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[摘 要]本文建立了同时测定四种大豆异黄酮（大豆苷、大豆苷元、染料木素和染料木苷）含量的高效液相色谱法方法。采用日本岛津LC10AT高效液相色谱仪测定：色谱柱为安捷伦 Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm 5μm），采用甲醇﹕乙腈﹕磷酸水（pH=3.0）=30﹕10﹕60洗脱，流速为：1.0mL/min，波长：260nm，进样量：10μL，柱温：30℃。四种大豆异黄酮在20～400μg/mL线性关系良好。加标回收率分别达到90%以上，方法简便、灵敏、准确，适用于大豆异黄酮成分的含量测定。
[关键词]高效液相色谱法； 大豆异黄酮；含量测定
中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）06-0197-02
曾经1999年10月FDA发布了第11个健康声明：每人每天食用25g黄豆，可以减少发生冠心病的风险。而近年来一些研究表明，大豆及豆制品具有更加广泛的生物功效，如抗肿瘤、防治骨质疏松和增强记忆等，这些功能均与大豆异黄酮有关。大豆异黄酮与防治一些和雌激素水平下降有关的疾病，延缓女性衰老、改善更年期症状、骨质疏松、血脂升高、乳腺癌、前列腺癌、心脏病、疏松症、心血管疾病等。
大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物，是生物黄酮中的一种，也是一种植物雌激素。它主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中，种皮中含量极少。80%～90%的异黄酮存在于子叶中，浓度为0.1%～0.3%。胚轴中所含异黄酮种类较多且浓度较高，为1%～2%，但由于胚只占种子总重量的2%，因此尽管浓度很高，所占比例却很少（10%～20%）[1-3]。迄今为止，共发现有12种成分，分为游离型的苷元和结合型的糖苷两类。苷元占总含量的2%～3%，包括软料木黄酮、黄豆苷元和黄豆黄素3种[4]。糖苷9种，以葡萄糖苷、乙酰基葡萄糖苷、丙二酰基葡萄糖苷3种形式存在，其中染料木苷、黄豆苷、丙二酰金雀异黄苷、丙二酰大豆苷4种成分约占总量的83%～93%[5]。
目前国内外测定大豆异黄酮的方法主要有比色法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法（GC） 、紫外分光光度法和高效液相色谱法（HPLC）等。但紫外分光光度法常以染料木苷标准品来表征大豆异黄酮总浓度，该方法虽然简便易行、成本低廉但仅适用于粗略测定异黄酮总量，结果有一定偏差[6]。薄层色谱法具有取样量少，操作简单、分离效果好等优点，但其薄层显色剂用量难于准确控制，人为误差大。康纯[7]等以6种SDS、正丁醇、正庚烷、水微乳液作展开剂，通过聚酰胺薄层色谱法分离和检测13种黄连药材、饮片及中成药，并且观察了微乳液类型副I分辨率的影响，结果表明，含水量75%的微乳液为适宜的展开剂。GC 法采用了样品衍生后进行测定，存在操作烦琐，条件不易控制、杂质干扰严重等问题；高效液相色谱法则具有样品不需要预处理、测定快速、定量准确的优势。本研究采用高效液相色谱法（HPLC），甲醇﹕乙腈﹕磷酸水（pH=3.0）=30﹕10﹕60作为流动相，同时对大豆异黄酮4种主要成分大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素进行分离定。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
岛津LC10AT高效液相色谱仪：附带SPD-10A紫外检测器，色谱柱为安捷伦 Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm 5μm），0.45？m微孔滤膜过滤器，JP-030S型超声波清洗器，TU-1810紫外-可见分光光度计，BSA224S-CW分析天平。大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量均≥98%，且均购置于曼思特生物科技有限公司。乙腈色谱纯，甲醇色谱纯。样品大豆异黄酮软胶囊购置于深圳医药公司。
1.2 标准溶液制备
1.2.1 大豆异黄酮标准贮备溶液：称取大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素各1mg，置于25mL容量瓶中，加入适量甲醇，经超声处理10min，再用甲醇定容至刻度，制成400μg/mL标准溶液。
