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[摘要] 目的 体外探讨PADI4基因与白血病细胞分化的关系。 方法 检测HL60、K562、U937等9株不同白血病细胞株中PADI4在mRNA水平的表达情况，建立ATRA诱导HL60细胞分化模型，然后分别利用RT-PCR及WB技术检测PADI4基因在转录和翻译水平的表达变化。 结果 不同类型的白血病细胞株中PADI4表达情况不同。ATRA诱导HL60细胞后，在药物作用的96 h内，随着药物作用时间的增加，在转录和翻译水平PADI4表达水平逐渐下调，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。 结论 PADI4与白血病细胞的分化有关，ATRA诱导HL60细胞分化后PADI4表达下调。
[关键词] 白血病；肽酰基精氨酸脱亚胺酶-4；HL-60细胞；细胞分化
[中图分类号] R733.71 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）08-28-03
PADI4（peptidylarginine deiminase 4）即肽酰基精氨酸脱亚胺酶-4，最早发现于人类白血病细胞HL60细胞中[1]。该酶在Ca2+存在的情况下可将多肽链中的精氨酸残基催化成瓜氨酸残基，此过程称之为瓜氨酸化。瓜氨酸化的蛋白往往改变其大分子构象，从而导致其生化活性发生改变[2]。已有研究表明在各种恶性肿瘤以及恶性肿瘤患者的血清中PADI4均高表达，但在正常及良性肿瘤中PADI4不表达或者表达很低，这说明PADI4与恶性肿瘤的发生、发展有关[3]。但是目前还没有PADI4与白血病细胞分化有关的研究报道，在信号通路以及其生理状态下的作用机制研究亦尚不明确。
1 材料与方法
1.1 一般资料
人急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60细胞及K562、U937细胞本实验室保存；Thp1、Raji、Jurkat、6T-CEM、Hut78和NB4等6株白血病细胞株购于中科院上海生命科学院细胞库，RPMI Medium 1640为Invitrogen产品，ATRA购于Sigma公司，以95%乙醇配制成1×10-6 M储存液，-20℃避光保存。
1.2 HL-60、K562、U937等9株白血病细胞株的培养及检测
HL60、K562、U937、Raji、6T-CEM、Jurkat、THP-1和NB4等8株白血病细胞株采用1640+10%胎牛血清，Hut78细胞采用IMDM+10%胎牛血清，其他培养条件均为：培养液中含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、300 mg/L L-谷氨酰胺，在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下常规培养，收集状态良好的细胞，RT-PCR检测PADI4在翻译水平的表达情况。
1.3 HL-60细胞分化模型的建立
HL-60细胞在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、300 mg/L，L-谷氨酰胺的1640培养液常规传代培养。取对数生长期细胞调整细胞密度为1×106/mL，加入1μM ATRA作用0、24、48、72、96 h后收集细胞，备用。以状态良好，常规隔两天半量换液传代培养，以未加药的细胞作为对照组。收集作用0、96 h细胞，常规操作，分别利用流式以及RT-PCR检测HL60细胞表面标志分子CD11b变化。
1.4 RT-PCR检测ATRA诱导的HL-60细胞分化模型中PADI4转录水平表达变化
收集0、24、48、72和96 h细胞，1500 r/min离心5 min，去上清，3 mL PBS洗涤3次，Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度仪测定RNA的浓度及纯度。用M-MLV（TaKaRa公司）逆转录cDNA，然后PCR扩增。扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，以DL2000为DNA marker，β-actin基因为内参照，GELDos1000凝胶成像分析仪分析扫描各条带，测定各目的基因表达量。引物序列如下：β-actin基因（540bp）F：GTGGGGCGCCCCAGGCACCA；R：CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC；PADI4基因（533bp）F：CCGTGTGACCCCAGAGCAGCCC；R：GTGCTCAGGGTCAGCGACA。
1.5 统计学处理
