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摘要：为建立适合桃的甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，简称MSAP）反应体系，以桃PCM-1R、PCM-1G为材料，对MSAP技术中的关键因素进行优化。结果表明，500 ng基因组DNA用EcoRⅠ、HapⅡ或MspⅠ各10 U（0.5 μL，2 000 U/mL），37 ℃保温12 h，即可酶切完全；25 μL选择性扩增体系中，含有2 μL 10倍稀释的预扩增产物、各1 μL上下游引物、2.5 μL 10×Taq buffer、2.5 μL dNTP mix（各0.2 mmol/L）、2.5 μL 25 mmol/L MgCl2、0.25 μL Taq DNA聚合酶。在该体系下选用256对引物对桃叶片进行甲基化模式分析，经筛选获得23对扩增条带清晰、重复性好的引物，PCM-1R、PCM-1G总甲基化率分别为28.0%、25.7%。
关键词：桃；DNA甲基化；MSAP；体系优化
中图分类号： S188；S662.101 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）11-0043-03
DNA甲基化是真核细胞基因组主要的修饰方式之一，DNA甲基化特别是胞嘧啶甲基化具有表观遗传效应和突变效应，与基因表达调控、细胞分化、基因组印记、性染色体失活及细胞记忆等生物学过程密切相关[1-4]。1995年，Vos等首次将随机扩增多态性与限制性内切酶片段长度多态性2种分子标记有机结合[5]，建立了扩增片段长度多态性分析技术。1997年，Gonzalgo等已经尝试用随机引物和对甲基化敏感不同的同裂酶HpaⅡ、MspⅠ来进行甲基化分析[3]。Xiong等于1999年首次证明甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，简称MSAP）是一种可靠的检测植物DNA甲基化的方法[6]，它操作相对便捷，可检测出样品DNA中大量甲基化位点，因多态性高、引物设计简单等优点而被广泛应用。目前，MSAP方法在脐橙[7]、萝卜[8]、杂交籼稻[9]、橡胶树[10]、苹果[11]等多种植物中都有应用，但在桃的相关研究中尚未见应用报道。PCM-1R（叶片紫红色）、PCM-1G（叶片绿色）为PCM-1（叶片紫红-绿杂色）的无性繁殖后代植株，本研究以这2个植株为试验材料，建立桃MSAP体系，并进行引物筛选，以期为进一步研究桃DNA甲基化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
PCM-1R、PCM-1G，由国家果树种质南京桃资源圃提供。
1.2 仪器与试剂
主要仪器有Biometra T-Gradient PCR仪、Eppendorf 5810R冷冻离心机、BioRad电泳仪等。
主要试剂：EcoRⅠ、MspⅠ、HpaⅡ，New England BioLabs；Taq DNA聚合酶，Thermo Scientific；其他试剂为国产或进口分析纯。接头及引物由英潍捷基公司合成，详见表1。
1.3 试验方法
1.3.1 桃叶片DNA提取 桃叶片DNA提取参照王富荣等改良CTAB法[12]。
1.3.2 桃MSAP双酶切体系优化 20 μL体系：500 ng模板DNA，2 μL 10×NEB Buffer（EcoRⅠ/MspⅠ使用NEB4，EcoRⅠ/HpaⅡ使用NEB1），内切酶EcoRⅠ/MspⅠ或HpaⅡ用量分为1、5、10、20 U 4种，用去离子水补足体积至20 μL。体系混匀后置于Biometra T-Gradient PCR仪上，分别于37 ℃温育4、8、12、16、20 h，80 ℃失活20 min，取5 μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，筛选出最佳酶切时间、最佳内切酶用量。
接头连接后进行预扩增。25 μL预扩增体系：2.5 μL 10×Taq buffer，2.5 μL dNTP mix（各0.2 mmol/L），0.5 μmol/L 预扩增引物E A、H/M T，2 μL模板DNA（连接产物稀释10倍），2.5 μL 25 mmol/L MgCl2，0.25 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶，用去离子水补足至25 μL。扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36个循环；72 ℃ 15 min。
1.3.3 桃MSAP选择性扩增及引物的筛选 采用E A**/H/M T**引物组合。分别将预扩增产物稀释5、10、20、50倍，对选择性扩增模板浓度进行优化。反应体系与预扩增反应体系相同，扩增程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s（每次循环降低0.7 ℃），72 ℃ 1 min，共13个循環；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共23个循环；72 ℃延伸15 min。
用优化后的体系对E A**、H/M T**共256对引物进行筛选。产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。
