论文部分内容阅读
摘要[目的]研究抗寒丹参机理及物质基础。[方法]以抗寒丹参和普通丹参为材料，采用大田栽培试验，利用KMnO4标准溶液滴定法测过氧化氢酶（CAT）活性、愈创木酚法测POD活性、NBT还原法测SOD活性、紫外分光光度法测定可溶性多糖含量，研究抗寒丹参和普通丹参形态、叶片和根茎的抗氧化酶活性和可溶性多糖含量的差异，探讨抗寒丹参机理及物质基础。[结果]在形态上，抗寒丹参叶片浓绿而厚实，受冻害地上部分不枯萎；普通丹参叶片翠绿而薄，受到冷害时地上部分枯萎。抗寒丹参叶片内的SOD、CAT酶活性显著高于普通丹参叶片，而POD酶活性则两者相差甚微；抗寒丹参根及根茎中POD、CAT酶活性显著高于普通丹参根茎，SOD酶活性略低于普通丹参；抗寒丹参叶片可溶性糖含量均高于普通丹参叶片。[结论]该研究为培育出具有优良抗寒能力的丹参提供了理论依据。
关键词丹参；抗寒性；抗氧化酶活性；可溶性糖
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-063-02
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根茎，为多年生草本植物[1]，为大宗常用中药材，有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功用，对许多疾病均有治疗作用，特别是对心脑血管病具有很好的临床疗效。
丹参对土壤气候适应性强，适宜种植在土层深厚、排水良好、中等肥力的砂壤土中，粘土和盐碱地不宜生长。性喜温暖湿润、阳光充足的环境，耐寒、耐旱。李倩等对商洛6个地区丹参的研究表明，无霜期与年极端最高温度是影响丹参素含量的主导因子，7月均温、年均温度、年极端最高温度是影响丹参酮IIA 含量的主导因子[2]。刘红云通过大田试验、盆栽试验等研究不同生长因子和环境因子对丹参生长和活性成分积累的影响，从而建立丹参生长模拟模型指导丹参生产，以期获得高产、优质的丹参药材[3]。舒志明等研究指出春季地温10 ℃时开始返青，温度20～26 ℃、相对湿度80%时生长旺盛，秋季气温降至10 ℃以下时，地上部分开始枯萎，根在-15 ℃的情况下，可安全越冬[4]。该研究从河南省三门峡市卢氏县引种的丹参，产量高。经过多年发现栽培极少数一部分丹参0 ℃以下长达30多天不倒苗，经筛选、移栽作为抗寒丹参，冬季倒苗的称为普通丹参。在此以抗寒丹参和普通丹参为材料，通过研究其形态、叶片和根茎的抗氧化酶活性和可溶性多糖含量的差异，探讨抗寒丹参的抗寒机理并对其进行选育，对培育出具有优良抗寒能力的丹参良种具有十分重要的意义。
1材料与方法
1.1试验材料2013年11月20日和2013年12月15日，在湖南省望城区铜官镇丹参栽培基地随机分别采挖两年生抗寒丹参和普通丹参植株，取其叶片和根茎进行抗氧化酶活性和可溶性糖含量的测定。
1.2测定指标
1.2.1抗氧化酶活性测定。随机取抗旱丹参和普通丹参叶片和根及根茎测定其抗氧化酶活性，其中用KMnO4标准溶液滴定法测过氧化氢酶（CAT）活性、愈创木酚法测POD活性、NBT还原法测SOD活性和考马斯亮蓝（G250）法测可溶性蛋白质含量[5]。SOD活性以抑制氮蓝四唑NBT光氧化还原50%的酶量为1个活力单位u，CAT活性以1 min每毫克蛋白质酶解1 μmol H2O2为1个活力单位u，POD活性以1 min每毫克蛋白质催化的470 nm下OD值变化为一个酶活单位u [5]。
1.2.2可溶性糖含量测定。
1.2.2.1试验材料。随机取抗寒丹参和普通丹参叶片于80 ℃烘箱中烘干，粉碎，过80目筛，备用。
1.2.2.2对照品溶液的制备。取经105 ℃干燥至恒重的葡萄糖对照品41.3 mg，精密称定，置100 ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