每组实验重复3次，采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析、方差齐性检验以及4个实验组与对照组的两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HL60、K562等9株白血病细胞株中PADI4转录水平表达情况
常规Trizol法提取细胞总RNA，然后做RNA定量，RT-PCR检测PADI4表达情况，以β-actin基因为内参。结果见图1。由结果可知，不同白血病细胞中PADI4转录水平的表达情况不同，其中HL60、Raji表达最高，K562、U937其次，这就说明PADI4或许与白血病细胞的分化有关系。
2.2 ATRA对HL60细胞分化的影响
常规操作，流式检测ATRA作用0 h和96 h的HL60细胞表面CD11b分子表达变化。结果见图2。由流式检测结果可知，ATRA作用96 h后，CD11b分子表达明显上调，说明ATRA诱导HL60细胞分化模型建立成功。
2.3 ATRA诱导HL60分化后PADI4表达变化
常规收集、检测ATRA分别作用0、24、48、72、96 h的细胞，通过目的条带与内参条带的灰度值的比值，实验独立重复做3次，3次的数据见表1。由统计分析结果可知，单因素方差分析实验组与对照组相比，具有统计学意义（P<0.01）；组与组之间多重比较P值也均小于0.01，故可得出结论1μM的ATRA诱导HL60细胞24 h后至诱导作用的96 h内，随着作用时间的延长，PADI4在转录水平逐渐降低，和对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。说明PADI4与白血病细胞的分化有关系，低水平表达的PADI4可诱导HL60细胞的分化。 3 讨论
近年来，白血病细胞的靶向杀伤治疗成为白血病治疗的发展趋势，在临床上有着良好的应用前景，已成为白血病可能治愈的手段，靶向基因的研究成为研究热点。
本研究通过检测9株不同类型的白血病细胞发现，在这9株细胞中PADI4均有表达，以此可以推测PADI4基因是白血病筛查的潜在靶点。研究表明PADI4主要表达在血液淋巴细胞，并且在炎症和免疫反应中发挥作用。因为由HL60细胞诱导的粒细胞和巨噬细胞中检测到了PADI4的表达，所以认为PADI4和这些细胞的分化、凋亡有关[4-7]。我们通过建立ATRA诱导HL60细胞分化模型检测也证明了随着HL60细胞分化程度的提高，PADI4表达逐渐下调。但是在生理状态下，PADI4的准确功能和作用底物还知之甚少。
到目前为止，对PADI4的调控机制还不明确。本研究通过建立ATRA诱导HL-60细胞的分化检测PADI4表达变化，在此基础上进而后续研究探索其可能的信号通路。Dong等[8]发现雌二醇可以通过经典和非经典途径调控PADI4的表达。在经典途径中，雌二醇和雌二醇受体结合形成复合体，然后经由启动子上的雌二醇反应元件调控PADI4表达。在非经典途径中，雌二醇-雌二醇受体复合物作用在AP-1、NF-Y和SP-1等转录因子上，而这些转录因子可以结合在PADI4的启动子上特异性的调控PADI4的表达。另一方面，Cuthbert等发现PADI4通过对这些基因的pS2-启动子上的H3组蛋白的瓜氨酸作用对抗H3组蛋白的甲基化作用从而抑制了雌二醇受体基因的表达。或许是通过PADI4的瓜氨酸化作用，雌二醇得以以负反馈的方式调控雌二醇敏感基因。近来，Tanikawa等[9]报道PADI4的第一个内含子区域有P53的结合位点，进而P53可以活化PADI4。进而他们发现敲除PADI4可以衰减P53介导的增长抑制活性，这表明PADI4介导的蛋白质的瓜氨酸化在P53信号通过路中发挥作用。Yao等[10]和Li等[11]运用染色体免疫共沉淀技术（chip）研究了P53靶基因的启动子，发现PADI4的过表达通过催化精氨酸残基为瓜氨酸残基抑制了精氨酸甲基化转移酶对H3组蛋白的甲基化作用。结果，P53靶基因表达下调，导致细胞凋亡过程和细胞周期的紊乱。Liu等[12]通过诱导体外培养的人类白血病细胞HL-60细胞和人类急性T淋巴白血病细胞Jurkat细胞的PADI4的过表达发现PADI4可以诱导P53、P21和Bax基因的表达上调，导致细胞周期停滞和线粒体介导的细胞凋亡。
迄今为止，很多生物标志分子已用于肿瘤诊断。但是对于肿瘤预后的大规模调查来说，这些生物标志的特异性和敏感性还不够，因为这些肿瘤标志仅仅在一种或几种肿瘤有表达。PADI4在各种恶性肿瘤中都高表达，但是在正常组织和良性肿瘤中不表达或表达很低。我们可以考虑用PADI4酶作为一种免疫组化标记，从而区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞，并且可以定义肿瘤的结构。因为可以检测到恶性肿瘤患者的血液中PADI4表达水平很高，但是手术切除肿瘤以后，患者血液中的PADI4表达水平明显降低，因此可以将该酶作为肿瘤预后的一种血清标志以弥补目前肿瘤诊断的方法的不足。此外，PADI4在肿瘤细胞表达的特殊性使得PADI4可以作为肿瘤治疗的潜在靶点。因此PADI4具有重要的临床应用价值。
