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摘要：目的建立注射用重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基（rhCNB）成品鉴别试验方法，进行方法学验证并進行多批样品检测；方法：参考《中国药典》2010年版三部附录Ⅷ A免疫印迹法建立本品抗原特异性鉴别方法。结果：本方法专属性、耐用性良好；结论：本法适用于重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基成品鉴别试验项检测。
关键词：免疫印迹法；重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基（rhCNB）；鉴别试验；
【中图分类号】-3 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2019）02-148-02
前言
钙调蛋白磷酸酶B亚基（CNB）是钙调蛋白磷酸酶（Calcineurin，CN）的调节亚基。rhCNB新药项目由海口奇力制药和北京师范大学联合开发，参考中国药典收载的注射用重组人白介素等同类品种的质量标准，鉴别试验项是此类重组生物制品必控质量项目，本文探讨该项方法的建立、方法学验证及样品检测应用。
一、材料与试剂
仪器：伯乐公司PowerPac Basic基础型电泳仪、伯乐公司Mini-Protean Tetra小型垂直电泳、伯乐公司Trans-Blot转印槽、上海嘉鹏ZF-258凝胶成像系统；试剂：牛血清白蛋白、Tris、甘氨酸、甲醇、氯化钠、盐酸、聚山梨酯80，均为分析纯；供试品：6批注射用重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基，均为海口奇力研发中心制备；对照品：重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基，为海口奇力自制。
二、实验方法
1、溶液配制
TG缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷15.12g，甘氨酸72g，加水溶解并稀释至500ml，4℃保存。
EBM缓冲液：量取TG缓冲液20ml，加甲醇40ml，再加水稀释至200ml，4℃保存
TTBS缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，氯化钠4.5g，量取聚山梨酯80 0.55ml，加适量水溶解，用盐酸调pH值至7.5，加水稀释至500ml，4℃保存。
封闭液：含10%牛白蛋白的TTBS缓冲液。
供试品溶液：取供试品1瓶加入灭菌注射用水适量复溶并转移至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，量取该溶液30?l，置1.5ml EP管中，加入供试品缓冲液10?l，混匀，即得供试品溶液。
对照品溶液：取重组人钙调蛋白磷酸酶B对照品1瓶，量取适量加水定量稀释制成蛋白浓度为0.2 mg/ml的溶液，量取该溶液30?l，置1.5mlEP管中，加入供试品缓冲液10?l，混匀，即得对照品溶液。
2、测定法
电泳：照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，供试品与阳性对照品上样量为1?g。
转膜：①电泳结束后把胶小心剥离玻璃板，切去凝胶边缘。放入已准备好的浸泡于EBM缓冲液中30分钟。②准备1张硝酸纤维素膜（以下称NC膜），剪成与胶同样大小、2张厚滤纸，用EBM缓冲液浸泡1分钟。③按转膜装置阴极板、垫层纱布、厚滤纸、电泳凝胶、NC膜、厚滤纸、垫层纱布、阳极板的顺序把装置装好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，并去除气泡，夹紧。④装入转印槽，放入冷却盒。倒入约1000mlEBM缓冲液，以恒流80mA的条件电转45min。
免疫检测：①把已转好的膜放入封闭液中室温封闭60分钟。②弃去封闭液，加入一抗溶液[取rhCNB抗体1支，加水200?l溶解，混匀，量取50?l，置烧杯中，加入TTBS缓冲液5ml，混匀即得。室温过夜。③弃去一抗溶液，用TTBS缓冲液淋洗NC膜1次，再用TTBS缓冲液洗膜3次，每次8分钟；再加入用TTBS缓冲液稀释好的二抗1支，取5μl，置小烧杯中，加入TTBS缓冲液4ml，混匀即得，室温放置40min。④用TTBS缓冲液淋洗NC膜1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟；⑤取DAB试剂盒中HRP反应缓冲液1ml，试剂A、试剂B、试剂C各50?l，混匀于烧杯，放入NC膜，避光显色15分钟。