1.2.2.3供试品制备。取丹参叶粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取50 ml水，称重，超声1 h，冷却，补足损失水量，过滤，取续滤液，即得。
1.2.2.4样品含量测定。分别精密吸取供试液0.3 ml于25 ml具塞试管中，加水至2.5 ml，加入5.0%苯酚水溶液6.0 ml，在冰水浴中缓缓加入浓硫酸至刻度，摇匀，放冷后置沸水浴中保温10 min，取出，立即置冰水浴中冷却10 min，取出，放冷至室温，随行溶剂空白，于489 nm测定吸收度。
1.3数据处理采用Excel对数据进行统计分析。
2结果与分析
2.1抗寒丹参与普通丹参外观形态比较通过多年丹参栽培发现极少数一部分丹参冬季不倒苗，将其称为抗寒丹参。普通丹参幼苗最抗寒，播种发芽后2个月左右不怕冰冻、严寒，半年内抗寒能力比抗寒丹参还强，一年以上老苗抗寒能力差，普通丹参中抗寒丹参植株仅有1%～2%能够经受2～3场雪，将抗寒丹参于保鲜膜内装好，放置冰柜内-3 ℃ 4 d以上，颜色没有变化，仍然鲜活、不失绿，表明筛选出来的丹参抗寒能力强，能长期抵抗-3 ℃的低温和寒冬。
抗寒丹参与普通丹参在形态上有较大的差别，抗寒丹参基生叶多，叶密集，叶片大，不断萌发新叶片，老叶呈墨绿色，新叶片呈新绿色，叶厚实，色浓绿，多皱折，凹凸不平，海绵组织、栅栏组织发达，寒冬、低温不枯萎、变黄，无明显老叶，茎较矮，茎生叶少，根外皮呈褐色，纤维较多。普通丹参基生叶较少，叶较稀疏，叶片较小，叶薄，色绿、黄绿、浅绿，皱折较少，较平坦，海绵组织、栅栏组织较发达，生长中期有明显老叶，茎高，茎生叶多，寒冬、低温一段时间后，地上部分枯萎、变黄，叶片从外至内依次变黄直至枯萎，整个地上部分枯萎、变黄，第二年春季才开始萌发，根呈紫红色，纤维较少。
2.2丹参不同部位抗氧化酶活性比较研究
2.2.1不同丹参根及根茎抗氧化酶活性的比较。从表1可以看出，抗寒丹参和普通丹参根及根茎在经历了一段时间的低温后，其根及根茎内的保护酶活性有差异，抗寒丹参根及根茎内POD、CAT保护酶活性明显高于普通丹参，而SOD酶活性则略低于普通丹参。由此可见，当丹参的根茎受到寒冷时，抗寒丹参为了维持其地上部分的生长所需的水分和矿质养分，其根茎种抗氧化酶活性升高以保护其免受冷害、冻害威胁，寒冷季节能够正常生长。 表1不同丹参根茎酶活性测定的比较
材料SOD活性
u/（g·FW）POD活性
u/（g·min）CAT活性
u/（g·min）抗寒丹参427.3519.68347.22普通丹参462.056.52197.37
2.2.2不同丹参叶片抗氧化酶活性的比较。从表2可以看出，抗寒丹参和普通丹参经过一段时间的低温后，抗寒丹参叶片内的SOD、CAT酶活性显著高于普通丹参叶片，而POD酶活性则两者相差甚微，研究结果表明植物酶活性与植物抗寒性具有一定的关系。
表2不同丹参叶片抗氧化酶活性的比较
材料SOD活性
u/（g·FW）POD活性
u/（g·min）CAT活性
u/（g·min）抗寒丹参615.38169.02722.22普通丹参494.12268.48500.00
2.3不同丹参叶片可溶性糖含量的比较可溶性糖以及与之共存的可溶性物质，如甘氨酸甜菜碱、脯氨酸在寒冷保护中的作用已被广泛报道。植物学研究中一直把拟南芥作为模式植物，研究各种条件下植物的生理生态变化，Strand等就利用转基因拟南芥研究发现拟南芥中蔗糖磷酸合酶的超表达可促进蔗糖水平的提高，同时可以在一定程度上提高植株的耐寒性[6]。通过紫外分光光度计法，用葡萄糖作为标准品，测定抗寒丹参叶片和普通丹参叶片内可溶性糖的含量，结果发现，抗寒丹参叶片内的可溶性糖含量为3.55%，普通丹参叶片内可溶性糖的含量为2.02%，两者差异十分明显。
