【摘 要】
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为获得具有和天然蛋白质类似功能与活性的COVID-19核衣壳蛋白并应用于实际检测中，首先根据Bac-to-bac昆虫表达系统和人工合成的COVID-19核衣壳蛋白（N蛋白）序列，将pFastBacTMHTB载体上的酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ分别加入上下游引物，利用PCR技术对N基因进行扩增，先后连接T-Vector pMD19（simple）载体与pFastBacTMHTB载体，并获得重组质粒p
【基金项目】
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云南省院士专家工作站（2018IC078）；
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为获得具有和天然蛋白质类似功能与活性的COVID-19核衣壳蛋白并应用于实际检测中，首先根据Bac-to-bac昆虫表达系统和人工合成的COVID-19核衣壳蛋白（N蛋白）序列，将pFastBacTMHTB载体上的酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ分别加入上下游引物，利用PCR技术对N基因进行扩增，先后连接T-Vector pMD19（simple）载体与pFastBacTMHTB载体，并获得重组质粒pMD19-T（simple）-COV19-N和pFastBacTMHTB-COV19-N,最终在DH10Bac细胞中构建重组杆粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N并使其在昆虫细胞Sf9内进行表达，获得重组蛋白后进行SDS-PAGE和WB分析。通过PCR方法成功扩增N基因，构建的重组质粒pMD19-T（simple）-COV19-N经PCR和双酶切鉴定均证明正确，在DH10Bac细胞内构建的重组杆粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N通过PCR鉴定得到预期2条带，大小分别为2 430,3 690 bp,证明成功得到重组杆粒，用该重组杆粒转染Sf9昆虫细胞，同时设立重组GFP蛋白对照组，转染120 h后分别收集重组N蛋白与重组GFP蛋白并制样；分别进行SDS-PAGE和WB分析，使用HRP-His标记抗体验证转染成功且重组N蛋白与重组GFP蛋白均在Sf9细胞内顺利表达，试验结果与预期相符，重组N蛋白条带大小约为46 ku。该试验成功构建了呼吸道冠状病毒N基因真核表达载体，并在昆虫细胞内成功表达，为建立ELISA检测方法等相关研究提供试验基础。
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