扫描与结果保存：显色后使用凝胶成像系统按其标准操作规程扫描并保存结果图像，NC膜室温晾干并贴于检验记录相关区域。
结果判断：阳性结果应呈现明显条带，阴性结果无条带。
三、方法建立及方法学验证
1、供试品抗体稀释度、HRP标记抗体稀释度、供试品点样量预试验
【供试品单克隆抗体稀释度试验】委托南京金斯瑞生物科技有限公司制备rhCNB单克隆抗体，按《中国药典》2010年版三部附录Ⅷ A免疫印迹法进行试验。试验结果表明，1.025μg/ml至8.20μg/ml浓度的一抗均能显色，抗体浓度为4.1μg/ml和8.2μg/ml的图谱显示效果较好，选择4.1μg/ml为本法一抗稀释浓度。
【供试品点样量选择试验】根据《中国药典》的要求，供试品与阳性对照品上样量应大于100ng，为了得到准确、清晰、可靠的检测结果，以0.2?g、0.5?g、1.0?g、1.5?g、2.0?g供试品点样量分别试验。结果表明，点样量为1.0?g结果条带清晰，大小适中，确定本法供试品点样量为1.0?g。
2、方法学验证
【专属性试验】配制对照品、供试品及无rhCNB的牛白蛋白溶液，依本法测定，记录结果。试液配制方法：①供试品溶液的制备：取供试品1瓶，加入灭菌注射用水溶解并转移至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，量取该溶液30?l，置1.5ml EP管中，加入4×非还原型供试品缓冲液10?l，混匀即得供试品溶液。②对照品溶液的制备：取rhCNB工作对照品1瓶，加水溶解并转移至100ml量瓶中，加水稀释至刻度，制得蛋白浓度为0.2mg/ml的溶液，量取该溶液30?l，置1.5ml EP管中，加入非还原型供试品缓冲液（4×）10?l，混匀即得对照品溶液。③按本品制剂处方配制不含rhCNB的溶液，加入牛白蛋白制成无rhCNB的牛白蛋白溶液量取该溶液30?l，置EP管中，加入4×非还原型缓冲液10?l，混匀，制得牛白蛋白对照溶液。 检测结果显示rhCNB对照品与供试品均能有效检出条带，结果为阳性，白蛋白不显色，结果为阴性，满足专属性试验要求。
【耐用性试验】
设置一抗浓度0.45?g/ml（正常浓度的90%）、0.55?g/ml两个浓度。免疫检测：①把已转好的膜放入封闭液中封闭60分钟。②弃去封闭液，分别加入一抗溶液（取rhCNB抗体2支，各加水200?l复溶，混匀，分别量取4.45?l、5.44?l，各置小烧杯中，各加入TTBS缓冲液5ml，混匀制得一抗浓度分别为0.45?g/ml、0.55?g/ml。）室温过夜。③弃去一抗，用TTBS缓冲液淋洗NC膜1次，再用TTBS缓冲液洗膜3次，每次8分钟；再加入用TTBS缓冲液稀释好的二抗（取分装好的二抗（羊抗小鼠）2支，各取5μl，置小烧杯中，各加入TTBS缓冲液4ml，混匀即得），室温放置40分钟。④用TTBS缓冲液淋洗NC膜1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟；⑤取DAB试剂盒中HRP反应缓冲液2ml，试剂A、试剂B、试剂C各100?l，混匀于烧杯，放入NC膜，避光显色15分钟。
结果表明，抗体配制浓度偏差±10%，对检测结果无明显影响，耐用性良好。
【方法学验证结果】rhCNB免疫印迹法鉴别试验有良好专属性和耐用性，适用成品鉴别项检查。
3、注射用rhCNB成品鉴别试验检测结果
按本法检测连续6批注射用rhCNB鉴别试验。结果均呈阳性，均符合本品《制造与检定规程》（草案）的规定。
四、讨论
根据《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》【6】的要求，并参照国内已上市重组蛋白类药物，如注射用重组人干扰素α2a、重组人白介素-2注射液、注射用重组人粒细胞刺激因子等，均建有鉴别试验检查项，方法为免疫印迹法或免疫斑点法。
按《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》进行该方法的专属性、耐用性验证，验证结果良好。6批注射用rhCNB样品检测结果呈阳性，均符合本品《制造与检定规程》（草案）的规定。
五、结论
该专属性、耐用性良好，适用于注射用rhCNB成品制剂鉴别试验检测。
参考文献
[1] 國家药品审评中心[S]GPH1-1《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》
[2] 含有钙调神经磷酸酶B亚基的药物组合物 中国专利
[3] 中国药典.三部[S].2010.