3小结与讨论
试验结果表明，抗寒丹参与普通丹参不仅在外观形态上存在差异，其植株内的抗氧化酶活性和可溶糖含量也存在差异。抗寒丹参叶片浓绿、厚实、基生叶密集，根及根茎表皮褐色，多纤维；而普通丹参的叶片翠绿、稍薄、叶片稀疏，根及根茎表皮紫红色，肉质少纤维。植物叶片形态与抗寒性有很大关联，抗寒植物海绵组织、栅栏组织发达，排列紧密，叶绿素多，细胞质浓，内含物多，抗寒植物除激素、酶活性水平较高外，还有其物质结构和代谢物质基础作为保证。有报道称培育小麦壮苗壮蘖可以提高其抗寒能力[7]，但未见利用某种具体模式植物研究其形态结构与抗寒性的关系。
Scebba等研究表明植物遇低温会积累大量对膜和膜相关的生物大分子有害的活性氧（AOS），而低温驯化可使植物体内抗氧化物酶系统加强，从而提高植物对活性氧的耐受力[8]。该研究发现，抗寒丹参叶片的保护酶活性均高于普通丹参，其中SOD和CAT酶活性有显著性差异；抗寒丹参根茎中POD和CAT酶活性显著高于普通丹参根茎，而SOD酶活性略低于普通丹参根茎。抗寒丹参叶片中可溶性糖含量明显高于普通丹参，与可溶性糖对植物冷害能起到一定保护作用的文献报道结果相一致[9]。
综上所述，抗寒丹参和普通丹参在形态和生理上存在差异，当抗寒丹参受到冷害、冻害时，其叶片中SOD、CAT酶以及可溶性糖含量升高，当抗寒丹参根及根茎受到冷害、冻害时，根茎中的POD和CAT含量升高，抗寒丹参有其形态、生理、抗氧化酶活性、可溶性糖含量等作为其抗寒的物质基础。
参考文献
[1] 余世春，琚小龙，段广勋.丹参的化学成分和药理活性研究概况[J].安徽卫生职业技术学院学报，2002（2）：43-47.
[2] 李倩，梁宗锁，董娟娥，等.丹参品质与主导气候因子的灰色关联度分析[J].生态学报，2010，30（10）：2569-2575.
[3] 刘红云.丹参生长模拟模型及活性成分积累的调控研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2011.
[4] 舒志明，梁宗锁，卫新荣，等.丹参GAP 规范化栽培技术[J].陕西农业科学，2004（6）：9-10.
[5] 李玲.植物生理学模块试验指导[M].北京：科学技术出版社，2009.
关键词丹参；抗寒性；抗氧化酶活性；可溶性糖
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-063-02
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根茎，为多年生草本植物[1]，为大宗常用中药材，有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功用，对许多疾病均有治疗作用，特别是对心脑血管病具有很好的临床疗效。
丹参对土壤气候适应性强，适宜种植在土层深厚、排水良好、中等肥力的砂壤土中，粘土和盐碱地不宜生长。性喜温暖湿润、阳光充足的环境，耐寒、耐旱。李倩等对商洛6个地区丹参的研究表明，无霜期与年极端最高温度是影响丹参素含量的主导因子，7月均温、年均温度、年极端最高温度是影响丹参酮IIA 含量的主导因子[2]。刘红云通过大田试验、盆栽试验等研究不同生长因子和环境因子对丹参生长和活性成分积累的影响，从而建立丹参生长模拟模型指导丹参生产，以期获得高产、优质的丹参药材[3]。舒志明等研究指出春季地温10 ℃时开始返青，温度20～26 ℃、相对湿度80%时生长旺盛，秋季气温降至10 ℃以下时，地上部分开始枯萎，根在-15 ℃的情况下，可安全越冬[4]。该研究从河南省三门峡市卢氏县引种的丹参，产量高。经过多年发现栽培极少数一部分丹参0 ℃以下长达30多天不倒苗，经筛选、移栽作为抗寒丹参，冬季倒苗的称为普通丹参。在此以抗寒丹参和普通丹参为材料，通过研究其形态、叶片和根茎的抗氧化酶活性和可溶性多糖含量的差异，探讨抗寒丹参的抗寒机理并对其进行选育，对培育出具有优良抗寒能力的丹参良种具有十分重要的意义。
