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摘要 将云南师范大学薯类作物研究所提供的合作88号马铃薯品种的发芽块茎，进行茎尖剥离脱毒和组织培养诱导，研究添加不同浓度激素的培养基对合作88号茎尖分生组织生长的影响。试验结果表明，对合作88号茎尖分生组织培养较适宜的培养基为MS 0.1 mg/L 6-BA 0.05 mg/L NAA 0.1 mg/L GA3 30 g/L白糖 4.0 g/L琼脂粉 100 mg/L肌醇，形成的愈伤组织状态好、成苗率高。
关键词 马铃薯；茎尖；组织培养；培养基；生长；影响
中图分类号 S532 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）05-0101-01
普通栽培种的马铃薯（Solanum tuberosum L.）是双子叶种子植物，属茄科（Solanacea）茄属（Solanum），一年生喜凉草本植物，原产于南美洲，马铃薯在生产上绝大多数是利用马铃薯块茎进行无性繁殖，是我国四大粮食作物之一。世界马铃薯面积分布的最大特点是以欧、亚两洲种植为主，两者种植面积占世界马铃薯总面积的78%。其中，中国、俄罗斯、乌克兰和印度四大生产国，占世界总种植面积的1/2[1]。国际马铃薯中心（CIP）和国际食品政策中心（IDPRI）合作研究表明，到2020年全世界对马铃薯的需求将有望增长40%[2]，超过水稻、小麦和玉米的增长，特别是亚洲和非洲对马铃薯的需求将增长更快。近年来，随着我国农业产业结构调整和种薯、商品薯、加工企业市场的发展，优质马铃薯加工产品供不应求，加工用薯比例大幅度增加，马铃薯栽培成为种植业结构调整和农民增收的一项战略选择，且马铃薯种植也逐步走向规模化、标准化和区域化。
马铃薯为块茎无性繁殖作物，在生长期间易受病毒侵染，且病毒会在种薯块茎中逐代累积，使马铃薯种薯的种性发生退化[3]。而种薯“退化”是马铃薯产量降低和商品性状变差的主要原因[4]。有研究表明，病毒在植株体内的分布是不均匀的，且越靠近新生组织部位的（如茎尖）病毒越少，甚至无毒。目前，国内外研究者即根据这个原理，利用无菌操作，通过马铃薯茎尖分生组织的离体培养，获得无病毒或脱去马铃薯主要危害病毒的试管苗[5-7]，从而恢复马铃薯的种性。植物茎尖分生组织培养的成活和发育，需要适宜的培养基及一定条件的温度和光照，且植物生长调节剂在其中发挥了重要作用[8]。为此，本试验探讨了添加不同浓度激素的培养基，对马铃薯合作88号品种的茎尖分生组织生长及成苗的影响。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为云南师范大学薯类作物研究所提供的马铃薯优良品种合作88号的发芽块茎。
1.2 试验方法
1.2.1 培养基的配制。按照如下培养基配方，配制4种培养基，分别为：MS 0.5 mg/L 6-BA 0.05 mg/L NAA 30 g/L白糖 7.0 g/L琼脂粉（A）；MS 0.1 mg/L 6-BA 0.05 mg/L NAA 0.1 mg/L GA3 30 g/L白糖 4.0 g/L琼脂粉 100 mg/L肌醇（B）；MS 1.0 mg/L 6-BA 0.05 mg/L NAA 0.5 mg/L GA3 25 g/L白糖 6.0 g/L琼脂粉 100 mg/L肌醇（C）；MS 0.05 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA 0.1 mg/L GA3 25 g/L白糖 4.5 g/L琼脂粉 100 mg/L肌醇（D）。
1.2.2 取材与消毒。剪取发芽块茎上1～2 cm长的芽，用软毛刷在自来水下轻轻逐个刷洗后放于烧杯中，然后放于超净工作台内进行严格消毒：先用75%的酒精浸15 s，无菌水冲洗2次，每次3～5 min；再用0.1%的升汞消毒8～10 min，无菌水冲洗5次，每次3～5 min。冲洗完后放在灭过菌的培养瓶内待用，注意滴加少量无菌水，以防茎尖脱水萎缩。