[4] 《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》 药审中心 2003年
关键词：免疫印迹法；重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基（rhCNB）；鉴别试验；
【中图分类号】-3 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2019）02-148-02
前言
钙调蛋白磷酸酶B亚基（CNB）是钙调蛋白磷酸酶（Calcineurin，CN）的调节亚基。rhCNB新药项目由海口奇力制药和北京师范大学联合开发，参考中国药典收载的注射用重组人白介素等同类品种的质量标准，鉴别试验项是此类重组生物制品必控质量项目，本文探讨该项方法的建立、方法学验证及样品检测应用。
一、材料与试剂
仪器：伯乐公司PowerPac Basic基础型电泳仪、伯乐公司Mini-Protean Tetra小型垂直电泳、伯乐公司Trans-Blot转印槽、上海嘉鹏ZF-258凝胶成像系统；试剂：牛血清白蛋白、Tris、甘氨酸、甲醇、氯化钠、盐酸、聚山梨酯80，均为分析纯；供试品：6批注射用重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基，均为海口奇力研发中心制备；对照品：重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基，为海口奇力自制。
二、实验方法
1、溶液配制
TG缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷15.12g，甘氨酸72g，加水溶解并稀释至500ml，4℃保存。
EBM缓冲液：量取TG缓冲液20ml，加甲醇40ml，再加水稀释至200ml，4℃保存
TTBS缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，氯化钠4.5g，量取聚山梨酯80 0.55ml，加适量水溶解，用盐酸调pH值至7.5，加水稀释至500ml，4℃保存。
封闭液：含10%牛白蛋白的TTBS缓冲液。
供试品溶液：取供试品1瓶加入灭菌注射用水适量复溶并转移至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，量取该溶液30?l，置1.5ml EP管中，加入供试品缓冲液10?l，混匀，即得供试品溶液。
对照品溶液：取重组人钙调蛋白磷酸酶B对照品1瓶，量取适量加水定量稀释制成蛋白浓度为0.2 mg/ml的溶液，量取该溶液30?l，置1.5mlEP管中，加入供试品缓冲液10?l，混匀，即得对照品溶液。
2、测定法
电泳：照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，供试品与阳性对照品上样量为1?g。
转膜：①电泳结束后把胶小心剥离玻璃板，切去凝胶边缘。放入已准备好的浸泡于EBM缓冲液中30分钟。②准备1张硝酸纤维素膜（以下称NC膜），剪成与胶同样大小、2张厚滤纸，用EBM缓冲液浸泡1分钟。③按转膜装置阴极板、垫层纱布、厚滤纸、电泳凝胶、NC膜、厚滤纸、垫层纱布、阳极板的顺序把装置装好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，并去除气泡，夹紧。④装入转印槽，放入冷却盒。倒入约1000mlEBM缓冲液，以恒流80mA的条件电转45min。
免疫检测：①把已转好的膜放入封闭液中室温封闭60分钟。②弃去封闭液，加入一抗溶液[取rhCNB抗体1支，加水200?l溶解，混匀，量取50?l，置烧杯中，加入TTBS缓冲液5ml，混匀即得。室温过夜。③弃去一抗溶液，用TTBS缓冲液淋洗NC膜1次，再用TTBS缓冲液洗膜3次，每次8分钟；再加入用TTBS缓冲液稀释好的二抗1支，取5μl，置小烧杯中，加入TTBS缓冲液4ml，混匀即得，室温放置40min。④用TTBS缓冲液淋洗NC膜1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟；⑤取DAB试剂盒中HRP反应缓冲液1ml，试剂A、试剂B、试剂C各50?l，混匀于烧杯，放入NC膜，避光显色15分钟。
扫描与结果保存：显色后使用凝胶成像系统按其标准操作规程扫描并保存结果图像，NC膜室温晾干并贴于检验记录相关区域。
结果判断：阳性结果应呈现明显条带，阴性结果无条带。