1材料与方法
1.1试验材料2013年11月20日和2013年12月15日，在湖南省望城区铜官镇丹参栽培基地随机分别采挖两年生抗寒丹参和普通丹参植株，取其叶片和根茎进行抗氧化酶活性和可溶性糖含量的测定。
1.2测定指标
1.2.1抗氧化酶活性测定。随机取抗旱丹参和普通丹参叶片和根及根茎测定其抗氧化酶活性，其中用KMnO4标准溶液滴定法测过氧化氢酶（CAT）活性、愈创木酚法测POD活性、NBT还原法测SOD活性和考马斯亮蓝（G250）法测可溶性蛋白质含量[5]。SOD活性以抑制氮蓝四唑NBT光氧化还原50%的酶量为1个活力单位u，CAT活性以1 min每毫克蛋白质酶解1 μmol H2O2为1个活力单位u，POD活性以1 min每毫克蛋白质催化的470 nm下OD值变化为一个酶活单位u [5]。
1.2.2可溶性糖含量测定。
1.2.2.1试验材料。随机取抗寒丹参和普通丹参叶片于80 ℃烘箱中烘干，粉碎，过80目筛，备用。
1.2.2.2对照品溶液的制备。取经105 ℃干燥至恒重的葡萄糖对照品41.3 mg，精密称定，置100 ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
1.2.2.3供试品制备。取丹参叶粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取50 ml水，称重，超声1 h，冷却，补足损失水量，过滤，取续滤液，即得。
1.2.2.4样品含量测定。分别精密吸取供试液0.3 ml于25 ml具塞试管中，加水至2.5 ml，加入5.0%苯酚水溶液6.0 ml，在冰水浴中缓缓加入浓硫酸至刻度，摇匀，放冷后置沸水浴中保温10 min，取出，立即置冰水浴中冷却10 min，取出，放冷至室温，随行溶剂空白，于489 nm测定吸收度。
1.3数据处理采用Excel对数据进行统计分析。
2结果与分析
2.1抗寒丹参与普通丹参外观形态比较通过多年丹参栽培发现极少数一部分丹参冬季不倒苗，将其称为抗寒丹参。普通丹参幼苗最抗寒，播种发芽后2个月左右不怕冰冻、严寒，半年内抗寒能力比抗寒丹参还强，一年以上老苗抗寒能力差，普通丹参中抗寒丹参植株仅有1%～2%能够经受2～3场雪，将抗寒丹参于保鲜膜内装好，放置冰柜内-3 ℃ 4 d以上，颜色没有变化，仍然鲜活、不失绿，表明筛选出来的丹参抗寒能力强，能长期抵抗-3 ℃的低温和寒冬。
抗寒丹参与普通丹参在形态上有较大的差别，抗寒丹参基生叶多，叶密集，叶片大，不断萌发新叶片，老叶呈墨绿色，新叶片呈新绿色，叶厚实，色浓绿，多皱折，凹凸不平，海绵组织、栅栏组织发达，寒冬、低温不枯萎、变黄，无明显老叶，茎较矮，茎生叶少，根外皮呈褐色，纤维较多。普通丹参基生叶较少，叶较稀疏，叶片较小，叶薄，色绿、黄绿、浅绿，皱折较少，较平坦，海绵组织、栅栏组织较发达，生长中期有明显老叶，茎高，茎生叶多，寒冬、低温一段时间后，地上部分枯萎、变黄，叶片从外至内依次变黄直至枯萎，整个地上部分枯萎、变黄，第二年春季才开始萌发，根呈紫红色，纤维较少。
2.2丹参不同部位抗氧化酶活性比较研究
2.2.1不同丹参根及根茎抗氧化酶活性的比较。从表1可以看出，抗寒丹参和普通丹参根及根茎在经历了一段时间的低温后，其根及根茎内的保护酶活性有差异，抗寒丹参根及根茎内POD、CAT保护酶活性明显高于普通丹参，而SOD酶活性则略低于普通丹参。由此可见，当丹参的根茎受到寒冷时，抗寒丹参为了维持其地上部分的生长所需的水分和矿质养分，其根茎种抗氧化酶活性升高以保护其免受冷害、冻害威胁，寒冷季节能够正常生长。 表1不同丹参根茎酶活性测定的比较
