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摘要：
目的：对依替巴肽注射液的细菌内毒素检查方法进行探讨，建立其细菌内毒素检查方法。方法：按《中国药典2010》二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查方法进行。结果：在验证条件下，依替巴肽注射液可以采用稀释方法排除干扰。结论：可以采用此法对本品的细菌内毒素进行检查。
关键词：依替巴肽注射液；细菌内毒素方法；验证
Research of Bacterial Endotoxin Method for Eptifibatide Injection
JIN Aimin， WANG Chunling， WANG Cuiling， LI Qin， HU Chunyong （Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang， Jiangsu， 222000）
Abstract：
Objective： Research and establish bacterial endotoxin method for Eptifibatide Injection. Method： Test according to Appendix XI E test for bacterial endotoxin in the 2010 Edition of Chinese Pharmacopeia Volume II. Result： Under validation conditions， the dilution method can be used to eliminate the interference in the test of Eptifibatide Injection. Conclusion： This method can be used to test the bacterial endotoxin in Eptifibatide Injection.
Key words： Eptifibatide Injection， Bacterial Endotoxin Method， Validation
【中图分类号】
R453 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）06-0047-02
急性冠脉综合症（Acute coronary syndromes，ACS）是血小板功能过度激活而产生的血栓性事件。根据临床症状主要分为不稳定型心绞痛（Unstable angina pectoris，UAP）、非ST段抬高心梗死（Non-ST-elevation myocardial infarction，NSTEMI）及ST段抬高心肌梗死（ST-elevation myocardial infarction，STEMI）[1-3]。冠状动脉血管斑块破裂或血管内皮被侵蚀而引起的血栓栓塞是促发ACS的主要原因，可发生于多个部位。由于ACS发病急，并且导致病情不稳定因素多，导致此病较难控制，现已成为严重影响人类生存质量的疾病之一[4]。依替巴肽为特异性GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂，通过与血小板膜上GPⅡb/Ⅲa受体结合，占据了其上的结合位点，使血小板GPⅡb/Ⅲa受体不能与纤维蛋白原结合，从而抑制了血小板聚集。由于依替巴肽阻滞了血小板聚集的最后共同途径，具有抗血小板作用强、起效快、不良反应少等优点，因此对依替巴肽注射液的研究，可满足国内急性冠脉综合症状病人的需要，填补国内空白，具有较好的社会效益和经济效益。无菌检查、细菌内毒素、微生物限度检查是药品安全性检查的重要项目[5]，本品为注射剂按照中国药典2010版附录ⅠB[6]的要求，为了更加有效的保障患者用药安全，本品要进行细菌内毒素检查。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器：Ms3digital旋涡混合器，CJ-2F净化工作台，DK-600S电热恒温水槽，DMH-1电热干燥箱。
1.1.2 试剂：鲎试剂1【规格0.06EU/ml（0.1ml/支）批号11080611】福州新北生化工业有限公司；鲎试剂2【规格0.06EU/ml（0.1ml/支）批号1110122】湛江海洋生物制品有限公司；鲎试验用水【50ml/支批号11010305】福州新北生化工业有限公司；细菌内毒素工作标准品【规格180EU/支批号150601-200965】中国药品生物制品检定所；pH调节剂【规格2ml/支批号110904】福州新北生化工业有限公司。
1.2 方法
1.2.1 试验准备：所有容器、用具都必须经过处理，去除外源性内毒素，玻璃仪器于250℃干烤至少1小时，塑料用具须确证不干扰实验结果。操作过程中避免微生物污染。初次使用的鲎试剂必须经过灵敏度复核[7]。通过测评及计算依替巴肽注射液（100ml：75mg）的细菌内毒素限值暂定为L<0.5EU/mg。
1.2.2 鲎试剂灵敏度复核： 按《中国药典》2010版二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法规定，进行鲎试剂的标示灵敏度复核，二批鲎试剂经用细菌内毒素工作标准品检查λc与λ一致（应在0.5λ≤λc≤2λ范围内），结果均符合规定。