1.2.2 大豆异黄酮混合标准使用溶液：吸取1.2.1中标准贮备液，配成200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，20μg/mL的混合标液，使用甲醇定容。
1.3 供试液制备
胶囊去壳，将内容物混合均匀，称取样品0.05g-0.5g（精确至0.1mg），加入适量80%乙醇。超声提取30min，加水定容，离心分离5-10min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后，收集滤液待测。
2 结果与分析
2.1 色谱条件确定
2.1.1 检测波长选择
通过紫外扫描，可知四种大豆异黄酮在260nm处均有较大吸收，故选取检测波长260nm。
2.1.2 流动相的选择
分别采用甲醇-水，甲醇-磷酸水（pH3.0），甲醇-乙腈-磷酸水（pH3.0）作为流动相。甲醇-水作流动相时发现染料木素峰有严重的拖尾现象，且大豆苷和大豆苷元无法完全分开。当流动相pH3.0时，大豆苷和大豆苷元能很好的分开，但是染料木苷有前出峰现象，当流动相中加入一定比例的乙腈时，这种现象能够很好的改善。因此流动相选择甲醇﹕乙腈﹕磷酸水=30﹕10﹕60。
2.1.3 色谱条件确定
根据上述实验，确定本实验的色谱条件为：流动相为甲醇﹕乙腈﹕磷酸水（pH3.0）=30﹕10﹕60，流速为：1.0mL/min，波长：260nm，进样量：10μL，柱温：30℃。
2.2 检测方法的验证
2.2.1 线性关系考察
分别精密吸取一系列浓度范围的对照品混合溶液，进样量10μL。按照2.1.3条件注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归。回归方程及线性范围见表1。 大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素的理论塔板数分别为2412、2402、6803和7115，其理论塔板数显示各成分的分离程度，能够满足检测的需要。在进样量为10？L时，四种大豆异黄酮最低检测浓度均为：2.5μg/mL。
2.2.2 稳定性试验
精密吸取供试品溶液10？L，每隔8h，按照2.1.3项色谱条件进样一次，共测6次，测定峰面积，结果大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素的RSD分别为1.56%、2.03%、1.05%和2.37%。表明48h内测定结果稳定性良好。
2.2.3 重复性试验
取同一样品，按照1.3制备供试液，按照2.1.3项色谱条件，分别测定四种大豆异黄酮日内含量重复性和日间重复性，结果分别见表2和表3。样品在一天时间内重复测定6次完成其日内重复性。每隔2天测定一次，共测定3次完成日间重复性。表2和表3的结果显明本方法精密度好，准确度高，且操作简便，适合推广应用。
2.2.4 回收率试验
称取已知含量的同一样品共9份，每3份为1组，按高、中、低3个水平分别加入对照品溶液，按照1.3制备供试液，按照2.1.3的色谱条件进样，进行回收率试验。回收率见表2。
3 结论
本方法讨论了用不比例的醇-水，甲醇-磷酸水（pH3.0），甲醇-乙腈-磷酸水（pH3.0）作流动相，结果显示甲醇﹕乙腈﹕磷酸水=30﹕10﹕60作流动相时，四种大豆异黄酮能很好的分开。对方法的重复性考察，在6天时间内方法是稳定的，重复性好，精密度高。分别对四种大豆异黄酮的回收率加以考察，回收率均在90%以上，表明方法可操作性高。
本方法用高效液相色谱法同时测定4种大豆异黄酮苷元的含量，结果准确、可靠，为大豆异黄酮的定量测定提供了一定的支持。
参考文献
[1] Wang HJ， Murphy PA. Isoflavones composition of American and Japanese soybeans in Lowa： effects of variety. Crop year， and location. J Agric Food Chem， 1994， 4：1674～1677.
[2]杨薇.大豆植物性雌激素的构效关系及药理作用[J].中国新药杂志，2001，10（12）：892.
[3]董怀海，谷文英.高效液相色谱-质谱法在大豆异黄酮测定中的应用[J].粮食与饲料工业，2002，（5）：48～50.
[4]张玉梅，孙学斌，高旭年.紫外分光光度法测定大豆总异黄酮的含量[J].中国食品卫生杂志，2000，12（4）：7～9.
[5]郝青南，马超，马兵钢. 大豆异黄酮的生理功能及其分离检测方法研究进展[J].中国医药生物技术，2007，10（2）：383～385.