目前，对于PADI4与白血病细胞分化的关系的研究甚少，本研究结果表明，不同类型的白血病细胞中PADI4均有表达，不同细胞表达情况不同，并且HL60细胞经过ATRA诱导分化后PADI4表达明显下调，说明PADI4基因与白血病细胞的分化有关，这为以后PADI4基因调控的研究以及体内试验研究提供的理论基础，为白血病的靶向治疗提供了新的潜在治疗靶点。
[参考文献]
[1] Nakashima K，Hagiwara T，Ishigami A，et al.Molecular characterization of peptidylarginine deiminase in HL-60 cells induced by retinoic acid and 1alpha，25-dihydroxyvitamin D（3）[J].J Biol Chem，1999， 274（39）：27786-27792.
[2] Arita K， Hashimoto H， Shimizu T， et al.Structural basis for Ca2+-induced activation of human PAD4[J]. Nat Struct Mol Biol，2004，11（8）：777-783.
[3] Chang X， Han J.Expression of Peptidylarginine Deiminase Type 4 （PAD4） in Various Tumors[J]. Molecular Carcinogenesis，2006， 45（3）：183-196.
[4] Asaga H，Nakashima K， Senshu T， et al.Immunocytochemical localization of peptidylarginine deiminase in human eosinophils and neutrophilsv[J]. J Leukoc Biol，2001， 70（1）：46-51.
[5] Chang X，Yamada R，Suzuki A，et al.Localization of peptidylarginine deiminase 4 （PADI4） and citrullinated protein in synovial tissue of rheumatoid arthritis[J]. Rheumatology，2005， 44（1）：40-50. [6] Gy?rgy B，Tóth E，Tarcsa E，et al.Citrullination： a posttranslational modification in health and disease[J]. Int J Biochem Cell Biol，2006，38（10）：1662-1677.
[7] Anzilottia C，Pratesia F，Tommasia C，et al.Peptidylarginine deiminase 4 and citrullination in health and disease[J].Autoimmunity Reviews，2010，9（3）：158-160.
[8] Dong S，Zhang Z，Takahara H. Estrogen-Enhanced peptidylarginine deiminase type IV Gene （PADI4） expression in MCF-7 cells is mediated by estrogen receptor-α-promoted transfactors activator protein-1， nuclear factor-Y and sp1[J].Mol Endocrinol，2007，21（7）：1617-1629.
[9] Tanikawa C，Ueda K，Nakagawa H，et al.Regulation of Protein Citrullination through p53/PADI4 Network in DNA Damage Response[J].Cancer Research，2009，69（22）：8761-8769.
[10] Yao H，Li P，Venters BJ，et al.Histone Arg modifications and p53 regulate the expression of OKL38， a mediator of apoptosis[J].J Biol Chem，2008， 283（29）：20060-20068.
