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摘 要：通过化学交联方法制备出水凝胶伤口敷料，分别测定其细胞毒性、抗菌性和创面愈合并进行对比研究。结果表明：所制备的水凝胶伤口敷料具有抗菌性，并且随着十一碳烯酰胺丙基甜菜碱含量的增加其抗菌性能随之增加;具有良好的生物相容性，通过动物创伤模型试验证明水凝胶伤口敷料具有较好的创面促愈性能。
关键词：水凝胶;抗菌;促愈合
伤口的愈合是一个复杂的生理过程，其中包括止血期、炎症期、修复期和成熟期，小伤口可以进行自行愈合，但较大伤口需要伤口敷料进行辅助治疗，伤口敷料具有促进创面愈合和保护创面不收感染的特点，广泛应用于临床领域[1]。伤口敷料是一类用于创伤、烧伤、溃疡等伤口覆盖的医用材料，其主要作用是吸收渗出液防止渗液感染周围正常皮肤及保护伤口免受细菌及尘粒等外源污染，医用敷料的临床需求巨大。随着人民生活质量不断增长以及老年化的加快，医用敷料的需求量也在逐年增加，尤其对高性能功能性伤口敷料提出了更高的要求。近年来，从全球发展趋势看，人们对多功能、新材质、高附加值医用敷料的需求越来越迫切，医用敷料每年都保持20%以上的速度增长;从国内发展趋势看，目前，临床对新型多功能医用敷料有较大需求[2]。
水凝胶敷料作为一种新型生物医用敷料，因其具有可调控性、含水量高且与细胞外基质相似结构等优点得到广泛应用[3]。在水凝胶伤口敷料体系中，一般以卡波姆是主要凝胶基材[4]，聚乙烯醇凝胶黏弹性好，可改善凝胶的外观和肤感，甘油具有保湿性，加入适量甘油使凝胶更有光泽。海藻酸钠是一种天然高分子多糖，有高物理保湿作用，为伤口提供湿性愈合环境[56]，不被人体降解吸收[78]。十一碳烯酰胺丙基甜菜碱通过有效降低液体表面张力，减少微生物负荷和微生物定植，阻止细菌生物膜形成，控制感染[9];本研究通过制备具有抗菌性的水凝胶伤口敷料研究其对于创面愈合的作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
试剂：聚乙烯醇，卡波姆，十一碳烯酰胺丙基甜菜碱，氢氧化钠，海藻酸钠，甘油。
细胞：L929小鼠成纤维细胞，广州吉妮欧生物科技有限公司。
菌种：SA（金黄色葡萄球菌，ATCC6538），广东环凯微生物有限公司。
动物：清洁级SD大鼠，6周龄，雄性，（180±20）g，广东省动物中心提供。
仪器：SIEMENS冰箱;电热恒温培养箱;新颖立式恒温振荡器;立式压力蒸汽灭菌器;生物安全柜;单人净化工作台;CO2培养箱;荧光倒置显微镜;酶标分析仪;皮肤活检器。
1.2 实验方法
1.2.1 水凝胶伤口敷料制备
（1）溶胀：称取一定量的卡波姆撒在水面上静置12h，使卡波姆完全溶胀;
（2）溶解：称取一定量的聚乙烯醇和水相混合，加热搅拌至90℃，保温20分钟，使聚乙烯醇完全溶解;
（3）分散溶解：称取一定量的十一碳烯酰胺丙基甜菜碱和海藻酸钠，加入甘油，搅拌至分散均匀，加入一定量的水，继续搅拌至完全溶解;
（4）混合：将（1）（2）和（3）混合，搅拌至均匀;
（5）调pH：配制氢氧化钠水溶液调节pH至5.5～7.5。
1.2.2 细胞毒性试验
按GB/T 16886.52017医疗器械生物学评价第五部分：体外细胞毒性试验浸提液试验进行。
细胞株：小鼠成纤维细胞L929
试验组：水凝胶伤口敷料
阴性对照组：高密度聚乙烯颗粒按0.2g/mL的比例加入MEM完全培养液
阳性对照组：含0.5%苯酚的MEM完全培养液
空白对照组：MEM完全培养液
浸提介质：MEM完全培养液（即含10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素）
取水凝胶伤口敷料1g，按0.1g/ml比例进行浸提，浸提介质为含血清培养基，将供试品和对照品在60r/min震荡条件下37℃±1℃浸提24±2h，取浸提液过滤并进行试验。
将培养48h～72h生长旺盛的细胞消化制备成密度为15×105个/ml的细胞悬液，接种于6孔板，每皿2ml，置于5%CO2培养箱37℃培养至近汇合单层细胞形成。弃掉原培养液，分别加入阴性对照液、阳性对照液、供试品液各3皿，置于5%CO2培养箱37℃培养48h，显微镜观察细胞状态。
