞凋亡异源二聚体。Bax过量表达时，可自身结合成同源二聚体，促进凋亡的发生。李亚丽[4]等研究表明，D-半乳糖衰老大鼠较正常大鼠卵巢细胞Bcl-2表达量减少，Bax表达量增加，提示衰老可能跟促进卵巢细胞凋亡有关；我们对自然衰老大鼠的研究也得到同样结果，并发现九龙虫促进Bcl-2表达，抑制Bax表达。
综上所述，九龙虫可通过影响卵巢氧自由基的产生及凋亡相关蛋白的表达，增加SOD、GSH-PX活性和Bax表达，减少MDA含量和Bcl-2表达而起到抗衰老作用。
参考文献
[1]敖恩宝力格，包秋华，王金妞，等.蒙药高尤-9对衰老大鼠卵巢抗氧化活性及端粒酶活性的影响[J].中国老年学杂志，2011，31（20）：3997-3999.
[2]St-Pierre J，Buckinghan JA，Roebuck SJ，et al.Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain [J].J Biol Chem，2002，277（47）：44784.
[3]Xu D，Wang Z N，Zhu W J，et al.Effects of local testicular heating on Bcl-2 and Bax protein expression in spermatogenic cells in rats [J].J Reprod Contrac，2005，16（1）：23-28.
[4]李亚丽，楚伟，王方娜，等.何首乌饮对衰老大鼠卵巢组织凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2及Caspase-3表达的影响[J].中国新药杂志，2011，20（18）：1791-1794.
（收稿日期：20141205）