[11] Li P，Yao H，Zhang Z，et al.Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase[J]. Mol Cell Biol，2008，28（15）：4745-4758.
[12] Liu G，Liao Y，Chang W，et al.Overexpression of peptidylarginine deiminase IV features in apoptosis of haematopoietic cells[J].Apoptosis，2006，11（2）：183-196.
（收稿日期：2013-03-22）
[关键词] 白血病；肽酰基精氨酸脱亚胺酶-4；HL-60细胞；细胞分化
[中图分类号] R733.71 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）08-28-03
PADI4（peptidylarginine deiminase 4）即肽酰基精氨酸脱亚胺酶-4，最早发现于人类白血病细胞HL60细胞中[1]。该酶在Ca2+存在的情况下可将多肽链中的精氨酸残基催化成瓜氨酸残基，此过程称之为瓜氨酸化。瓜氨酸化的蛋白往往改变其大分子构象，从而导致其生化活性发生改变[2]。已有研究表明在各种恶性肿瘤以及恶性肿瘤患者的血清中PADI4均高表达，但在正常及良性肿瘤中PADI4不表达或者表达很低，这说明PADI4与恶性肿瘤的发生、发展有关[3]。但是目前还没有PADI4与白血病细胞分化有关的研究报道，在信号通路以及其生理状态下的作用机制研究亦尚不明确。
1 材料与方法
1.1 一般资料
人急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60细胞及K562、U937细胞本实验室保存；Thp1、Raji、Jurkat、6T-CEM、Hut78和NB4等6株白血病细胞株购于中科院上海生命科学院细胞库，RPMI Medium 1640为Invitrogen产品，ATRA购于Sigma公司，以95%乙醇配制成1×10-6 M储存液，-20℃避光保存。
1.2 HL-60、K562、U937等9株白血病细胞株的培养及检测
HL60、K562、U937、Raji、6T-CEM、Jurkat、THP-1和NB4等8株白血病细胞株采用1640+10%胎牛血清，Hut78细胞采用IMDM+10%胎牛血清，其他培养条件均为：培养液中含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、300 mg/L L-谷氨酰胺，在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下常规培养，收集状态良好的细胞，RT-PCR检测PADI4在翻译水平的表达情况。
1.3 HL-60细胞分化模型的建立
HL-60细胞在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、300 mg/L，L-谷氨酰胺的1640培养液常规传代培养。取对数生长期细胞调整细胞密度为1×106/mL，加入1μM ATRA作用0、24、48、72、96 h后收集细胞，备用。以状态良好，常规隔两天半量换液传代培养，以未加药的细胞作为对照组。收集作用0、96 h细胞，常规操作，分别利用流式以及RT-PCR检测HL60细胞表面标志分子CD11b变化。
1.4 RT-PCR检测ATRA诱导的HL-60细胞分化模型中PADI4转录水平表达变化
收集0、24、48、72和96 h细胞，1500 r/min离心5 min，去上清，3 mL PBS洗涤3次，Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度仪测定RNA的浓度及纯度。用M-MLV（TaKaRa公司）逆转录cDNA，然后PCR扩增。扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，以DL2000为DNA marker，β-actin基因为内参照，GELDos1000凝胶成像分析仪分析扫描各条带，测定各目的基因表达量。引物序列如下：β-actin基因（540bp）F：GTGGGGCGCCCCAGGCACCA；R：CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC；PADI4基因（533bp）F：CCGTGTGACCCCAGAGCAGCCC；R：GTGCTCAGGGTCAGCGACA。
1.5 统计学处理
每组实验重复3次，采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析、方差齐性检验以及4个实验组与对照组的两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HL60、K562等9株白血病细胞株中PADI4转录水平表达情况