1.2.3 抗菌试验
将白平纹布片放在含肥皂的水中煮沸30min，自来水洗净，再用蒸馏水煮沸10min，用蒸馏水漂洗至pH呈中性，晾干，裁剪成10mm×10mm布块，使用前高温灭菌备用。
取金色葡萄球菌24h新鮮斜面培养物用PBS洗下，稀释成5.0×106CFU/mL～5.0×107CFU/mL菌悬液备用。取10μL菌悬液滴染于白平纹布块上，36℃±1℃烘干备用。按5g/片的量称取样品于无菌平皿内，置20℃±1℃水浴5min，用无菌镊子取染菌布块，使布块完全浸没于样品中，立即计时，待染菌载体与水凝胶伤口敷料样品相互作用6小时，分别取出染菌布块放入5.0mL PBS试管中，混匀，振荡，将试验菌洗下，分别吸取1.0mL样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿。取同批次PBS作阴性对照。所有试验样本和对照样本均在36℃±1℃培养24h观察结果。试验设置两个平行样，计算抑菌率。
1.2.4 创面愈合试验
大鼠注射麻醉，背部剪毛，75%酒精擦拭消毒皮肤，以直径1cm的皮肤活检器在鼠背部正中距离耳后正中线4cm处形成一个1cm×1cm的圆形伤口，切除范围深达筋膜，按以下方法处理伤口。 观察第0D、2D、4D、6D、8D观察伤口，每次需清理伤口、拍照并重新换药包扎。Imagel软件测量伤口面积，计算伤口愈合率。
2 结果
2.1 细胞毒性
按照1.2.2的方法对不同含量的水凝胶伤口敷料进行体外细胞毒性测试，结果见图1。
由图1可以看出，三组水凝胶伤口敷料试验组均不超过20%的细胞呈圆缩、疏松贴壁、无胞浆内颗粒或显示形态学方面的改变，偶见细胞溶解，仅观察到轻微的细胞生长抑制现象，属于1级细胞毒性，与阴性对照组相当，符合创面敷料细胞毒性要求。
2.2 抗菌性
按照1.2.3的方法对不同含量的水凝胶伤口敷料进行抗菌测试，结果见图2和表1。
由图2和表2可以看出，不同含量的水凝胶伤口敷料对金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为47.9%、79.9%和88.5%，均具有抗菌性。说明水凝胶伤口敷料的抗菌性不完全来自十一碳烯酰胺丙基甜菜碱，不添十一碳烯酰胺丙基甜菜堿的水凝胶伤口敷料也表现出一定的抗菌性能，这可能是聚乙烯醇的表面活性造成的结果。此外，随着十一碳烯酰胺丙基甜菜碱添加量的增加，水凝胶伤口敷料的抗菌性能增加。
2.3 创面愈合
按照1.2.4的方法对水凝胶伤口敷料进行SD大鼠创伤促愈合验证，结果见图3和表3。
由表3和图3结果可知，试验组第八天大鼠伤口平均愈合率为94.90%，高于阴性对照组66.68%，说明水凝胶伤口敷料具有促进伤口愈合的作用，且促愈合效果优于马应龙产品和卡波姆凝胶产品。
3 讨论
水凝胶伤口敷料在创面护理中使用比较广泛，但其在抑菌性方面无法满足临床需要，含十一碳烯酰胺丙基甜菜碱水凝胶伤口敷料不仅具有促创面愈合性还具有优良的抗菌性。从体外细胞毒性结果可以看出，不同十一碳烯酰胺丙基甜菜碱含量的水凝胶伤口敷料属于1级细胞毒性，符合创面敷料细胞毒性要求。通过对比不同十一碳烯酰胺丙基甜菜碱含量的水凝胶伤口敷料抗菌率的结果，可以看出，随着十一碳烯酰胺丙基甜菜碱添加量的增加，水凝胶伤口敷料的抗菌性能增加。最后通过SD大鼠创面愈合试验结果可以看出，说明水凝胶伤口敷料具有促进伤口愈合的作用，且促愈合效果优于竞品马应龙产品和卡波姆凝胶产品。
4 结论
所制备的水凝胶伤口敷料具有抗菌性，并且随着十一碳烯酰胺丙基甜菜碱含量的增加其抗菌性能随之增加;具有良好的生物相容性，通过动物创伤模型试验证明水凝胶伤口敷料具有较好的创面促愈性能，表明水凝胶伤口敷料将是较为理想的新型敷料产品。
参考文献：
[1]Soodaditya，Granickmark S，Tomasellinancy L，et al.Wound Dressings and Comparative Effectiveness Data[J].Advances in wound care，2014，3（8）：511529.
