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摘要：以双单倍体马铃薯（Solanum tuberosum）DM1-3-516-R44的无菌茎段、叶片作为材料，构建马铃薯离体再生体系。结果表明，茎段愈伤组织适宜的诱导培养基BI为MS 0.5 mg/L IAA 2.5 mg/L 6-BA，叶片愈伤组织适宜的诱导培养基BN为MS 1 mg/L NAA 0.5 mg/L 6-BA，愈伤的平均诱导率均达95%以上，甚至可以全部诱导愈伤形成；愈伤组织分化不定芽适宜的培养基BZ为MS 3 mg/L 6-BA 0.5 mg/L ZT，分化率也达到90%左右。
关键词：马铃薯；双单倍体；愈伤组织诱导；再生体系
中图分类号：S532.043 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）10-0050-03
马铃薯（Solanum tuberosum）是粮蔬两用的经济作物[1]，我国对马铃薯的需求量日益增加。马铃薯于17世纪传入我国，并迅速在我国西北地区大面积取代低产的粮食作物，成为当时西北地区最重要的粮食作物之一[2]。由于马铃薯通过营养体繁殖，繁殖数代后会出现高染病率，从而影响马铃薯的产量、品质[3]。近年来，随着细胞培养技术、基因组学的发展，马铃薯的品质得到极大提高。在我国，大多数学者以MS普通培养基为基本培养基，添加适量的植物激素，以马铃薯茎段、叶片、薯块等为材料得到再生植株[4]。由于不同品种马铃薯的基因型存在差异，导致马铃薯对植物激素的耐受性也不尽相同，因而各品种马铃薯的再生体系无法完全套用[5-11]。本试验所用材料为2011年测序成功的马铃薯品种，探究其再生体系，旨在为后续马铃薯基因表达、转基因研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
以2011年7月测序成功的双单倍体马铃薯DM1-3-516-R44无菌试管苗（简称DM）为材料，在MS基础培养基中扩繁，培养温度为（25±2） ℃，光照时间为14 h/d，白天采用日光灯补光。由于其长势较弱，故采用生长近1个月的无菌苗作为材料。所用植物激素IAA、NAA、2，4-D、6-BA、ZT[12]以及试剂均为生工生物工程（上海）股份有限公司产品。
1.2 方法
结合DM本身特性，利用植物分裂素IAA、NAA、2，4-D和植物生长素6-BA、ZT不同浓度配比来诱导愈伤组织形成、不定芽分化[9，13-17]。
1.2.1 茎段、叶片的愈伤组织诱导 选取生长30 d左右的DM无菌马铃薯试管苗，分别切下叶片、茎段，去除叶片边缘。切取长为0.5 mm左右的茎段，不可带生长点。分别将上述材料放入加有植物激素的MS培养基中，培养25～30 d。
为了得到更加合适的配比，设定植物分裂素与植物生长素配比从高到低为梯度，进一步确定诱导茎段、叶片愈伤组织合适的植物激素配比。
1.2.2 愈伤分化不定芽培养基的选择 将愈伤组织放入含有不同激素浓度配比的MS基础培养基中。目前，学者们大多利用6-BA、NAA、GA3作为诱导芽分化的培养基[6，11，13，18-19]。结合本材料的特性以及前期预试验结果，选用不同浓度6-BA、ZT、IAA配比来确定分化诱导不定芽的培养基[11，20]。
2 结果与分析
2.1 不同激素配比对马铃薯愈伤组织诱导效率的影响
在6-BA和IAA激素组合中，大多数茎段在培养25 d左右时均有愈伤产生，当6-BA浓度低于IAA时，部分愈伤容易生根；当6-BA浓度与IAA浓度相差过大时，容易产生色绒毛状的致密愈伤，且形成时间较长。在叶片中，大多数叶片出现发黄、死亡现象，有些会出现生根现象。所以由结果可知，IAA只适合茎段愈伤的形成（表1）。当6-BA浓度过高时，部分叶片发黄、死亡；当6-BA或NAA浓度过高时，可能会产生细根；当NAA与6-BA浓度相当时会产生愈伤。茎段则部分不会形成愈伤或者愈伤过于疏松，呈透明膨大状，因此可以推测NAA不适宜茎段的愈伤形成（表2）。