常规Trizol法提取细胞总RNA，然后做RNA定量，RT-PCR检测PADI4表达情况，以β-actin基因为内参。结果见图1。由结果可知，不同白血病细胞中PADI4转录水平的表达情况不同，其中HL60、Raji表达最高，K562、U937其次，这就说明PADI4或许与白血病细胞的分化有关系。
2.2 ATRA对HL60细胞分化的影响
常规操作，流式检测ATRA作用0 h和96 h的HL60细胞表面CD11b分子表达变化。结果见图2。由流式检测结果可知，ATRA作用96 h后，CD11b分子表达明显上调，说明ATRA诱导HL60细胞分化模型建立成功。
2.3 ATRA诱导HL60分化后PADI4表达变化
常规收集、检测ATRA分别作用0、24、48、72、96 h的细胞，通过目的条带与内参条带的灰度值的比值，实验独立重复做3次，3次的数据见表1。由统计分析结果可知，单因素方差分析实验组与对照组相比，具有统计学意义（P<0.01）；组与组之间多重比较P值也均小于0.01，故可得出结论1μM的ATRA诱导HL60细胞24 h后至诱导作用的96 h内，随着作用时间的延长，PADI4在转录水平逐渐降低，和对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。说明PADI4与白血病细胞的分化有关系，低水平表达的PADI4可诱导HL60细胞的分化。 3 讨论
近年来，白血病细胞的靶向杀伤治疗成为白血病治疗的发展趋势，在临床上有着良好的应用前景，已成为白血病可能治愈的手段，靶向基因的研究成为研究热点。
本研究通过检测9株不同类型的白血病细胞发现，在这9株细胞中PADI4均有表达，以此可以推测PADI4基因是白血病筛查的潜在靶点。研究表明PADI4主要表达在血液淋巴细胞，并且在炎症和免疫反应中发挥作用。因为由HL60细胞诱导的粒细胞和巨噬细胞中检测到了PADI4的表达，所以认为PADI4和这些细胞的分化、凋亡有关[4-7]。我们通过建立ATRA诱导HL60细胞分化模型检测也证明了随着HL60细胞分化程度的提高，PADI4表达逐渐下调。但是在生理状态下，PADI4的准确功能和作用底物还知之甚少。
到目前为止，对PADI4的调控机制还不明确。本研究通过建立ATRA诱导HL-60细胞的分化检测PADI4表达变化，在此基础上进而后续研究探索其可能的信号通路。Dong等[8]发现雌二醇可以通过经典和非经典途径调控PADI4的表达。在经典途径中，雌二醇和雌二醇受体结合形成复合体，然后经由启动子上的雌二醇反应元件调控PADI4表达。在非经典途径中，雌二醇-雌二醇受体复合物作用在AP-1、NF-Y和SP-1等转录因子上，而这些转录因子可以结合在PADI4的启动子上特异性的调控PADI4的表达。另一方面，Cuthbert等发现PADI4通过对这些基因的pS2-启动子上的H3组蛋白的瓜氨酸作用对抗H3组蛋白的甲基化作用从而抑制了雌二醇受体基因的表达。或许是通过PADI4的瓜氨酸化作用，雌二醇得以以负反馈的方式调控雌二醇敏感基因。近来，Tanikawa等[9]报道PADI4的第一个内含子区域有P53的结合位点，进而P53可以活化PADI4。进而他们发现敲除PADI4可以衰减P53介导的增长抑制活性，这表明PADI4介导的蛋白质的瓜氨酸化在P53信号通过路中发挥作用。Yao等[10]和Li等[11]运用染色体免疫共沉淀技术（chip）研究了P53靶基因的启动子，发现PADI4的过表达通过催化精氨酸残基为瓜氨酸残基抑制了精氨酸甲基化转移酶对H3组蛋白的甲基化作用。结果，P53靶基因表达下调，导致细胞凋亡过程和细胞周期的紊乱。Liu等[12]通过诱导体外培养的人类白血病细胞HL-60细胞和人类急性T淋巴白血病细胞Jurkat细胞的PADI4的过表达发现PADI4可以诱导P53、P21和Bax基因的表达上调，导致细胞周期停滞和线粒体介导的细胞凋亡。
迄今为止，很多生物标志分子已用于肿瘤诊断。但是对于肿瘤预后的大规模调查来说，这些生物标志的特异性和敏感性还不够，因为这些肿瘤标志仅仅在一种或几种肿瘤有表达。PADI4在各种恶性肿瘤中都高表达，但是在正常组织和良性肿瘤中不表达或表达很低。我们可以考虑用PADI4酶作为一种免疫组化标记，从而区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞，并且可以定义肿瘤的结构。因为可以检测到恶性肿瘤患者的血液中PADI4表达水平很高，但是手术切除肿瘤以后，患者血液中的PADI4表达水平明显降低，因此可以将该酶作为肿瘤预后的一种血清标志以弥补目前肿瘤诊断的方法的不足。此外，PADI4在肿瘤细胞表达的特殊性使得PADI4可以作为肿瘤治疗的潜在靶点。因此PADI4具有重要的临床应用价值。