[2]王丰艳.载银聚乙烯醇/羧甲基壳聚糖/海藻酸钠水凝胶伤口敷料的制备及性能表征[D].北京：北京矿业大学，2020.
[3]Gupta A，Kowalczuk M，Heaselgrave W，et al.The Production and Application of Hydrogels for Wound Management：A Review[J].European Polymer Journal，2019：134151.
[4]甘春英，杜士明，刘新云，等.盐酸左氧氟沙星凝胶剂的制备与质量控制[J].中国医院药学杂志，2006，（07）：878879.
[5]秦益民.海藻酸盐医用敷料的临床应用[J].纺织学报，2014，35（04）：148153.
[6]Dantas M.D.; Cavalcante D.R.，Araújo F.E.，Barretto S.R.，Aciole G.T.，Pinheiro A.L.，Ribeiro M.A.，LimaVerde IB.，Melo C.M.，Cardoso J.C.，et al.Improvement of dermalburn healing by combining sodium alginate/chitosanbased films and low level laser therapy[J].J.Photochem.Photobiol.B Biol.2011，105，515.
[7]邓雅婷，刘莉，杨勇，梅其炳.多糖代谢动力学研究的进展[J].中国药学杂志，2012，47（08）：573576.
[8]张运铎.海藻酸钠功能特性应用研究进展[J].河南科技，2011，（17）：5657.
[9]张寅，张勤.从护理的角度浅谈伤口调理[J].中华损伤与修复杂志（电子版），2014，9（01）：1316.
作者简介：吴帅（1988— ），男，汉族，江西人，硕士，中级工程师，研究方向：生物材料、创面修复材料。
关键词：水凝胶;抗菌;促愈合
伤口的愈合是一个复杂的生理过程，其中包括止血期、炎症期、修复期和成熟期，小伤口可以进行自行愈合，但较大伤口需要伤口敷料进行辅助治疗，伤口敷料具有促进创面愈合和保护创面不收感染的特点，广泛应用于临床领域[1]。伤口敷料是一类用于创伤、烧伤、溃疡等伤口覆盖的医用材料，其主要作用是吸收渗出液防止渗液感染周围正常皮肤及保护伤口免受细菌及尘粒等外源污染，医用敷料的临床需求巨大。随着人民生活质量不断增长以及老年化的加快，医用敷料的需求量也在逐年增加，尤其对高性能功能性伤口敷料提出了更高的要求。近年来，从全球发展趋势看，人们对多功能、新材质、高附加值医用敷料的需求越来越迫切，医用敷料每年都保持20%以上的速度增长;从国内发展趋势看，目前，临床对新型多功能医用敷料有较大需求[2]。
水凝胶敷料作为一种新型生物医用敷料，因其具有可调控性、含水量高且与细胞外基质相似结构等优点得到广泛应用[3]。在水凝胶伤口敷料体系中，一般以卡波姆是主要凝胶基材[4]，聚乙烯醇凝胶黏弹性好，可改善凝胶的外观和肤感，甘油具有保湿性，加入适量甘油使凝胶更有光泽。海藻酸钠是一种天然高分子多糖，有高物理保湿作用，为伤口提供湿性愈合环境[56]，不被人体降解吸收[78]。十一碳烯酰胺丙基甜菜碱通过有效降低液体表面张力，减少微生物负荷和微生物定植，阻止细菌生物膜形成，控制感染[9];本研究通过制备具有抗菌性的水凝胶伤口敷料研究其对于创面愈合的作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
试剂：聚乙烯醇，卡波姆，十一碳烯酰胺丙基甜菜碱，氢氧化钠，海藻酸钠，甘油。
细胞：L929小鼠成纤维细胞，广州吉妮欧生物科技有限公司。
菌种：SA（金黄色葡萄球菌，ATCC6538），广东环凯微生物有限公司。
动物：清洁级SD大鼠，6周龄，雄性，（180±20）g，广东省动物中心提供。
