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摘要：目的研究黑逍遥散含药血清对Aβ25-35/H2O2分别诱导的PC12细胞模型酶学指标的影响。方法经体外培养的大鼠肾上腺嗜铬肿瘤细胞（PCl2细胞）分为空白对照组（常规培养液）、Aβ25-35/H2O2损伤组（常规培养液+Aβ25-35或H2O2）、黑逍遥散含药血清组（常规培养液+Aβ25-35或H2O2+不同浓度的黑逍遥散含药血清）。MTT检测细胞各组存活率，比色法检测LDH、T-SOD、MDA酶学指标。结果Aβ25-35/H2O2损伤组细胞存活率均显著低于空白对照组（P<0.05），黑逍遥散血清组细胞存活率均高于损伤组，以10%含药血清组最为明显（P<0.05）；黑逍遥散含药血清可提高LDH、T-SOD活性，降低MDA含量，但以10%组最为明显（P<0.05）。结论在两次实验中，黑逍遥散均能够不同程度的保护PC12细胞，其机制可能和抗氧自由基有关。
关键词：黑逍遥散；阿尔海默茨病；细胞模型；LDH；T-SOD；MDA
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2014）09-0075-03
老年性痴呆，又称阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD），是一种病程隐匿、缓慢的神经退行性疾病。现代医学研究表明，AD的发病机制极为复杂，现AD的发病机制学说已经达到十余种[1-2]。在其众多的病因学说中，氧化应激学说占据着主导地位[3]。中医目前多将此病归于“神呆”范畴。认为其病位在脑，与心、肝、肾功能失调关系密切[4]。发病以内因为主，气、血、痰、瘀缠结为患。脑髓空虚，气血不足致心神失养，属本虚标实之疾[5]。现有的动物实验研究也印证了从肝脾论治的可行性[6-9]。本次实验分别参考王亚利[10]、曲喜英[11]等的，建立AD两种经典的体外模型，运用肝脾肾同治的黑逍遥散（逍遥散+熟地黄）含药血清干预AD体外模型，以期进一步阐释黑逍遥散治疗AD的机理。
1材料与仪器
SPF级大鼠40只，雌性，体重（200±20）g，由甘肃中医学院科研动物实验中心提供。黑逍遥散各组药材均由甘肃中医院药房提供，LDH、T-SOD、MDA试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供，批号：20110928。DMEM培养基由sigma公司提供，批号：20120430。Aβ25-35淀粉肽由上海强耀生物科技有限公司提供，批号：20120405；双氧水批号：121109。PC-12细胞由上海中科院生物研究所提供。Benchmark plus连续波长酶标仪（上海新振仪器设备有限公司），倒置显微镜（日本奥林巴斯光学株式会社，型号：IX71）。
2方法
①含药血清的制备：40只Wistar大鼠，随机抽取10只作为空白组，其余30只作为黑逍遥散给药组。给药组组每天给药17.0g/kg，空白组灌生理盐等量生理盐水。②溶液的配制：a.Aβ25-35溶液的配制：将 Aβ25-35溶解于PBS溶液中配成为浓度为1mmol/L的母液，37℃孵育7天，后置于-80℃冰箱备用。b.H2O2溶液的配制：30%H2O2溶液用离子水中配成300μmol/L溶液。③ PC12细胞的传代与换液：将细胞悬液加入含有DMEM完全培养基，培养液2-3天更换一次，当细胞汇集至80%时进行传代接种。④MTT细胞活力检测：调节好细胞悬液浓度，铺于96孔培养板上，待细胞贴壁后，除空白组、模型组外，给药组分别加2、5、10%含药血清，保护24H后，除空白组外，a.Aβ25-35溶液造模：向96孔板加入经过稀释的Aβ25-35溶液，使其终浓度为20μmol/L；b.H2O2溶液造模组：各组均加入H2O2溶液，使H2O2溶液终浓度为300μmol/L，步骤完成后于8H，12H，16H后进行MTT检测。⑤酶学指标检测：实验按照T-SOD、MDA、LDH的测试试剂盒说明进行检测。⑥统计学处理：细胞吸光度（OD）值及细胞存活率以（x±s）表示，单因素方差检验，P<0.05具有统计学意义。