1.2.3 依替巴肽注射液（10ml：20mg、100ml：75mg）对细菌内毒素检查干扰试验
1.2.3.1 干扰预试验（鲎试剂：λ=0.06EU/ml）：取本品，加BET水进行供试品溶液（NPC）和供试品阳性对照溶液（PPC）的配制。
1.2.3.1.1 供试品溶液（NPC）配制：取三个批号的供试品（100ml：75mg），BET水及pH调节剂制备成38.mg/ml、18.75mg/ml、9.375mg/ml、6.25mg/ml共四个浓度。 1.2.3.1.2 细菌内毒素工作标准品溶液稀释方法：用1ml的鲎试验用水溶解1支细菌内毒素工作标准品，用旋涡混合器连续混合15分钟，成150EU/ml，用鲎试验用水稀释成4λ、2λ，在进行下一步稀释前，至少混和30秒。
1.2.3.1.3 供试品阳性对照溶液（PPC）的配制：配制的浓度同上，每个浓度中含2λ（0.125EU/ml）的细菌内毒素，制备成38.mg/ml+2λ、18.75mg/ml+2λ、9.375mg/ml+2λ、6.25mg/ml+2λ共四个浓度。
1.2.3.1.4 试验过程： 取上述二个厂家的鲎试剂各64支，先分别加入0.1mlBET水溶解，再分别加入0.1ml供试品和供试品阳性各浓度稀释液，混匀后，于37±1℃无振动保温60± 2分钟，同时设阴性和阳性对照，每个浓度平行做2管。
结果表明，依替巴肽注射液（100ml：75mg）在18.75mg/ml以下稀释度时，对以上二个厂家的鲎试剂均未产生干扰作用。故18.75mg/ml稀释度为最小不干扰稀释倍数。根据依替巴肽注射液（100ml：75mg）的试验结果，依替巴肽注射液（100ml：75mg）选取15mg/ml稀释液作为细菌内毒素检查的供试品溶液浓度。
1.2.3.2 供试品的干扰试验：
为进一步确证供试品溶液对0.06EU/ml的鲎试剂是否存在干扰作用，分别用BET水和供试品15mg/ml稀释液进行实验，将细菌内毒素工作标准品配制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的系列内毒素溶液。
1.2.3.2.1 供试品15mg/ml稀释液的制备： 取上述三个批号的供试品，分别用BET水稀释成15mg/ml供试液。
1.2.3.2.2试验过程（鲎试剂：λ=0.06EU/ml）：——用BET水与15mg/ml供试液分别将细菌内毒素工作标准品稀释成0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml、0.015EU/ml四个浓度，作为细菌内毒素标准品溶液和细菌内毒素供试品溶液。
——取上述二个厂家的鲎试剂各72支，每支分别用0.1mlBET水溶解，再加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ的细菌内毒素标准品溶液和细菌内毒素供试品溶液各0.1ml，每一浓度平行做4管，轻轻混匀。同时分别用0.1ml鲎试验用水和供试品溶液做阴性对照，平行做两管。垂直放入电热恒温水槽中，从放入开始准确记录时间，在37±1℃无振动保温60± 2分钟。
表1 依替巴肽注射液（100ml：75mg）干扰试验预试验
Table 1 Preliminary Test of Interference Test for Eptifibatide Injection （100 ml： 75 mg）
注1：“NPC”为供试品溶液 “PPC”为供试品阳性对照溶液 “NC”为阴性对照 “PC”为阳性对照 “+”为凝固，“-”为未凝固。
1.2.3.2.3 试验结果
表2 依替巴肽注射液（100ml：75mg）干扰试验
Table 2 Interference Test for Eptifibatide Injection （100 ml：75 mg）
注1：“+”为凝固，“-”为未凝固。
表2试验结果表明，15mg/ml供试品稀释液的供试品的Et值均在0.5Es～2Es范围之间，确认无干扰影响。当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，需重新进行干扰试验。[8]
2 结果
表3 依替巴肽注射液（100ml：75mg）细菌内毒素检查
Table 3 Bacterial Endotoxin Test for Eptifibatide Injection （100 ml： 75 mg）
注1：“+”为凝固，“-”为未凝固。
3 讨论
在本实验条件下，取三个批号的供试品（100ml：75mg），用BET水分别按上述方法配制成15mg/ml供试品稀释液（L<0.4EU/mg），然后用λ=0.06EU/ml的上述二个厂家的鲎试剂各16支实验Et值均在0.5Es～2Es范围之间，确认无干扰影响。依替巴肽注射液经过按细菌内毒素检查法实验后，确证了本品可以用稀释方法排除干扰，用细菌内毒素检查法（凝胶法）对供试品进行细菌内毒素的检测结果准确可靠。
参考文献
[1] Balasubramaniam K， Viswanathan G N， Marshall S M， Zaman A G. Increased Atherothrombotic Burden in Patients with Diabetes Mellitus and Acute Coronary Syndrome： A Review of Antiplatelet Therapy[J]. Cardiol Res Pract，2012， 2012：909154.