三、方法建立及方法学验证
1、供试品抗体稀释度、HRP标记抗体稀释度、供试品点样量预试验
【供试品单克隆抗体稀释度试验】委托南京金斯瑞生物科技有限公司制备rhCNB单克隆抗体，按《中国药典》2010年版三部附录Ⅷ A免疫印迹法进行试验。试验结果表明，1.025μg/ml至8.20μg/ml浓度的一抗均能显色，抗体浓度为4.1μg/ml和8.2μg/ml的图谱显示效果较好，选择4.1μg/ml为本法一抗稀释浓度。
【供试品点样量选择试验】根据《中国药典》的要求，供试品与阳性对照品上样量应大于100ng，为了得到准确、清晰、可靠的检测结果，以0.2?g、0.5?g、1.0?g、1.5?g、2.0?g供试品点样量分别试验。结果表明，点样量为1.0?g结果条带清晰，大小适中，确定本法供试品点样量为1.0?g。
2、方法学验证
【专属性试验】配制对照品、供试品及无rhCNB的牛白蛋白溶液，依本法测定，记录结果。试液配制方法：①供试品溶液的制备：取供试品1瓶，加入灭菌注射用水溶解并转移至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，量取该溶液30?l，置1.5ml EP管中，加入4×非还原型供试品缓冲液10?l，混匀即得供试品溶液。②对照品溶液的制备：取rhCNB工作对照品1瓶，加水溶解并转移至100ml量瓶中，加水稀释至刻度，制得蛋白浓度为0.2mg/ml的溶液，量取该溶液30?l，置1.5ml EP管中，加入非还原型供试品缓冲液（4×）10?l，混匀即得对照品溶液。③按本品制剂处方配制不含rhCNB的溶液，加入牛白蛋白制成无rhCNB的牛白蛋白溶液量取该溶液30?l，置EP管中，加入4×非还原型缓冲液10?l，混匀，制得牛白蛋白对照溶液。 检测结果显示rhCNB对照品与供试品均能有效检出条带，结果为阳性，白蛋白不显色，结果为阴性，满足专属性试验要求。
【耐用性试验】
设置一抗浓度0.45?g/ml（正常浓度的90%）、0.55?g/ml两个浓度。免疫检测：①把已转好的膜放入封闭液中封闭60分钟。②弃去封闭液，分别加入一抗溶液（取rhCNB抗体2支，各加水200?l复溶，混匀，分别量取4.45?l、5.44?l，各置小烧杯中，各加入TTBS缓冲液5ml，混匀制得一抗浓度分别为0.45?g/ml、0.55?g/ml。）室温过夜。③弃去一抗，用TTBS缓冲液淋洗NC膜1次，再用TTBS缓冲液洗膜3次，每次8分钟；再加入用TTBS缓冲液稀释好的二抗（取分装好的二抗（羊抗小鼠）2支，各取5μl，置小烧杯中，各加入TTBS缓冲液4ml，混匀即得），室温放置40分钟。④用TTBS缓冲液淋洗NC膜1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟；⑤取DAB试剂盒中HRP反应缓冲液2ml，试剂A、试剂B、试剂C各100?l，混匀于烧杯，放入NC膜，避光显色15分钟。
结果表明，抗体配制浓度偏差±10%，对检测结果无明显影响，耐用性良好。
【方法学验证结果】rhCNB免疫印迹法鉴别试验有良好专属性和耐用性，适用成品鉴别项检查。
3、注射用rhCNB成品鉴别试验检测结果
按本法检测连续6批注射用rhCNB鉴别试验。结果均呈阳性，均符合本品《制造与检定规程》（草案）的规定。
四、讨论
根据《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》【6】的要求，并参照国内已上市重组蛋白类药物，如注射用重组人干扰素α2a、重组人白介素-2注射液、注射用重组人粒细胞刺激因子等，均建有鉴别试验检查项，方法为免疫印迹法或免疫斑点法。
按《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》进行该方法的专属性、耐用性验证，验证结果良好。6批注射用rhCNB样品检测结果呈阳性，均符合本品《制造与检定规程》（草案）的规定。
五、结论
该专属性、耐用性良好，适用于注射用rhCNB成品制剂鉴别试验检测。
参考文献
[1] 國家药品审评中心[S]GPH1-1《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》
[2] 含有钙调神经磷酸酶B亚基的药物组合物 中国专利
[3] 中国药典.三部[S].2010.
[4] 《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》 药审中心 2003年