1.2.3 剥离茎尖、接种。将消毒过的芽置于40 X的解剖镜下，用灭过菌的解剖针仔细剥离茎尖外叶，直至露出圆润的生长点，然后用锋利的无菌解剖针小心切取0.5 mm以下的带1～2个叶原基的茎尖，随即将茎尖分别接种于已准备好的培养基A上，以切面接触培养基。每瓶培养基接种3个茎尖，共接种60瓶左右。此阶段为过渡培养，目的是使各个茎尖分生组织处于相同的起始条件下。
1.2.4 对比试验。1个月左右，当茎尖愈伤组织长至米粒大小，或有绿色突起时，就把这些茎尖随机转接到培养基A、B、C、D中，以切面接触培养基；每瓶培养基接种3个茎尖，每种培养基接种10瓶；每隔7 d观察、记录1次，主要记录各种培养基内茎尖的生长情况。
1.2.5 培养条件。将接种好的茎尖置于温度20～23 ℃，光照强度1 800～2 000 lx，每天16 h光照条件下进行培养诱导。
2 结果与分析
本次转接的茎尖共有120个，每种培养基接种30个。从表1可以看出，4种培养基中，培养基B茎尖成苗株数最多，成苗率为67%，是先形成愈伤组织，后成苗，是较适宜的培养基。其次是培养基C，成苗率为43%，也是先形成愈伤组织，后成苗。培养基A茎尖成苗少，成苗率为33%，但也是先形成愈伤组织，后成苗。最后是培养基D，该培养基中的茎尖只长愈伤组织，且愈伤组织生长缓慢，最终没有成苗，这显示此培养基不适宜用于合作88号茎尖分生组织的成苗培养。从表1还可以看出，培养基B成苗比较快，其次是培养基C，最后才是培养基A。
3 结论与讨论
试验结果表明，合作88号马铃薯品种茎尖分生组织培养较适宜的培养基配方为MS 0.1 mg/L 6-BA 0.05 mg/L NAA 0.1 mg/L GA3 30 g/L白糖 4.0 g/L琼脂粉 100 mg/L肌醇；其形成的愈伤组织状态好、成苗率高。试验结果显示，培养基中所加的激素的种类及浓度配比，对培养马铃薯茎尖分生组织的成苗效果有很大的影响。另外，培养基中使用白糖来代替蔗糖或葡萄糖，同样达到了较好地培养茎尖成苗的目的，还可降低培养成本。
由以上试验结果说明，茎尖的消毒处理和剥离过程，也是试验成功的关键。消毒处理的时间过长，会严重损伤茎尖甚至引起茎尖死亡；而时间过短，则消毒效果不理想，易造成试验材料的污染。在用0.1%的升汞等消毒马铃薯茎尖和用无菌水冲洗的过程中，要不断地晃动培养瓶，以保证消毒灭菌或漂洗更加彻底。另外，因无菌操作台里的气流会使茎尖迅速变干，这既不便于茎尖的剥离操作，也不利于茎尖的培养成活；因此在剥离茎尖和接种的过程中，要注意使茎尖暴露在瓶外或气流中的时间越短越好。在培养基配制过程中，最好在琼脂粉充分溶解后再放入白糖，这样就不会因为白糖加热过度后引起培养基变黄。在用高压灭菌锅对培养基进行湿热灭菌时，应等培养基稍冷却后，就立即把培养基从灭菌锅中取出，如果闷得时间过长，也会使培养基变黄。
4 参考文献
[1] 裴荣信.马铃薯茎尖脱毒种薯技术的改进[J].中国马铃薯，1988（4）：33-37.
[2] 杨小琴，李善长，李增伟，等.马铃薯茎尖脱毒组织培养技术研究综述[J].现代农业科技，2009（22）：87-88，90.
[3] 仲乃琴.植物生长调节剂对不同马铃薯品种茎尖分生组织离体培养的影响[J].甘肃农业大学学报，1999，34（3）：296-299.
[4] ALLAND R H.Principess of Plant Breeding[J].New York，1986（14）：25-30.
[5] 任凝辉，王美平，史宣杰，等.马铃薯茎尖组织培养及快速繁殖技术研究[J].河南农业大学学报，2002，36（3）：79-82.
[6] BARKER WG.A method for in virto culturing of potato tubers[J].Science，1953（118）：384.