[2] Ferreiro J L， Angiolillo D J. Diabetes and antiplatelet therapy in acute coronary syndrome[J]. Circulation， 2011， 123（7）：798-813.
[3] Davi G， Patrono C. Platelet activation and atherothrombosis[J]. N Engl J Med， 2007， 357（24）：2482-2494.
[4] Fuster V， Moreno P R， Fayad Z A， Corti R， Badimon J J. Atherothrombosis and high-risk plaque： part I： evolving concepts[J]. J Am CollCardiol， 2005， 46（6）： 937-954.
[5] 许玉华，杜鹃，汤杨.药品微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005，6（4：）46
[6] 国家药典委员会编，中国药典二部附录，北京：中国医药科技出版社，2010：6
[7] 国家药典委员会编，中国药典二部附录，北京：中国医药科技出版社，2010：100
[8] 国家药典委员会编，中国药典二部附录，北京：中国医药科技出版社，2010：101
目的：对依替巴肽注射液的细菌内毒素检查方法进行探讨，建立其细菌内毒素检查方法。方法：按《中国药典2010》二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查方法进行。结果：在验证条件下，依替巴肽注射液可以采用稀释方法排除干扰。结论：可以采用此法对本品的细菌内毒素进行检查。
关键词：依替巴肽注射液；细菌内毒素方法；验证
Research of Bacterial Endotoxin Method for Eptifibatide Injection
JIN Aimin， WANG Chunling， WANG Cuiling， LI Qin， HU Chunyong （Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang， Jiangsu， 222000）
Abstract：
Objective： Research and establish bacterial endotoxin method for Eptifibatide Injection. Method： Test according to Appendix XI E test for bacterial endotoxin in the 2010 Edition of Chinese Pharmacopeia Volume II. Result： Under validation conditions， the dilution method can be used to eliminate the interference in the test of Eptifibatide Injection. Conclusion： This method can be used to test the bacterial endotoxin in Eptifibatide Injection.