1.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染 选择性扩增产物经 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，95 ℃变性10 min，用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳；银染参照梁宏伟等的方法[13]。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA
琼脂糖凝胶电泳结果显示，所提基因组DNA主带清晰（图1）。经紫外分光光度测定，结果显示D260 nm/D280 nm值在1.7～1.9范围内，说明DNA纯度高，蛋白质、多糖及酚类含量极少，满足MSAP分析对DNA的要求。
2.2 桃MSAP双酶切体系优化 基因組DNA经不同用量的内切酶双酶切，再用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。由结果可知，对于20 μL体系、500 ng 模板DNA，1 U内切酶用量酶切不完全，5、10、20 U内切酶用量目测酶切完全，条带差异不大。由于即使极少量的不完全酶切也会影响后续试验，因此为彻底排除不完全酶切对后续试验的影响且尽可能节约酶用量，对于20 μL体系，500 ng模板DNA选用10 U内切酶。
基因组DNA经不同酶切时间酶切，1%琼脂糖电泳检测结果显示，对于20 μL体系、500 ng模板DNA、10 U内切酶用量条件，不同酶切时间的效果表现为，酶切时间为4 h时，酶切不完全，8、12、16、20 h基本酶切充分且无明显差异（图3），为在保证酶切完全的前提下节省酶切时间，选择酶切时间为12 h。
2.3 桃MSAP选择性扩增体系优化
选择性扩增产物于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，结果表明，以20倍稀释DNA为模板扩增条带更清晰，且小分子量条带较易分辨，因此确定使用20倍稀释的预扩增产物为模板进行选择性扩增。
2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果初步分析
用256对MSAP选择性扩增引物对桃PCM-1R、PCM-1G 的叶片DNA样品进行全基因组甲基化分析，筛选出23对条带清晰、丰富且重复性好的引物组合（图4）。扩增出 200～1 000 bp的位点397个，其中PCM-1R、PCM-1G半甲基化位点分别为44、38个，分别占全部位点的11.1%、9.6%；全甲基化位点分别为67、64个，分别占全部位点的16.9%、16.1%；总甲基化率分别为28.0%、25.7%，PCM-1R略高于PCM-1G。
3 结论与讨论
DNA在含有多糖、酚类和蛋白质的情况下容易造成酶切失败，体现在聚丙烯酰胺凝胶电泳胶版上端大分子片段多且背景加深[14]，因此高质量的DNA是MSAP成功的基础。一般来说，十二烷基硫酸钠（SDS）法提取的DNA会有较多的多糖，使DNA呈胶冻状，而CTAB法提取纯化可基本除去多糖。桃叶片中糖及酚类物质含量较多，因此本试验采用王富荣等改良CTAB法提取基因组DNA[12]，虽然产量略低，但有效去除了蛋白质、多糖及酚类杂质，保证了DNA的质量。
限制性内切酶单位定义：在合适的温度下，完全消化 1 μg DNA底物所需的酶量定义为1个单位（1 U）。在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义选择的底物可能不同；其次是限制性内切酶在底物DNA上酶切位点的个数。酶单位定义要求完全消化，底物上某个酶的酶切位点数量的多少，直接影响该酶的单位定义。因而在进行酶切时，用1 U酶消化1 μg DNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，要进行多次试验才能确定最合适的酶切条件。
研究表明，由于MSAP使用的同裂酶只能识别“CCGG/GGCC”位点的胞嘧啶甲基化，而不能对“CCGG/GGCC”位点以外的胞嘧啶甲基化进行修饰，获得的结果与基因组中实际的甲基化水平可能存在差异[15]。但由于约90%的甲基化修饰位于“CpG”二核苷酸或“CpNpG”三核苷酸重复区内，因此多数研究者认为“CCGG/GGCC”位点的甲基化修饰比例能够客观反映植物基因组甲基化修饰水平[16]。
不同物种或同一物种的不同生长时期、不同生长环境DNA甲基化水平有很大的差异，如脐橙甲基化率为4.7%～15.0%[7]，苹果甲基化率为16.28%～21.77%[11]，半夏多倍体复合体甲基化率为54%～58%[17]，不同生态区同一基因型烟草甲基化率相差5.78百分点[18]。本试验中的PCM-1R、PCM-1G均为3年生植株，且种植于同一田块，基本上可以排除生长环境与树龄对试验结果的影响。
参考文献：
[1]Rossi V，Motto M，Pellegrini L. Analysis of the methylation pattern of the maize opaque-2 （O2） promoter and in vitro binding studies indicate that the O2 B-Zip protein and other endosperm factors can bind to methylated target sequences[J]. Journal of Biological Chemistry，1997，272（21）：13758-13765.