[7] 李云海，何云昆.通過茎尖分生组织离体培养获得马铃薯脱毒试管苗[J].西南农业学报，1994，7（2）：28-31.
[8] 吴兴泉，陈士华，王朔，等.马铃薯茎尖组织培养技术研究[J].安徽农业科学，2007，37（3）：1039-1040.
关键词 马铃薯；茎尖；组织培养；培养基；生长；影响
中图分类号 S532 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）05-0101-01
普通栽培种的马铃薯（Solanum tuberosum L.）是双子叶种子植物，属茄科（Solanacea）茄属（Solanum），一年生喜凉草本植物，原产于南美洲，马铃薯在生产上绝大多数是利用马铃薯块茎进行无性繁殖，是我国四大粮食作物之一。世界马铃薯面积分布的最大特点是以欧、亚两洲种植为主，两者种植面积占世界马铃薯总面积的78%。其中，中国、俄罗斯、乌克兰和印度四大生产国，占世界总种植面积的1/2[1]。国际马铃薯中心（CIP）和国际食品政策中心（IDPRI）合作研究表明，到2020年全世界对马铃薯的需求将有望增长40%[2]，超过水稻、小麦和玉米的增长，特别是亚洲和非洲对马铃薯的需求将增长更快。近年来，随着我国农业产业结构调整和种薯、商品薯、加工企业市场的发展，优质马铃薯加工产品供不应求，加工用薯比例大幅度增加，马铃薯栽培成为种植业结构调整和农民增收的一项战略选择，且马铃薯种植也逐步走向规模化、标准化和区域化。
马铃薯为块茎无性繁殖作物，在生长期间易受病毒侵染，且病毒会在种薯块茎中逐代累积，使马铃薯种薯的种性发生退化[3]。而种薯“退化”是马铃薯产量降低和商品性状变差的主要原因[4]。有研究表明，病毒在植株体内的分布是不均匀的，且越靠近新生组织部位的（如茎尖）病毒越少，甚至无毒。目前，国内外研究者即根据这个原理，利用无菌操作，通过马铃薯茎尖分生组织的离体培养，获得无病毒或脱去马铃薯主要危害病毒的试管苗[5-7]，从而恢复马铃薯的种性。植物茎尖分生组织培养的成活和发育，需要适宜的培养基及一定条件的温度和光照，且植物生长调节剂在其中发挥了重要作用[8]。为此，本试验探讨了添加不同浓度激素的培养基，对马铃薯合作88号品种的茎尖分生组织生长及成苗的影响。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为云南师范大学薯类作物研究所提供的马铃薯优良品种合作88号的发芽块茎。
1.2 试验方法
1.2.1 培养基的配制。按照如下培养基配方，配制4种培养基，分别为：MS 0.5 mg/L 6-BA 0.05 mg/L NAA 30 g/L白糖 7.0 g/L琼脂粉（A）；MS 0.1 mg/L 6-BA 0.05 mg/L NAA 0.1 mg/L GA3 30 g/L白糖 4.0 g/L琼脂粉 100 mg/L肌醇（B）；MS 1.0 mg/L 6-BA 0.05 mg/L NAA 0.5 mg/L GA3 25 g/L白糖 6.0 g/L琼脂粉 100 mg/L肌醇（C）；MS 0.05 mg/L 6-BA 0.1 mg/L NAA 0.1 mg/L GA3 25 g/L白糖 4.5 g/L琼脂粉 100 mg/L肌醇（D）。
1.2.2 取材与消毒。剪取发芽块茎上1～2 cm长的芽，用软毛刷在自来水下轻轻逐个刷洗后放于烧杯中，然后放于超净工作台内进行严格消毒：先用75%的酒精浸15 s，无菌水冲洗2次，每次3～5 min；再用0.1%的升汞消毒8～10 min，无菌水冲洗5次，每次3～5 min。冲洗完后放在灭过菌的培养瓶内待用，注意滴加少量无菌水，以防茎尖脱水萎缩。
1.2.3 剥离茎尖、接种。将消毒过的芽置于40 X的解剖镜下，用灭过菌的解剖针仔细剥离茎尖外叶，直至露出圆润的生长点，然后用锋利的无菌解剖针小心切取0.5 mm以下的带1～2个叶原基的茎尖，随即将茎尖分别接种于已准备好的培养基A上，以切面接触培养基。每瓶培养基接种3个茎尖，共接种60瓶左右。此阶段为过渡培养，目的是使各个茎尖分生组织处于相同的起始条件下。