表3中，6-BA与2，4-D大部分浓度配比会使茎段、叶片产生疏松愈伤并生根；部分配比会产生疏松、透明愈伤，即6-BA、2，4-D组合形成的愈伤不适于分化。植物分裂素IAA适合双单倍体马铃薯DM茎段愈伤组织的诱导，植物分裂素NAA更适于双单倍体马铃薯DM叶片愈伤组织的诱导。只利用IAA或NAA时，愈伤诱导率远低于添加6-BA的愈伤诱导率。添加高浓度6-BA时，茎段、叶片的诱导率也相对较低，甚至出现发黑、发黄的迹象。由表4、表5可知，茎段愈伤组织适宜的诱导培养基BI为MS 0.5 mg/L IAA 2.5 mg/L 6-BA，叶片愈伤组织适宜的诱导培养基BN为MS 1 mg/L NAA 0.5 mg/L 6-BA。
化均较好。当6-BA浓度高于4 mg/L时，会延长愈伤组织分化所需时间。表7结果表明，6-BA与ZT适宜的浓度配比，不仅减少了愈伤组织分化时间，而且同时可作用于叶片、茎段愈伤。由表6、表7可知，影响愈伤组织分化效率最重要的因素是植物生长素浓度。当6-BA浓度低于3 mg/L时，明显发现愈伤组织分化时间延长，且分化的苗长势较弱；当6-BA浓度高于5 mg/L时，愈伤组织逐渐发黄，无法形成健康的幼苗。因此比较适宜的愈伤组织分化不定芽培养基BZ为MS 3 mg/L 6-BA 0.5 mg/L ZT。
3 结论
由于各种植物的基因存在差异，因此植物对激素的耐受性也存在很大区别。本试验经过大量筛选，初步筛选出茎段愈伤组织适宜的诱导培养基BI为MS IAA 0.5 mg/L 6-BA 2.5 mg/L，叶片愈伤组织适宜的诱导培养基BN为MS 1 mg/L NAA 0.5 mg/L 6-BA，愈伤组织分化不定芽适宜的培养基BZ为MS 3 mg/L 6-BA 0.5 mg/L ZT，这与前人研究结果[8-10，21]一致。 参考文献：
[1]曲 明，宋雅秋.粮蔬两用作物——马铃薯[J]. 吉林农业，2010（7）：74.
[2]张绍文，孙中伟.马铃薯史话[J]. 中国瓜菜，2008，21（4）：58-59.
[3]李彩霞.脱毒马铃薯种性退化对品种性状的影响[J]. 河南农业科学，2012，41（8）：49-51.
[4]方贯娜，庞淑敏.马铃薯愈伤组织再生体系的研究进展[J]. 中国马铃薯，2012，26（5）：307-310.
[5]肖关丽，郭华春.马铃薯内源激素研究进展[J]. 云南农业大学学报：自然科学版，2007，22（3）：431-434.
[6]罗 源，陈耀锋，李春莲，等. 马铃薯茎段愈伤组织培养体系的优化[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2007，35（10）：159-162.
[7]李 云，卢其能，赵昶灵.影响马铃薯再生体系建立的主要因素[J]. 安徽农业科学，2010，38（28）：15487-15489，15494.
[8]秦 敏，郜 刚.马铃薯再生体系的建立及其遗传分析[J]. 中国马铃薯，2005，19（5）：270-273.
[9]齐恩芳，张金文，王一航.马铃薯茎段再生的植物激素配比优化[J]. 甘肃农业大学学报，2006，41（6）：14-17.
[10]张之为，赵 君，樊明寿，等. 马铃薯不同品种叶片再生体系的建立[J]. 四川农业大学学报，2011，29（1）：61-68.
[11]邱 礽，陶 刚，朱 英，等. 马铃薯品种茎段愈伤组织诱导和植株再生的研究[J]. 贵州农业科学，2009，37（10）：11-13.
[12]杨立军.植物生长物质及其在马铃薯生长发育研究中的应用[J]. 黑龙江农业科学，2005（1）：49-52.
[13]李 云，卢其能，赵昶灵，等. 二倍体马铃薯野生种高效再生体系的建立[J]. 江苏农业科学，2011（1）：62-64.
[14]王 宪.二倍体马铃薯再生体系建立及耐盐愈伤组织的筛选[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2012.