[2]Jablonka E，Lamb M J. The changing concept of epigenetics[J]. Annals of the New York Academy of Sciences，2002，981（981）：82-96.
[3]Gonzalgo M L，Jones P A. Mutagenic and epigenetic effects of DNA methylation[J]. Mutation Research，1997，386（2）：107-118.
[4]Tariq M，Paszkowski J. DNA and histone methylation in plants[J]. Trends in Genetics，2004，20（6）：244-251.
[5]Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al. AFLP：a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Research，1995，23（21）：4407-4414.
[6]Xiong L Z，Xu C G，Saghai-Maroof M A，et al. Patterns of cytosine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines，detected by a methylation-sensitive amplification polymorphism technique[J]. Molecular and General Genetics，1999，261（3）：439-446. [7]洪 柳，邓秀新. 应用MSAP技术对脐橙品种进行DNA甲基化分析[J]. 中国农业科学，2005，38（11）：2301-2307.
[8]柳李旺，宋贤勇，龚义勤，等. 萝卜MSAP体系优化与抽薹过程中MSAP分析[J]. 江苏农业科学，2006（6）：203-206.
[9]彭 海，江光怀，张 静，等. 中国杂交籼稻DNA甲基化多样性与遗传稳定性[J]. 中国科学：生命科学，2014，44（1）：45-53.
[10]吴春太，李维国，黄华孙. 橡胶树MSAP反应体系的建立及其对无性系DNA的甲基化分析[J]. 广东农业科学，2011，38（9）：141-144.
[11]吕晓婷，赵春梅，王爱华，等. 苹果MSAP技术体系的优化及其應用[J]. 中国农学通报，2012，28（22）：287-292.
[12]王富荣，赵剑波，章 镇，等. 适于AFLP分析用的桃成熟叶片DNA提取方法[J]. 果树学报，2006，23（4）：638-641.
[13]梁宏伟，王长忠，李 忠，等. 聚丙烯酰胺凝胶快速、高效银染方法的建立[J]. 遗传，2008，30（10）：1379-1382.
[14]曹喜兵，赵改丽，范国强. 泡桐MSAP体系建立及引物筛选[J]. 河南农业大学学报，2012，46（5）：535-541.
[15]McClelland M，Nelson M，Raschke E. Effect of site-specific modification on restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases[J]. Nucleic Acids Research，1994，22（17）：3640-3659.
[16]Reyna-López G E，Simpson J，Ruiz-Herrera J. Differences in DNA methylation patterns are detectable during the dimorphic transition of fungi by amplification of restriction polymorphisms[J]. Molecular and General Genetics，1997，253（6）：703-710.
[17]薛 梅，陈成彬，陈 力，等. 半夏多倍体复合体基因组DNA甲基化状态的MSAP分析[J]. 中草药，2008，39（11）：1713-1716.
[18]李 辉，孙焕良，李德芳. 不同生态区同一基因型烤烟表观遗传的MSAP分析[J]. 华北农学报，2013，28（1）：32-36.