3结果
4讨论
AD有三大病理特征：老年斑、神经元大量丢失、神经纤维缠结。已经有文献表明[3，12]，氧化应激与AD的三大病理特征都有着密切关系：Aβ淀粉肽主要来自于Aβ肽的碳端蛋氨酸残基，后者能产生过氧化物并促进氧化反应，还可使可溶性Aβ淀粉肽变成不溶性淀粉肽，导致老年斑的产生；自由基能攻击不饱和脂肪酸，造成膜结构的损伤，破坏核酸，引起蛋白质表达异常，导致神经元凋亡；自由基还会引起钙离子超载，导致蛋白磷酸酶与蛋白酶比例失调，从而引起tau蛋白异常磷酸化，进一步形成神经纤维缠结。超氧化物歧化酶（SOD）是机体内清除自由基的重要酶之一，催化自由基的歧化反应，其活性直接反映出机体清除自由基的能力；在细胞受损时，乳酸脱氢酶（LDH）由细胞内流出，其浓度的高低，反映出细胞受损的程度；丙二醛（MDA）是脂质过氧化物的终端产物，可间接反映细胞受损程度，在神经细胞坏死中，AD的发生发展过程中，占有重要位置。
本次实验结果显示：与空白对照组比较，Aβ25-35淀粉肽（20μmol/L）与H2O2（300μmol/L）诱导的PC12损伤的模型组细胞存活率均显著降低，差异具有显著意义（P<0.05）：与两组模型组比较，各个给药组细胞T-SOD、LDH活性显著升高，MDA含量显著降低，差异具有显著意义（P<0.05）。
黑逍遥散方中组成药物看：当归、白术、茯苓、甘草有效成分阿魏酸、双白术内酯、茯苓多糖、异甘草素、甘草总黄酮有不同程度的抗氧化、抗衰老、提高记忆力等作用[13-17]，熟地具有雌性激素样作用，可能对痴呆有一定影响。史佳琳等[18]发现地黄寡糖预孵育能提高细胞存活率、减少LDH渗漏，从而减轻谷氨酸对神经细胞的损害程度。董榕等[19]发现柴胡注射液则能使噪音组迅速升高的T-SOD、MDA含量接近正常组，能明显增加小鼠正确反应次数（P<0.01），结合本次实验结果黑逍遥散显示的抗氧化能力，这些也都为黑逍遥散治疗AD提供了药理学基础。 本次实验通过两个比较经典的AD体外模型实验进一步表明，黑逍遥散均能显著地提高机体T-SOD，LDH的生物活性，降低MDA含量，这也表明黑逍遥散治疗AD的功效可能与提高机体抗氧化能力密切相关。参考资料：
[1]张均田.神经元-突触丢失与老年痴呆[J].神经药理学报，2011，1（1）：1-15.
[2]Lewczuk P，Esselmann H，Bibl M，et al.Tau protein phosphorylated at threonine 18l in CSF as neurochemical biomarker in Alzheimer’s disease：original data and review of the literature[J].Mol Neuresci，2004，23（2）：115-22.
[3]于德红，魏朝良，包永明，等.阿尔茨海默病与氧化应激[J].生物医学工程学杂志，2006，23（5）：1142-1144.
[4]李康铭，唐 农.老年性痴呆中医病因病机研究进展[J].光明中医，2012，27（9）：1926-1928.
[5]傅喆暾，黄宝康.补肾中药防治老年痴呆症研究进展[J].时珍国医国药，2003，23（1）：32-34.
[6]瞿礼萍，曾 南，卢陆飞，等.逍遥散对小鼠记忆力的影响[J].中药药理与临床，2008，24（6）：1-3.