[6]高荣海，李长彪，刘长江，孟宪文. 大豆异黄酮分离及其检测方法研究概述[J].粮食与油脂，2006，5：22～24.
[7] Kan C，Wen LY， Ding ZB， et al. Studies on separation and identification of rhizoma coptidis brugs based on microemulsion thin-layer chromatography. China J Chin Mater Med， 2000， 25（5）：262～265.
[关键词]高效液相色谱法； 大豆异黄酮；含量测定
中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）06-0197-02
曾经1999年10月FDA发布了第11个健康声明：每人每天食用25g黄豆，可以减少发生冠心病的风险。而近年来一些研究表明，大豆及豆制品具有更加广泛的生物功效，如抗肿瘤、防治骨质疏松和增强记忆等，这些功能均与大豆异黄酮有关。大豆异黄酮与防治一些和雌激素水平下降有关的疾病，延缓女性衰老、改善更年期症状、骨质疏松、血脂升高、乳腺癌、前列腺癌、心脏病、疏松症、心血管疾病等。
大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物，是生物黄酮中的一种，也是一种植物雌激素。它主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中，种皮中含量极少。80%～90%的异黄酮存在于子叶中，浓度为0.1%～0.3%。胚轴中所含异黄酮种类较多且浓度较高，为1%～2%，但由于胚只占种子总重量的2%，因此尽管浓度很高，所占比例却很少（10%～20%）[1-3]。迄今为止，共发现有12种成分，分为游离型的苷元和结合型的糖苷两类。苷元占总含量的2%～3%，包括软料木黄酮、黄豆苷元和黄豆黄素3种[4]。糖苷9种，以葡萄糖苷、乙酰基葡萄糖苷、丙二酰基葡萄糖苷3种形式存在，其中染料木苷、黄豆苷、丙二酰金雀异黄苷、丙二酰大豆苷4种成分约占总量的83%～93%[5]。
目前国内外测定大豆异黄酮的方法主要有比色法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法（GC） 、紫外分光光度法和高效液相色谱法（HPLC）等。但紫外分光光度法常以染料木苷标准品来表征大豆异黄酮总浓度，该方法虽然简便易行、成本低廉但仅适用于粗略测定异黄酮总量，结果有一定偏差[6]。薄层色谱法具有取样量少，操作简单、分离效果好等优点，但其薄层显色剂用量难于准确控制，人为误差大。康纯[7]等以6种SDS、正丁醇、正庚烷、水微乳液作展开剂，通过聚酰胺薄层色谱法分离和检测13种黄连药材、饮片及中成药，并且观察了微乳液类型副I分辨率的影响，结果表明，含水量75%的微乳液为适宜的展开剂。GC 法采用了样品衍生后进行测定，存在操作烦琐，条件不易控制、杂质干扰严重等问题；高效液相色谱法则具有样品不需要预处理、测定快速、定量准确的优势。本研究采用高效液相色谱法（HPLC），甲醇﹕乙腈﹕磷酸水（pH=3.0）=30﹕10﹕60作为流动相，同时对大豆异黄酮4种主要成分大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素进行分离定。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
岛津LC10AT高效液相色谱仪：附带SPD-10A紫外检测器，色谱柱为安捷伦 Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm 5μm），0.45？m微孔滤膜过滤器，JP-030S型超声波清洗器，TU-1810紫外-可见分光光度计，BSA224S-CW分析天平。大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量均≥98%，且均购置于曼思特生物科技有限公司。乙腈色谱纯，甲醇色谱纯。样品大豆异黄酮软胶囊购置于深圳医药公司。
1.2 标准溶液制备
1.2.1 大豆异黄酮标准贮备溶液：称取大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素各1mg，置于25mL容量瓶中，加入适量甲醇，经超声处理10min，再用甲醇定容至刻度，制成400μg/mL标准溶液。
1.2.2 大豆异黄酮混合标准使用溶液：吸取1.2.1中标准贮备液，配成200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，20μg/mL的混合标液，使用甲醇定容。
1.3 供试液制备