仪器：SIEMENS冰箱;电热恒温培养箱;新颖立式恒温振荡器;立式压力蒸汽灭菌器;生物安全柜;单人净化工作台;CO2培养箱;荧光倒置显微镜;酶标分析仪;皮肤活检器。
1.2 实验方法
1.2.1 水凝胶伤口敷料制备
（1）溶胀：称取一定量的卡波姆撒在水面上静置12h，使卡波姆完全溶胀;
（2）溶解：称取一定量的聚乙烯醇和水相混合，加热搅拌至90℃，保温20分钟，使聚乙烯醇完全溶解;
（3）分散溶解：称取一定量的十一碳烯酰胺丙基甜菜碱和海藻酸钠，加入甘油，搅拌至分散均匀，加入一定量的水，继续搅拌至完全溶解;
（4）混合：将（1）（2）和（3）混合，搅拌至均匀;
（5）调pH：配制氢氧化钠水溶液调节pH至5.5～7.5。
1.2.2 细胞毒性试验
按GB/T 16886.52017医疗器械生物学评价第五部分：体外细胞毒性试验浸提液试验进行。
细胞株：小鼠成纤维细胞L929
试验组：水凝胶伤口敷料
阴性对照组：高密度聚乙烯颗粒按0.2g/mL的比例加入MEM完全培养液
阳性对照组：含0.5%苯酚的MEM完全培养液
空白对照组：MEM完全培养液
浸提介质：MEM完全培养液（即含10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素）
取水凝胶伤口敷料1g，按0.1g/ml比例进行浸提，浸提介质为含血清培养基，将供试品和对照品在60r/min震荡条件下37℃±1℃浸提24±2h，取浸提液过滤并进行试验。
将培养48h～72h生长旺盛的细胞消化制备成密度为15×105个/ml的细胞悬液，接种于6孔板，每皿2ml，置于5%CO2培养箱37℃培养至近汇合单层细胞形成。弃掉原培养液，分别加入阴性对照液、阳性对照液、供试品液各3皿，置于5%CO2培养箱37℃培养48h，显微镜观察细胞状态。
1.2.3 抗菌试验
将白平纹布片放在含肥皂的水中煮沸30min，自来水洗净，再用蒸馏水煮沸10min，用蒸馏水漂洗至pH呈中性，晾干，裁剪成10mm×10mm布块，使用前高温灭菌备用。
取金色葡萄球菌24h新鮮斜面培养物用PBS洗下，稀释成5.0×106CFU/mL～5.0×107CFU/mL菌悬液备用。取10μL菌悬液滴染于白平纹布块上，36℃±1℃烘干备用。按5g/片的量称取样品于无菌平皿内，置20℃±1℃水浴5min，用无菌镊子取染菌布块，使布块完全浸没于样品中，立即计时，待染菌载体与水凝胶伤口敷料样品相互作用6小时，分别取出染菌布块放入5.0mL PBS试管中，混匀，振荡，将试验菌洗下，分别吸取1.0mL样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿。取同批次PBS作阴性对照。所有试验样本和对照样本均在36℃±1℃培养24h观察结果。试验设置两个平行样，计算抑菌率。
1.2.4 创面愈合试验
大鼠注射麻醉，背部剪毛，75%酒精擦拭消毒皮肤，以直径1cm的皮肤活检器在鼠背部正中距离耳后正中线4cm处形成一个1cm×1cm的圆形伤口，切除范围深达筋膜，按以下方法处理伤口。 观察第0D、2D、4D、6D、8D观察伤口，每次需清理伤口、拍照并重新换药包扎。Imagel软件测量伤口面积，计算伤口愈合率。
2 结果
2.1 细胞毒性
按照1.2.2的方法对不同含量的水凝胶伤口敷料进行体外细胞毒性测试，结果见图1。
由图1可以看出，三组水凝胶伤口敷料试验组均不超过20%的细胞呈圆缩、疏松贴壁、无胞浆内颗粒或显示形态学方面的改变，偶见细胞溶解，仅观察到轻微的细胞生长抑制现象，属于1级细胞毒性，与阴性对照组相当，符合创面敷料细胞毒性要求。
2.2 抗菌性
按照1.2.3的方法对不同含量的水凝胶伤口敷料进行抗菌测试，结果见图2和表1。