[7]吴红彦，王彩霞.黑逍遥散对AD小鼠学习记忆及抗氧化能力的影响[A].甘肃中医学院学报，2010，27（1）：9-11.
[8]吴红彦，王虎平，王彩霞.黑逍遥散对老年性痴呆的防治作用及其机制研究[J].时珍国医国药，2011，22（4）：921-913.
[9]吴红彦，王虎平.从肝脾论治老年性痴呆及逍遥散对老年痴呆模型小学习记忆能力、中枢胆碱能神经元活性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2010，5（16）：190-192.
[10]王亚利，宋天保，路明，等.Aβ诱导PC-12细胞凋亡建立阿尔茨海默病细胞模型[J].西安医科大学学报，2002，23（2）：129-132.
[11]曲喜英，祝其锋.复方丹参注射液对H2O2 诱导的PC12细胞凋亡的保护作用[J].中国新药杂志，2005，14（11）：1284-1288.
[12]卓烨烨，张汉霆，徐江平.氧化应激与阿尔采末病[J].中国药理学通报，2010，26 （4）：435-437.
[13]金蓓蓓，陈 勤，陈庆林.阿魏酸对拟痴呆小鼠学习记忆和海马胶质纤维酸性蛋白表达的影响[J].激光生物学报，2011，20（4）：484-489.
[14]冯 星，王正濂，林永成，等.双白术内酯对Aβ1-40致痴呆模型大鼠的作用[J].中国药理学通报，2009，25（7）：949-951.
[15]金 惠，赵英博，江 维，等.茯苓药理作用及临床应用研究进展[J].湖北中医杂志，2008，30（4）：59-61.
[16]朱敏娟，杨 静.异甘草素对丙泊酚致小鼠学习记忆障碍的影响[J].数理医药学杂志，2011，24（2）：170-172.
[17]叶怀义，龚赋岚，尚 明.甘草黄酮抗衰老作用的研究[J].哈尔滨商业大学报，2004，20（1）：93-97.
[18]史佳琳，杨 菁，徐新利，等.地黄寡糖对谷氨酸诱导海马神经元损伤的影响[J].中国药理学通报，2009，25（3）：357-361.
[19]董 榕，刘伲娜，昊同智，等.柴胡注射液对噪音所致学习记忆障碍小鼠的改善作用及机制[J].中国行为医学科学，2007，16（12）：1074-1076.（收稿日期：2014-06-10）
关键词：黑逍遥散；阿尔海默茨病；细胞模型；LDH；T-SOD；MDA
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2014）09-0075-03
老年性痴呆，又称阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD），是一种病程隐匿、缓慢的神经退行性疾病。现代医学研究表明，AD的发病机制极为复杂，现AD的发病机制学说已经达到十余种[1-2]。在其众多的病因学说中，氧化应激学说占据着主导地位[3]。中医目前多将此病归于“神呆”范畴。认为其病位在脑，与心、肝、肾功能失调关系密切[4]。发病以内因为主，气、血、痰、瘀缠结为患。脑髓空虚，气血不足致心神失养，属本虚标实之疾[5]。现有的动物实验研究也印证了从肝脾论治的可行性[6-9]。本次实验分别参考王亚利[10]、曲喜英[11]等的，建立AD两种经典的体外模型，运用肝脾肾同治的黑逍遥散（逍遥散+熟地黄）含药血清干预AD体外模型，以期进一步阐释黑逍遥散治疗AD的机理。
1材料与仪器
SPF级大鼠40只，雌性，体重（200±20）g，由甘肃中医学院科研动物实验中心提供。黑逍遥散各组药材均由甘肃中医院药房提供，LDH、T-SOD、MDA试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供，批号：20110928。DMEM培养基由sigma公司提供，批号：20120430。Aβ25-35淀粉肽由上海强耀生物科技有限公司提供，批号：20120405；双氧水批号：121109。PC-12细胞由上海中科院生物研究所提供。Benchmark plus连续波长酶标仪（上海新振仪器设备有限公司），倒置显微镜（日本奥林巴斯光学株式会社，型号：IX71）。