Key words： Eptifibatide Injection， Bacterial Endotoxin Method， Validation
【中图分类号】
R453 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）06-0047-02
急性冠脉综合症（Acute coronary syndromes，ACS）是血小板功能过度激活而产生的血栓性事件。根据临床症状主要分为不稳定型心绞痛（Unstable angina pectoris，UAP）、非ST段抬高心梗死（Non-ST-elevation myocardial infarction，NSTEMI）及ST段抬高心肌梗死（ST-elevation myocardial infarction，STEMI）[1-3]。冠状动脉血管斑块破裂或血管内皮被侵蚀而引起的血栓栓塞是促发ACS的主要原因，可发生于多个部位。由于ACS发病急，并且导致病情不稳定因素多，导致此病较难控制，现已成为严重影响人类生存质量的疾病之一[4]。依替巴肽为特异性GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂，通过与血小板膜上GPⅡb/Ⅲa受体结合，占据了其上的结合位点，使血小板GPⅡb/Ⅲa受体不能与纤维蛋白原结合，从而抑制了血小板聚集。由于依替巴肽阻滞了血小板聚集的最后共同途径，具有抗血小板作用强、起效快、不良反应少等优点，因此对依替巴肽注射液的研究，可满足国内急性冠脉综合症状病人的需要，填补国内空白，具有较好的社会效益和经济效益。无菌检查、细菌内毒素、微生物限度检查是药品安全性检查的重要项目[5]，本品为注射剂按照中国药典2010版附录ⅠB[6]的要求，为了更加有效的保障患者用药安全，本品要进行细菌内毒素检查。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器：Ms3digital旋涡混合器，CJ-2F净化工作台，DK-600S电热恒温水槽，DMH-1电热干燥箱。
1.1.2 试剂：鲎试剂1【规格0.06EU/ml（0.1ml/支）批号11080611】福州新北生化工业有限公司；鲎试剂2【规格0.06EU/ml（0.1ml/支）批号1110122】湛江海洋生物制品有限公司；鲎试验用水【50ml/支批号11010305】福州新北生化工业有限公司；细菌内毒素工作标准品【规格180EU/支批号150601-200965】中国药品生物制品检定所；pH调节剂【规格2ml/支批号110904】福州新北生化工业有限公司。
1.2 方法
1.2.1 试验准备：所有容器、用具都必须经过处理，去除外源性内毒素，玻璃仪器于250℃干烤至少1小时，塑料用具须确证不干扰实验结果。操作过程中避免微生物污染。初次使用的鲎试剂必须经过灵敏度复核[7]。通过测评及计算依替巴肽注射液（100ml：75mg）的细菌内毒素限值暂定为L<0.5EU/mg。
1.2.2 鲎试剂灵敏度复核： 按《中国药典》2010版二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法规定，进行鲎试剂的标示灵敏度复核，二批鲎试剂经用细菌内毒素工作标准品检查λc与λ一致（应在0.5λ≤λc≤2λ范围内），结果均符合规定。
1.2.3 依替巴肽注射液（10ml：20mg、100ml：75mg）对细菌内毒素检查干扰试验
1.2.3.1 干扰预试验（鲎试剂：λ=0.06EU/ml）：取本品，加BET水进行供试品溶液（NPC）和供试品阳性对照溶液（PPC）的配制。
1.2.3.1.1 供试品溶液（NPC）配制：取三个批号的供试品（100ml：75mg），BET水及pH调节剂制备成38.mg/ml、18.75mg/ml、9.375mg/ml、6.25mg/ml共四个浓度。 1.2.3.1.2 细菌内毒素工作标准品溶液稀释方法：用1ml的鲎试验用水溶解1支细菌内毒素工作标准品，用旋涡混合器连续混合15分钟，成150EU/ml，用鲎试验用水稀释成4λ、2λ，在进行下一步稀释前，至少混和30秒。
1.2.3.1.3 供试品阳性对照溶液（PPC）的配制：配制的浓度同上，每个浓度中含2λ（0.125EU/ml）的细菌内毒素，制备成38.mg/ml+2λ、18.75mg/ml+2λ、9.375mg/ml+2λ、6.25mg/ml+2λ共四个浓度。
1.2.3.1.4 试验过程： 取上述二个厂家的鲎试剂各64支，先分别加入0.1mlBET水溶解，再分别加入0.1ml供试品和供试品阳性各浓度稀释液，混匀后，于37±1℃无振动保温60± 2分钟，同时设阴性和阳性对照，每个浓度平行做2管。
结果表明，依替巴肽注射液（100ml：75mg）在18.75mg/ml以下稀释度时，对以上二个厂家的鲎试剂均未产生干扰作用。故18.75mg/ml稀释度为最小不干扰稀释倍数。根据依替巴肽注射液（100ml：75mg）的试验结果，依替巴肽注射液（100ml：75mg）选取15mg/ml稀释液作为细菌内毒素检查的供试品溶液浓度。
1.2.3.2 供试品的干扰试验：