材料SOD活性
u/（g·FW）POD活性
u/（g·min）CAT活性
u/（g·min）抗寒丹参427.3519.68347.22普通丹参462.056.52197.37
2.2.2不同丹参叶片抗氧化酶活性的比较。从表2可以看出，抗寒丹参和普通丹参经过一段时间的低温后，抗寒丹参叶片内的SOD、CAT酶活性显著高于普通丹参叶片，而POD酶活性则两者相差甚微，研究结果表明植物酶活性与植物抗寒性具有一定的关系。
表2不同丹参叶片抗氧化酶活性的比较
材料SOD活性
u/（g·FW）POD活性
u/（g·min）CAT活性
u/（g·min）抗寒丹参615.38169.02722.22普通丹参494.12268.48500.00
2.3不同丹参叶片可溶性糖含量的比较可溶性糖以及与之共存的可溶性物质，如甘氨酸甜菜碱、脯氨酸在寒冷保护中的作用已被广泛报道。植物学研究中一直把拟南芥作为模式植物，研究各种条件下植物的生理生态变化，Strand等就利用转基因拟南芥研究发现拟南芥中蔗糖磷酸合酶的超表达可促进蔗糖水平的提高，同时可以在一定程度上提高植株的耐寒性[6]。通过紫外分光光度计法，用葡萄糖作为标准品，测定抗寒丹参叶片和普通丹参叶片内可溶性糖的含量，结果发现，抗寒丹参叶片内的可溶性糖含量为3.55%，普通丹参叶片内可溶性糖的含量为2.02%，两者差异十分明显。
3小结与讨论
试验结果表明，抗寒丹参与普通丹参不仅在外观形态上存在差异，其植株内的抗氧化酶活性和可溶糖含量也存在差异。抗寒丹参叶片浓绿、厚实、基生叶密集，根及根茎表皮褐色，多纤维；而普通丹参的叶片翠绿、稍薄、叶片稀疏，根及根茎表皮紫红色，肉质少纤维。植物叶片形态与抗寒性有很大关联，抗寒植物海绵组织、栅栏组织发达，排列紧密，叶绿素多，细胞质浓，内含物多，抗寒植物除激素、酶活性水平较高外，还有其物质结构和代谢物质基础作为保证。有报道称培育小麦壮苗壮蘖可以提高其抗寒能力[7]，但未见利用某种具体模式植物研究其形态结构与抗寒性的关系。
Scebba等研究表明植物遇低温会积累大量对膜和膜相关的生物大分子有害的活性氧（AOS），而低温驯化可使植物体内抗氧化物酶系统加强，从而提高植物对活性氧的耐受力[8]。该研究发现，抗寒丹参叶片的保护酶活性均高于普通丹参，其中SOD和CAT酶活性有显著性差异；抗寒丹参根茎中POD和CAT酶活性显著高于普通丹参根茎，而SOD酶活性略低于普通丹参根茎。抗寒丹参叶片中可溶性糖含量明显高于普通丹参，与可溶性糖对植物冷害能起到一定保护作用的文献报道结果相一致[9]。
综上所述，抗寒丹参和普通丹参在形态和生理上存在差异，当抗寒丹参受到冷害、冻害时，其叶片中SOD、CAT酶以及可溶性糖含量升高，当抗寒丹参根及根茎受到冷害、冻害时，根茎中的POD和CAT含量升高，抗寒丹参有其形态、生理、抗氧化酶活性、可溶性糖含量等作为其抗寒的物质基础。
参考文献
[1] 余世春，琚小龙，段广勋.丹参的化学成分和药理活性研究概况[J].安徽卫生职业技术学院学报，2002（2）：43-47.
[2] 李倩，梁宗锁，董娟娥，等.丹参品质与主导气候因子的灰色关联度分析[J].生态学报，2010，30（10）：2569-2575.
[3] 刘红云.丹参生长模拟模型及活性成分积累的调控研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2011.
[4] 舒志明，梁宗锁，卫新荣，等.丹参GAP 规范化栽培技术[J].陕西农业科学，2004（6）：9-10.
[5] 李玲.植物生理学模块试验指导[M].北京：科学技术出版社，2009.