2方法
①含药血清的制备：40只Wistar大鼠，随机抽取10只作为空白组，其余30只作为黑逍遥散给药组。给药组组每天给药17.0g/kg，空白组灌生理盐等量生理盐水。②溶液的配制：a.Aβ25-35溶液的配制：将 Aβ25-35溶解于PBS溶液中配成为浓度为1mmol/L的母液，37℃孵育7天，后置于-80℃冰箱备用。b.H2O2溶液的配制：30%H2O2溶液用离子水中配成300μmol/L溶液。③ PC12细胞的传代与换液：将细胞悬液加入含有DMEM完全培养基，培养液2-3天更换一次，当细胞汇集至80%时进行传代接种。④MTT细胞活力检测：调节好细胞悬液浓度，铺于96孔培养板上，待细胞贴壁后，除空白组、模型组外，给药组分别加2、5、10%含药血清，保护24H后，除空白组外，a.Aβ25-35溶液造模：向96孔板加入经过稀释的Aβ25-35溶液，使其终浓度为20μmol/L；b.H2O2溶液造模组：各组均加入H2O2溶液，使H2O2溶液终浓度为300μmol/L，步骤完成后于8H，12H，16H后进行MTT检测。⑤酶学指标检测：实验按照T-SOD、MDA、LDH的测试试剂盒说明进行检测。⑥统计学处理：细胞吸光度（OD）值及细胞存活率以（x±s）表示，单因素方差检验，P<0.05具有统计学意义。
3结果
4讨论
AD有三大病理特征：老年斑、神经元大量丢失、神经纤维缠结。已经有文献表明[3，12]，氧化应激与AD的三大病理特征都有着密切关系：Aβ淀粉肽主要来自于Aβ肽的碳端蛋氨酸残基，后者能产生过氧化物并促进氧化反应，还可使可溶性Aβ淀粉肽变成不溶性淀粉肽，导致老年斑的产生；自由基能攻击不饱和脂肪酸，造成膜结构的损伤，破坏核酸，引起蛋白质表达异常，导致神经元凋亡；自由基还会引起钙离子超载，导致蛋白磷酸酶与蛋白酶比例失调，从而引起tau蛋白异常磷酸化，进一步形成神经纤维缠结。超氧化物歧化酶（SOD）是机体内清除自由基的重要酶之一，催化自由基的歧化反应，其活性直接反映出机体清除自由基的能力；在细胞受损时，乳酸脱氢酶（LDH）由细胞内流出，其浓度的高低，反映出细胞受损的程度；丙二醛（MDA）是脂质过氧化物的终端产物，可间接反映细胞受损程度，在神经细胞坏死中，AD的发生发展过程中，占有重要位置。
本次实验结果显示：与空白对照组比较，Aβ25-35淀粉肽（20μmol/L）与H2O2（300μmol/L）诱导的PC12损伤的模型组细胞存活率均显著降低，差异具有显著意义（P<0.05）：与两组模型组比较，各个给药组细胞T-SOD、LDH活性显著升高，MDA含量显著降低，差异具有显著意义（P<0.05）。
黑逍遥散方中组成药物看：当归、白术、茯苓、甘草有效成分阿魏酸、双白术内酯、茯苓多糖、异甘草素、甘草总黄酮有不同程度的抗氧化、抗衰老、提高记忆力等作用[13-17]，熟地具有雌性激素样作用，可能对痴呆有一定影响。史佳琳等[18]发现地黄寡糖预孵育能提高细胞存活率、减少LDH渗漏，从而减轻谷氨酸对神经细胞的损害程度。董榕等[19]发现柴胡注射液则能使噪音组迅速升高的T-SOD、MDA含量接近正常组，能明显增加小鼠正确反应次数（P<0.01），结合本次实验结果黑逍遥散显示的抗氧化能力，这些也都为黑逍遥散治疗AD提供了药理学基础。 本次实验通过两个比较经典的AD体外模型实验进一步表明，黑逍遥散均能显著地提高机体T-SOD，LDH的生物活性，降低MDA含量，这也表明黑逍遥散治疗AD的功效可能与提高机体抗氧化能力密切相关。参考资料：
[1]张均田.神经元-突触丢失与老年痴呆[J].神经药理学报，2011，1（1）：1-15.