1.2.4 对比试验。1个月左右，当茎尖愈伤组织长至米粒大小，或有绿色突起时，就把这些茎尖随机转接到培养基A、B、C、D中，以切面接触培养基；每瓶培养基接种3个茎尖，每种培养基接种10瓶；每隔7 d观察、记录1次，主要记录各种培养基内茎尖的生长情况。
1.2.5 培养条件。将接种好的茎尖置于温度20～23 ℃，光照强度1 800～2 000 lx，每天16 h光照条件下进行培养诱导。
2 结果与分析
本次转接的茎尖共有120个，每种培养基接种30个。从表1可以看出，4种培养基中，培养基B茎尖成苗株数最多，成苗率为67%，是先形成愈伤组织，后成苗，是较适宜的培养基。其次是培养基C，成苗率为43%，也是先形成愈伤组织，后成苗。培养基A茎尖成苗少，成苗率为33%，但也是先形成愈伤组织，后成苗。最后是培养基D，该培养基中的茎尖只长愈伤组织，且愈伤组织生长缓慢，最终没有成苗，这显示此培养基不适宜用于合作88号茎尖分生组织的成苗培养。从表1还可以看出，培养基B成苗比较快，其次是培养基C，最后才是培养基A。
3 结论与讨论
试验结果表明，合作88号马铃薯品种茎尖分生组织培养较适宜的培养基配方为MS 0.1 mg/L 6-BA 0.05 mg/L NAA 0.1 mg/L GA3 30 g/L白糖 4.0 g/L琼脂粉 100 mg/L肌醇；其形成的愈伤组织状态好、成苗率高。试验结果显示，培养基中所加的激素的种类及浓度配比，对培养马铃薯茎尖分生组织的成苗效果有很大的影响。另外，培养基中使用白糖来代替蔗糖或葡萄糖，同样达到了较好地培养茎尖成苗的目的，还可降低培养成本。
由以上试验结果说明，茎尖的消毒处理和剥离过程，也是试验成功的关键。消毒处理的时间过长，会严重损伤茎尖甚至引起茎尖死亡；而时间过短，则消毒效果不理想，易造成试验材料的污染。在用0.1%的升汞等消毒马铃薯茎尖和用无菌水冲洗的过程中，要不断地晃动培养瓶，以保证消毒灭菌或漂洗更加彻底。另外，因无菌操作台里的气流会使茎尖迅速变干，这既不便于茎尖的剥离操作，也不利于茎尖的培养成活；因此在剥离茎尖和接种的过程中，要注意使茎尖暴露在瓶外或气流中的时间越短越好。在培养基配制过程中，最好在琼脂粉充分溶解后再放入白糖，这样就不会因为白糖加热过度后引起培养基变黄。在用高压灭菌锅对培养基进行湿热灭菌时，应等培养基稍冷却后，就立即把培养基从灭菌锅中取出，如果闷得时间过长，也会使培养基变黄。
4 参考文献
[1] 裴荣信.马铃薯茎尖脱毒种薯技术的改进[J].中国马铃薯，1988（4）：33-37.
[2] 杨小琴，李善长，李增伟，等.马铃薯茎尖脱毒组织培养技术研究综述[J].现代农业科技，2009（22）：87-88，90.
[3] 仲乃琴.植物生长调节剂对不同马铃薯品种茎尖分生组织离体培养的影响[J].甘肃农业大学学报，1999，34（3）：296-299.
[4] ALLAND R H.Principess of Plant Breeding[J].New York，1986（14）：25-30.
[5] 任凝辉，王美平，史宣杰，等.马铃薯茎尖组织培养及快速繁殖技术研究[J].河南农业大学学报，2002，36（3）：79-82.
[6] BARKER WG.A method for in virto culturing of potato tubers[J].Science，1953（118）：384.
[7] 李云海，何云昆.通過茎尖分生组织离体培养获得马铃薯脱毒试管苗[J].西南农业学报，1994，7（2）：28-31.
[8] 吴兴泉，陈士华，王朔，等.马铃薯茎尖组织培养技术研究[J].安徽农业科学，2007，37（3）：1039-1040.