由图2和表2可以看出，不同含量的水凝胶伤口敷料对金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为47.9%、79.9%和88.5%，均具有抗菌性。说明水凝胶伤口敷料的抗菌性不完全来自十一碳烯酰胺丙基甜菜碱，不添十一碳烯酰胺丙基甜菜堿的水凝胶伤口敷料也表现出一定的抗菌性能，这可能是聚乙烯醇的表面活性造成的结果。此外，随着十一碳烯酰胺丙基甜菜碱添加量的增加，水凝胶伤口敷料的抗菌性能增加。
2.3 创面愈合
按照1.2.4的方法对水凝胶伤口敷料进行SD大鼠创伤促愈合验证，结果见图3和表3。
由表3和图3结果可知，试验组第八天大鼠伤口平均愈合率为94.90%，高于阴性对照组66.68%，说明水凝胶伤口敷料具有促进伤口愈合的作用，且促愈合效果优于马应龙产品和卡波姆凝胶产品。
3 讨论
水凝胶伤口敷料在创面护理中使用比较广泛，但其在抑菌性方面无法满足临床需要，含十一碳烯酰胺丙基甜菜碱水凝胶伤口敷料不仅具有促创面愈合性还具有优良的抗菌性。从体外细胞毒性结果可以看出，不同十一碳烯酰胺丙基甜菜碱含量的水凝胶伤口敷料属于1级细胞毒性，符合创面敷料细胞毒性要求。通过对比不同十一碳烯酰胺丙基甜菜碱含量的水凝胶伤口敷料抗菌率的结果，可以看出，随着十一碳烯酰胺丙基甜菜碱添加量的增加，水凝胶伤口敷料的抗菌性能增加。最后通过SD大鼠创面愈合试验结果可以看出，说明水凝胶伤口敷料具有促进伤口愈合的作用，且促愈合效果优于竞品马应龙产品和卡波姆凝胶产品。
4 结论
所制备的水凝胶伤口敷料具有抗菌性，并且随着十一碳烯酰胺丙基甜菜碱含量的增加其抗菌性能随之增加;具有良好的生物相容性，通过动物创伤模型试验证明水凝胶伤口敷料具有较好的创面促愈性能，表明水凝胶伤口敷料将是较为理想的新型敷料产品。
参考文献：
[1]Soodaditya，Granickmark S，Tomasellinancy L，et al.Wound Dressings and Comparative Effectiveness Data[J].Advances in wound care，2014，3（8）：511529.
[2]王丰艳.载银聚乙烯醇/羧甲基壳聚糖/海藻酸钠水凝胶伤口敷料的制备及性能表征[D].北京：北京矿业大学，2020.
[3]Gupta A，Kowalczuk M，Heaselgrave W，et al.The Production and Application of Hydrogels for Wound Management：A Review[J].European Polymer Journal，2019：134151.
[4]甘春英，杜士明，刘新云，等.盐酸左氧氟沙星凝胶剂的制备与质量控制[J].中国医院药学杂志，2006，（07）：878879.
[5]秦益民.海藻酸盐医用敷料的临床应用[J].纺织学报，2014，35（04）：148153.
[6]Dantas M.D.; Cavalcante D.R.，Araújo F.E.，Barretto S.R.，Aciole G.T.，Pinheiro A.L.，Ribeiro M.A.，LimaVerde IB.，Melo C.M.，Cardoso J.C.，et al.Improvement of dermalburn healing by combining sodium alginate/chitosanbased films and low level laser therapy[J].J.Photochem.Photobiol.B Biol.2011，105，515.
[7]邓雅婷，刘莉，杨勇，梅其炳.多糖代谢动力学研究的进展[J].中国药学杂志，2012，47（08）：573576.
[8]张运铎.海藻酸钠功能特性应用研究进展[J].河南科技，2011，（17）：5657.
[9]张寅，张勤.从护理的角度浅谈伤口调理[J].中华损伤与修复杂志（电子版），2014，9（01）：1316.
作者简介：吴帅（1988— ），男，汉族，江西人，硕士，中级工程师，研究方向：生物材料、创面修复材料。