[2]Lewczuk P，Esselmann H，Bibl M，et al.Tau protein phosphorylated at threonine 18l in CSF as neurochemical biomarker in Alzheimer’s disease：original data and review of the literature[J].Mol Neuresci，2004，23（2）：115-22.
[3]于德红，魏朝良，包永明，等.阿尔茨海默病与氧化应激[J].生物医学工程学杂志，2006，23（5）：1142-1144.
[4]李康铭，唐 农.老年性痴呆中医病因病机研究进展[J].光明中医，2012，27（9）：1926-1928.
[5]傅喆暾，黄宝康.补肾中药防治老年痴呆症研究进展[J].时珍国医国药，2003，23（1）：32-34.
[6]瞿礼萍，曾 南，卢陆飞，等.逍遥散对小鼠记忆力的影响[J].中药药理与临床，2008，24（6）：1-3.
[7]吴红彦，王彩霞.黑逍遥散对AD小鼠学习记忆及抗氧化能力的影响[A].甘肃中医学院学报，2010，27（1）：9-11.
[8]吴红彦，王虎平，王彩霞.黑逍遥散对老年性痴呆的防治作用及其机制研究[J].时珍国医国药，2011，22（4）：921-913.
[9]吴红彦，王虎平.从肝脾论治老年性痴呆及逍遥散对老年痴呆模型小学习记忆能力、中枢胆碱能神经元活性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2010，5（16）：190-192.
[10]王亚利，宋天保，路明，等.Aβ诱导PC-12细胞凋亡建立阿尔茨海默病细胞模型[J].西安医科大学学报，2002，23（2）：129-132.
[11]曲喜英，祝其锋.复方丹参注射液对H2O2 诱导的PC12细胞凋亡的保护作用[J].中国新药杂志，2005，14（11）：1284-1288.
[12]卓烨烨，张汉霆，徐江平.氧化应激与阿尔采末病[J].中国药理学通报，2010，26 （4）：435-437.
[13]金蓓蓓，陈 勤，陈庆林.阿魏酸对拟痴呆小鼠学习记忆和海马胶质纤维酸性蛋白表达的影响[J].激光生物学报，2011，20（4）：484-489.
[14]冯 星，王正濂，林永成，等.双白术内酯对Aβ1-40致痴呆模型大鼠的作用[J].中国药理学通报，2009，25（7）：949-951.
[15]金 惠，赵英博，江 维，等.茯苓药理作用及临床应用研究进展[J].湖北中医杂志，2008，30（4）：59-61.
[16]朱敏娟，杨 静.异甘草素对丙泊酚致小鼠学习记忆障碍的影响[J].数理医药学杂志，2011，24（2）：170-172.
[17]叶怀义，龚赋岚，尚 明.甘草黄酮抗衰老作用的研究[J].哈尔滨商业大学报，2004，20（1）：93-97.
[18]史佳琳，杨 菁，徐新利，等.地黄寡糖对谷氨酸诱导海马神经元损伤的影响[J].中国药理学通报，2009，25（3）：357-361.
[19]董 榕，刘伲娜，昊同智，等.柴胡注射液对噪音所致学习记忆障碍小鼠的改善作用及机制[J].中国行为医学科学，2007，16（12）：1074-1076.（收稿日期：2014-06-10）