关键词：桃；DNA甲基化；MSAP；体系优化
中图分类号： S188；S662.101 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）11-0043-03
DNA甲基化是真核细胞基因组主要的修饰方式之一，DNA甲基化特别是胞嘧啶甲基化具有表观遗传效应和突变效应，与基因表达调控、细胞分化、基因组印记、性染色体失活及细胞记忆等生物学过程密切相关[1-4]。1995年，Vos等首次将随机扩增多态性与限制性内切酶片段长度多态性2种分子标记有机结合[5]，建立了扩增片段长度多态性分析技术。1997年，Gonzalgo等已经尝试用随机引物和对甲基化敏感不同的同裂酶HpaⅡ、MspⅠ来进行甲基化分析[3]。Xiong等于1999年首次证明甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，简称MSAP）是一种可靠的检测植物DNA甲基化的方法[6]，它操作相对便捷，可检测出样品DNA中大量甲基化位点，因多态性高、引物设计简单等优点而被广泛应用。目前，MSAP方法在脐橙[7]、萝卜[8]、杂交籼稻[9]、橡胶树[10]、苹果[11]等多种植物中都有应用，但在桃的相关研究中尚未见应用报道。PCM-1R（叶片紫红色）、PCM-1G（叶片绿色）为PCM-1（叶片紫红-绿杂色）的无性繁殖后代植株，本研究以这2个植株为试验材料，建立桃MSAP体系，并进行引物筛选，以期为进一步研究桃DNA甲基化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
PCM-1R、PCM-1G，由国家果树种质南京桃资源圃提供。
1.2 仪器与试剂
主要仪器有Biometra T-Gradient PCR仪、Eppendorf 5810R冷冻离心机、BioRad电泳仪等。
主要试剂：EcoRⅠ、MspⅠ、HpaⅡ，New England BioLabs；Taq DNA聚合酶，Thermo Scientific；其他试剂为国产或进口分析纯。接头及引物由英潍捷基公司合成，详见表1。
1.3 试验方法
1.3.1 桃叶片DNA提取 桃叶片DNA提取参照王富荣等改良CTAB法[12]。
1.3.2 桃MSAP双酶切体系优化 20 μL体系：500 ng模板DNA，2 μL 10×NEB Buffer（EcoRⅠ/MspⅠ使用NEB4，EcoRⅠ/HpaⅡ使用NEB1），内切酶EcoRⅠ/MspⅠ或HpaⅡ用量分为1、5、10、20 U 4种，用去离子水补足体积至20 μL。体系混匀后置于Biometra T-Gradient PCR仪上，分别于37 ℃温育4、8、12、16、20 h，80 ℃失活20 min，取5 μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，筛选出最佳酶切时间、最佳内切酶用量。
接头连接后进行预扩增。25 μL预扩增体系：2.5 μL 10×Taq buffer，2.5 μL dNTP mix（各0.2 mmol/L），0.5 μmol/L 预扩增引物E A、H/M T，2 μL模板DNA（连接产物稀释10倍），2.5 μL 25 mmol/L MgCl2，0.25 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶，用去离子水补足至25 μL。扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36个循环；72 ℃ 15 min。
1.3.3 桃MSAP选择性扩增及引物的筛选 采用E A**/H/M T**引物组合。分别将预扩增产物稀释5、10、20、50倍，对选择性扩增模板浓度进行优化。反应体系与预扩增反应体系相同，扩增程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s（每次循环降低0.7 ℃），72 ℃ 1 min，共13个循環；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共23个循环；72 ℃延伸15 min。
用优化后的体系对E A**、H/M T**共256对引物进行筛选。产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。
1.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染 选择性扩增产物经 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，95 ℃变性10 min，用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳；银染参照梁宏伟等的方法[13]。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA
琼脂糖凝胶电泳结果显示，所提基因组DNA主带清晰（图1）。经紫外分光光度测定，结果显示D260 nm/D280 nm值在1.7～1.9范围内，说明DNA纯度高，蛋白质、多糖及酚类含量极少，满足MSAP分析对DNA的要求。
2.2 桃MSAP双酶切体系优化 基因組DNA经不同用量的内切酶双酶切，再用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。由结果可知，对于20 μL体系、500 ng 模板DNA，1 U内切酶用量酶切不完全，5、10、20 U内切酶用量目测酶切完全，条带差异不大。由于即使极少量的不完全酶切也会影响后续试验，因此为彻底排除不完全酶切对后续试验的影响且尽可能节约酶用量，对于20 μL体系，500 ng模板DNA选用10 U内切酶。
基因组DNA经不同酶切时间酶切，1%琼脂糖电泳检测结果显示，对于20 μL体系、500 ng模板DNA、10 U内切酶用量条件，不同酶切时间的效果表现为，酶切时间为4 h时，酶切不完全，8、12、16、20 h基本酶切充分且无明显差异（图3），为在保证酶切完全的前提下节省酶切时间，选择酶切时间为12 h。
2.3 桃MSAP选择性扩增体系优化
选择性扩增产物于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，结果表明，以20倍稀释DNA为模板扩增条带更清晰，且小分子量条带较易分辨，因此确定使用20倍稀释的预扩增产物为模板进行选择性扩增。