目前，对于PADI4与白血病细胞分化的关系的研究甚少，本研究结果表明，不同类型的白血病细胞中PADI4均有表达，不同细胞表达情况不同，并且HL60细胞经过ATRA诱导分化后PADI4表达明显下调，说明PADI4基因与白血病细胞的分化有关，这为以后PADI4基因调控的研究以及体内试验研究提供的理论基础，为白血病的靶向治疗提供了新的潜在治疗靶点。
[参考文献]
[1] Nakashima K，Hagiwara T，Ishigami A，et al.Molecular characterization of peptidylarginine deiminase in HL-60 cells induced by retinoic acid and 1alpha，25-dihydroxyvitamin D（3）[J].J Biol Chem，1999， 274（39）：27786-27792.
[2] Arita K， Hashimoto H， Shimizu T， et al.Structural basis for Ca2+-induced activation of human PAD4[J]. Nat Struct Mol Biol，2004，11（8）：777-783.
[3] Chang X， Han J.Expression of Peptidylarginine Deiminase Type 4 （PAD4） in Various Tumors[J]. Molecular Carcinogenesis，2006， 45（3）：183-196.
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[5] Chang X，Yamada R，Suzuki A，et al.Localization of peptidylarginine deiminase 4 （PADI4） and citrullinated protein in synovial tissue of rheumatoid arthritis[J]. Rheumatology，2005， 44（1）：40-50. [6] Gy?rgy B，Tóth E，Tarcsa E，et al.Citrullination： a posttranslational modification in health and disease[J]. Int J Biochem Cell Biol，2006，38（10）：1662-1677.
[7] Anzilottia C，Pratesia F，Tommasia C，et al.Peptidylarginine deiminase 4 and citrullination in health and disease[J].Autoimmunity Reviews，2010，9（3）：158-160.
[8] Dong S，Zhang Z，Takahara H. Estrogen-Enhanced peptidylarginine deiminase type IV Gene （PADI4） expression in MCF-7 cells is mediated by estrogen receptor-α-promoted transfactors activator protein-1， nuclear factor-Y and sp1[J].Mol Endocrinol，2007，21（7）：1617-1629.
[9] Tanikawa C，Ueda K，Nakagawa H，et al.Regulation of Protein Citrullination through p53/PADI4 Network in DNA Damage Response[J].Cancer Research，2009，69（22）：8761-8769.
[10] Yao H，Li P，Venters BJ，et al.Histone Arg modifications and p53 regulate the expression of OKL38， a mediator of apoptosis[J].J Biol Chem，2008， 283（29）：20060-20068.
[11] Li P，Yao H，Zhang Z，et al.Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase[J]. Mol Cell Biol，2008，28（15）：4745-4758.
[12] Liu G，Liao Y，Chang W，et al.Overexpression of peptidylarginine deiminase IV features in apoptosis of haematopoietic cells[J].Apoptosis，2006，11（2）：183-196.
（收稿日期：2013-03-22）