为进一步确证供试品溶液对0.06EU/ml的鲎试剂是否存在干扰作用，分别用BET水和供试品15mg/ml稀释液进行实验，将细菌内毒素工作标准品配制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的系列内毒素溶液。
1.2.3.2.1 供试品15mg/ml稀释液的制备： 取上述三个批号的供试品，分别用BET水稀释成15mg/ml供试液。
1.2.3.2.2试验过程（鲎试剂：λ=0.06EU/ml）：——用BET水与15mg/ml供试液分别将细菌内毒素工作标准品稀释成0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml、0.015EU/ml四个浓度，作为细菌内毒素标准品溶液和细菌内毒素供试品溶液。
——取上述二个厂家的鲎试剂各72支，每支分别用0.1mlBET水溶解，再加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ的细菌内毒素标准品溶液和细菌内毒素供试品溶液各0.1ml，每一浓度平行做4管，轻轻混匀。同时分别用0.1ml鲎试验用水和供试品溶液做阴性对照，平行做两管。垂直放入电热恒温水槽中，从放入开始准确记录时间，在37±1℃无振动保温60± 2分钟。
表1 依替巴肽注射液（100ml：75mg）干扰试验预试验
Table 1 Preliminary Test of Interference Test for Eptifibatide Injection （100 ml： 75 mg）
注1：“NPC”为供试品溶液 “PPC”为供试品阳性对照溶液 “NC”为阴性对照 “PC”为阳性对照 “+”为凝固，“-”为未凝固。
1.2.3.2.3 试验结果
表2 依替巴肽注射液（100ml：75mg）干扰试验
Table 2 Interference Test for Eptifibatide Injection （100 ml：75 mg）
注1：“+”为凝固，“-”为未凝固。
表2试验结果表明，15mg/ml供试品稀释液的供试品的Et值均在0.5Es～2Es范围之间，确认无干扰影响。当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，需重新进行干扰试验。[8]
2 结果
表3 依替巴肽注射液（100ml：75mg）细菌内毒素检查
Table 3 Bacterial Endotoxin Test for Eptifibatide Injection （100 ml： 75 mg）
注1：“+”为凝固，“-”为未凝固。
3 讨论
在本实验条件下，取三个批号的供试品（100ml：75mg），用BET水分别按上述方法配制成15mg/ml供试品稀释液（L<0.4EU/mg），然后用λ=0.06EU/ml的上述二个厂家的鲎试剂各16支实验Et值均在0.5Es～2Es范围之间，确认无干扰影响。依替巴肽注射液经过按细菌内毒素检查法实验后，确证了本品可以用稀释方法排除干扰，用细菌内毒素检查法（凝胶法）对供试品进行细菌内毒素的检测结果准确可靠。
参考文献
[1] Balasubramaniam K， Viswanathan G N， Marshall S M， Zaman A G. Increased Atherothrombotic Burden in Patients with Diabetes Mellitus and Acute Coronary Syndrome： A Review of Antiplatelet Therapy[J]. Cardiol Res Pract，2012， 2012：909154.
[2] Ferreiro J L， Angiolillo D J. Diabetes and antiplatelet therapy in acute coronary syndrome[J]. Circulation， 2011， 123（7）：798-813.
[3] Davi G， Patrono C. Platelet activation and atherothrombosis[J]. N Engl J Med， 2007， 357（24）：2482-2494.
[4] Fuster V， Moreno P R， Fayad Z A， Corti R， Badimon J J. Atherothrombosis and high-risk plaque： part I： evolving concepts[J]. J Am CollCardiol， 2005， 46（6）： 937-954.
[5] 许玉华，杜鹃，汤杨.药品微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005，6（4：）46
[6] 国家药典委员会编，中国药典二部附录，北京：中国医药科技出版社，2010：6
[7] 国家药典委员会编，中国药典二部附录，北京：中国医药科技出版社，2010：100
[8] 国家药典委员会编，中国药典二部附录，北京：中国医药科技出版社，2010：101