[15]晁祥健，杨 煜，金黎平，等. 二倍体马铃薯高效再生体系的建立[J]. 园艺学报，2009，36（1）：109-114.
[16]杨 春.生长素和细胞分裂素在马铃薯愈伤组织分化中的作用[J]. 山西农业科学，2008，36（7）：40-42.
[17]石 虎，杨永智，周 云，等. 马铃薯新品种青薯9号高效再生体系的建立[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：14-19.
[18]栾雨时，徐品三，夏秀英，等. 适于马铃薯茎段再生的植物激素配比选择[J]. 中国马铃薯，2004，18（3）：143-144.
[19]黄雪丽.马铃薯茎尖脱毒、愈伤组织诱导及分化技术优化研究[D]. 雅安：四川农业大学，2009.
[20]李 晶.马铃薯再生体系的建立及遗传转化的研究[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2003.
[21]姜国勇，薛 静，张玉娜，等. 马铃薯转化体系中愈伤组织的诱导效应[J]. 莱阳农学院学报，1998，15（3）：7-10.云巾宴，任春宇，车 达，等. 气肿疽梭菌PCR检测方法的建立[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：53-55.
关键词：马铃薯；双单倍体；愈伤组织诱导；再生体系
中图分类号：S532.043 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）10-0050-03
马铃薯（Solanum tuberosum）是粮蔬两用的经济作物[1]，我国对马铃薯的需求量日益增加。马铃薯于17世纪传入我国，并迅速在我国西北地区大面积取代低产的粮食作物，成为当时西北地区最重要的粮食作物之一[2]。由于马铃薯通过营养体繁殖，繁殖数代后会出现高染病率，从而影响马铃薯的产量、品质[3]。近年来，随着细胞培养技术、基因组学的发展，马铃薯的品质得到极大提高。在我国，大多数学者以MS普通培养基为基本培养基，添加适量的植物激素，以马铃薯茎段、叶片、薯块等为材料得到再生植株[4]。由于不同品种马铃薯的基因型存在差异，导致马铃薯对植物激素的耐受性也不尽相同，因而各品种马铃薯的再生体系无法完全套用[5-11]。本试验所用材料为2011年测序成功的马铃薯品种，探究其再生体系，旨在为后续马铃薯基因表达、转基因研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
以2011年7月测序成功的双单倍体马铃薯DM1-3-516-R44无菌试管苗（简称DM）为材料，在MS基础培养基中扩繁，培养温度为（25±2） ℃，光照时间为14 h/d，白天采用日光灯补光。由于其长势较弱，故采用生长近1个月的无菌苗作为材料。所用植物激素IAA、NAA、2，4-D、6-BA、ZT[12]以及试剂均为生工生物工程（上海）股份有限公司产品。
1.2 方法
结合DM本身特性，利用植物分裂素IAA、NAA、2，4-D和植物生长素6-BA、ZT不同浓度配比来诱导愈伤组织形成、不定芽分化[9，13-17]。
1.2.1 茎段、叶片的愈伤组织诱导 选取生长30 d左右的DM无菌马铃薯试管苗，分别切下叶片、茎段，去除叶片边缘。切取长为0.5 mm左右的茎段，不可带生长点。分别将上述材料放入加有植物激素的MS培养基中，培养25～30 d。
为了得到更加合适的配比，设定植物分裂素与植物生长素配比从高到低为梯度，进一步确定诱导茎段、叶片愈伤组织合适的植物激素配比。
1.2.2 愈伤分化不定芽培养基的选择 将愈伤组织放入含有不同激素浓度配比的MS基础培养基中。目前，学者们大多利用6-BA、NAA、GA3作为诱导芽分化的培养基[6，11，13，18-19]。结合本材料的特性以及前期预试验结果，选用不同浓度6-BA、ZT、IAA配比来确定分化诱导不定芽的培养基[11，20]。
2 结果与分析
2.1 不同激素配比对马铃薯愈伤组织诱导效率的影响