胶囊去壳，将内容物混合均匀，称取样品0.05g-0.5g（精确至0.1mg），加入适量80%乙醇。超声提取30min，加水定容，离心分离5-10min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后，收集滤液待测。
2 结果与分析
2.1 色谱条件确定
2.1.1 检测波长选择
通过紫外扫描，可知四种大豆异黄酮在260nm处均有较大吸收，故选取检测波长260nm。
2.1.2 流动相的选择
分别采用甲醇-水，甲醇-磷酸水（pH3.0），甲醇-乙腈-磷酸水（pH3.0）作为流动相。甲醇-水作流动相时发现染料木素峰有严重的拖尾现象，且大豆苷和大豆苷元无法完全分开。当流动相pH3.0时，大豆苷和大豆苷元能很好的分开，但是染料木苷有前出峰现象，当流动相中加入一定比例的乙腈时，这种现象能够很好的改善。因此流动相选择甲醇﹕乙腈﹕磷酸水=30﹕10﹕60。
2.1.3 色谱条件确定
根据上述实验，确定本实验的色谱条件为：流动相为甲醇﹕乙腈﹕磷酸水（pH3.0）=30﹕10﹕60，流速为：1.0mL/min，波长：260nm，进样量：10μL，柱温：30℃。
2.2 检测方法的验证
2.2.1 线性关系考察
分别精密吸取一系列浓度范围的对照品混合溶液，进样量10μL。按照2.1.3条件注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归。回归方程及线性范围见表1。 大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素的理论塔板数分别为2412、2402、6803和7115，其理论塔板数显示各成分的分离程度，能够满足检测的需要。在进样量为10？L时，四种大豆异黄酮最低检测浓度均为：2.5μg/mL。
2.2.2 稳定性试验
精密吸取供试品溶液10？L，每隔8h，按照2.1.3项色谱条件进样一次，共测6次，测定峰面积，结果大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素的RSD分别为1.56%、2.03%、1.05%和2.37%。表明48h内测定结果稳定性良好。
2.2.3 重复性试验
取同一样品，按照1.3制备供试液，按照2.1.3项色谱条件，分别测定四种大豆异黄酮日内含量重复性和日间重复性，结果分别见表2和表3。样品在一天时间内重复测定6次完成其日内重复性。每隔2天测定一次，共测定3次完成日间重复性。表2和表3的结果显明本方法精密度好，准确度高，且操作简便，适合推广应用。
2.2.4 回收率试验
称取已知含量的同一样品共9份，每3份为1组，按高、中、低3个水平分别加入对照品溶液，按照1.3制备供试液，按照2.1.3的色谱条件进样，进行回收率试验。回收率见表2。
3 结论
本方法讨论了用不比例的醇-水，甲醇-磷酸水（pH3.0），甲醇-乙腈-磷酸水（pH3.0）作流动相，结果显示甲醇﹕乙腈﹕磷酸水=30﹕10﹕60作流动相时，四种大豆异黄酮能很好的分开。对方法的重复性考察，在6天时间内方法是稳定的，重复性好，精密度高。分别对四种大豆异黄酮的回收率加以考察，回收率均在90%以上，表明方法可操作性高。
本方法用高效液相色谱法同时测定4种大豆异黄酮苷元的含量，结果准确、可靠，为大豆异黄酮的定量测定提供了一定的支持。
参考文献
[1] Wang HJ， Murphy PA. Isoflavones composition of American and Japanese soybeans in Lowa： effects of variety. Crop year， and location. J Agric Food Chem， 1994， 4：1674～1677.
[2]杨薇.大豆植物性雌激素的构效关系及药理作用[J].中国新药杂志，2001，10（12）：892.
[3]董怀海，谷文英.高效液相色谱-质谱法在大豆异黄酮测定中的应用[J].粮食与饲料工业，2002，（5）：48～50.
[4]张玉梅，孙学斌，高旭年.紫外分光光度法测定大豆总异黄酮的含量[J].中国食品卫生杂志，2000，12（4）：7～9.
[5]郝青南，马超，马兵钢. 大豆异黄酮的生理功能及其分离检测方法研究进展[J].中国医药生物技术，2007，10（2）：383～385.
[6]高荣海，李长彪，刘长江，孟宪文. 大豆异黄酮分离及其检测方法研究概述[J].粮食与油脂，2006，5：22～24.
[7] Kan C，Wen LY， Ding ZB， et al. Studies on separation and identification of rhizoma coptidis brugs based on microemulsion thin-layer chromatography. China J Chin Mater Med， 2000， 25（5）：262～265.