2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果初步分析
用256对MSAP选择性扩增引物对桃PCM-1R、PCM-1G 的叶片DNA样品进行全基因组甲基化分析，筛选出23对条带清晰、丰富且重复性好的引物组合（图4）。扩增出 200～1 000 bp的位点397个，其中PCM-1R、PCM-1G半甲基化位点分别为44、38个，分别占全部位点的11.1%、9.6%；全甲基化位点分别为67、64个，分别占全部位点的16.9%、16.1%；总甲基化率分别为28.0%、25.7%，PCM-1R略高于PCM-1G。
3 结论与讨论
DNA在含有多糖、酚类和蛋白质的情况下容易造成酶切失败，体现在聚丙烯酰胺凝胶电泳胶版上端大分子片段多且背景加深[14]，因此高质量的DNA是MSAP成功的基础。一般来说，十二烷基硫酸钠（SDS）法提取的DNA会有较多的多糖，使DNA呈胶冻状，而CTAB法提取纯化可基本除去多糖。桃叶片中糖及酚类物质含量较多，因此本试验采用王富荣等改良CTAB法提取基因组DNA[12]，虽然产量略低，但有效去除了蛋白质、多糖及酚类杂质，保证了DNA的质量。
限制性内切酶单位定义：在合适的温度下，完全消化 1 μg DNA底物所需的酶量定义为1个单位（1 U）。在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义选择的底物可能不同；其次是限制性内切酶在底物DNA上酶切位点的个数。酶单位定义要求完全消化，底物上某个酶的酶切位点数量的多少，直接影响该酶的单位定义。因而在进行酶切时，用1 U酶消化1 μg DNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，要进行多次试验才能确定最合适的酶切条件。
研究表明，由于MSAP使用的同裂酶只能识别“CCGG/GGCC”位点的胞嘧啶甲基化，而不能对“CCGG/GGCC”位点以外的胞嘧啶甲基化进行修饰，获得的结果与基因组中实际的甲基化水平可能存在差异[15]。但由于约90%的甲基化修饰位于“CpG”二核苷酸或“CpNpG”三核苷酸重复区内，因此多数研究者认为“CCGG/GGCC”位点的甲基化修饰比例能够客观反映植物基因组甲基化修饰水平[16]。
不同物种或同一物种的不同生长时期、不同生长环境DNA甲基化水平有很大的差异，如脐橙甲基化率为4.7%～15.0%[7]，苹果甲基化率为16.28%～21.77%[11]，半夏多倍体复合体甲基化率为54%～58%[17]，不同生态区同一基因型烟草甲基化率相差5.78百分点[18]。本试验中的PCM-1R、PCM-1G均为3年生植株，且种植于同一田块，基本上可以排除生长环境与树龄对试验结果的影响。
参考文献：
[1]Rossi V，Motto M，Pellegrini L. Analysis of the methylation pattern of the maize opaque-2 （O2） promoter and in vitro binding studies indicate that the O2 B-Zip protein and other endosperm factors can bind to methylated target sequences[J]. Journal of Biological Chemistry，1997，272（21）：13758-13765.
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[4]Tariq M，Paszkowski J. DNA and histone methylation in plants[J]. Trends in Genetics，2004，20（6）：244-251.
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[6]Xiong L Z，Xu C G，Saghai-Maroof M A，et al. Patterns of cytosine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines，detected by a methylation-sensitive amplification polymorphism technique[J]. Molecular and General Genetics，1999，261（3）：439-446. [7]洪 柳，邓秀新. 应用MSAP技术对脐橙品种进行DNA甲基化分析[J]. 中国农业科学，2005，38（11）：2301-2307.
[8]柳李旺，宋贤勇，龚义勤，等. 萝卜MSAP体系优化与抽薹过程中MSAP分析[J]. 江苏农业科学，2006（6）：203-206.
[9]彭 海，江光怀，张 静，等. 中国杂交籼稻DNA甲基化多样性与遗传稳定性[J]. 中国科学：生命科学，2014，44（1）：45-53.
[10]吴春太，李维国，黄华孙. 橡胶树MSAP反应体系的建立及其对无性系DNA的甲基化分析[J]. 广东农业科学，2011，38（9）：141-144.
[11]吕晓婷，赵春梅，王爱华，等. 苹果MSAP技术体系的优化及其應用[J]. 中国农学通报，2012，28（22）：287-292.
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[13]梁宏伟，王长忠，李 忠，等. 聚丙烯酰胺凝胶快速、高效银染方法的建立[J]. 遗传，2008，30（10）：1379-1382.
[14]曹喜兵，赵改丽，范国强. 泡桐MSAP体系建立及引物筛选[J]. 河南农业大学学报，2012，46（5）：535-541.
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[17]薛 梅，陈成彬，陈 力，等. 半夏多倍体复合体基因组DNA甲基化状态的MSAP分析[J]. 中草药，2008，39（11）：1713-1716.
[18]李 辉，孙焕良，李德芳. 不同生态区同一基因型烤烟表观遗传的MSAP分析[J]. 华北农学报，2013，28（1）：32-36.