在6-BA和IAA激素组合中，大多数茎段在培养25 d左右时均有愈伤产生，当6-BA浓度低于IAA时，部分愈伤容易生根；当6-BA浓度与IAA浓度相差过大时，容易产生色绒毛状的致密愈伤，且形成时间较长。在叶片中，大多数叶片出现发黄、死亡现象，有些会出现生根现象。所以由结果可知，IAA只适合茎段愈伤的形成（表1）。当6-BA浓度过高时，部分叶片发黄、死亡；当6-BA或NAA浓度过高时，可能会产生细根；当NAA与6-BA浓度相当时会产生愈伤。茎段则部分不会形成愈伤或者愈伤过于疏松，呈透明膨大状，因此可以推测NAA不适宜茎段的愈伤形成（表2）。表3中，6-BA与2，4-D大部分浓度配比会使茎段、叶片产生疏松愈伤并生根；部分配比会产生疏松、透明愈伤，即6-BA、2，4-D组合形成的愈伤不适于分化。植物分裂素IAA适合双单倍体马铃薯DM茎段愈伤组织的诱导，植物分裂素NAA更适于双单倍体马铃薯DM叶片愈伤组织的诱导。只利用IAA或NAA时，愈伤诱导率远低于添加6-BA的愈伤诱导率。添加高浓度6-BA时，茎段、叶片的诱导率也相对较低，甚至出现发黑、发黄的迹象。由表4、表5可知，茎段愈伤组织适宜的诱导培养基BI为MS 0.5 mg/L IAA 2.5 mg/L 6-BA，叶片愈伤组织适宜的诱导培养基BN为MS 1 mg/L NAA 0.5 mg/L 6-BA。
化均较好。当6-BA浓度高于4 mg/L时，会延长愈伤组织分化所需时间。表7结果表明，6-BA与ZT适宜的浓度配比，不仅减少了愈伤组织分化时间，而且同时可作用于叶片、茎段愈伤。由表6、表7可知，影响愈伤组织分化效率最重要的因素是植物生长素浓度。当6-BA浓度低于3 mg/L时，明显发现愈伤组织分化时间延长，且分化的苗长势较弱；当6-BA浓度高于5 mg/L时，愈伤组织逐渐发黄，无法形成健康的幼苗。因此比较适宜的愈伤组织分化不定芽培养基BZ为MS 3 mg/L 6-BA 0.5 mg/L ZT。
3 结论
由于各种植物的基因存在差异，因此植物对激素的耐受性也存在很大区别。本试验经过大量筛选，初步筛选出茎段愈伤组织适宜的诱导培养基BI为MS IAA 0.5 mg/L 6-BA 2.5 mg/L，叶片愈伤组织适宜的诱导培养基BN为MS 1 mg/L NAA 0.5 mg/L 6-BA，愈伤组织分化不定芽适宜的培养基BZ为MS 3 mg/L 6-BA 0.5 mg/L ZT，这与前人研究结果[8-10，21]一致。 参考文献：
[1]曲 明，宋雅秋.粮蔬两用作物——马铃薯[J]. 吉林农业，2010（7）：74.
[2]张绍文，孙中伟.马铃薯史话[J]. 中国瓜菜，2008，21（4）：58-59.
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[13]李 云，卢其能，赵昶灵，等. 二倍体马铃薯野生种高效再生体系的建立[J]. 江苏农业科学，2011（1）：62-64.
[14]王 宪.二倍体马铃薯再生体系建立及耐盐愈伤组织的筛选[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2012.
[15]晁祥健，杨 煜，金黎平，等. 二倍体马铃薯高效再生体系的建立[J]. 园艺学报，2009，36（1）：109-114.
[16]杨 春.生长素和细胞分裂素在马铃薯愈伤组织分化中的作用[J]. 山西农业科学，2008，36（7）：40-42.
[17]石 虎，杨永智，周 云，等. 马铃薯新品种青薯9号高效再生体系的建立[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：14-19.
[18]栾雨时，徐品三，夏秀英，等. 适于马铃薯茎段再生的植物激素配比选择[J]. 中国马铃薯，2004，18（3）：143-144.
[19]黄雪丽.马铃薯茎尖脱毒、愈伤组织诱导及分化技术优化研究[D]. 雅安：四川农业大学，2009.
[20]李 晶.马铃薯再生体系的建立及遗传转化的研究[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2003.
[21]姜国勇，薛 静，张玉娜，等. 马铃薯转化体系中愈伤组织的诱导效应[J]. 莱阳农学院学报，1998，15（3）：7-10.云巾宴，任春宇，车 达，等. 气肿疽梭菌PCR检测方法的建立[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：53-55.