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摘要：目的：探讨p53、KRAS在肺腺癌患者中的表达及意义。方法：选择2018年5月-2020年12月肺腺癌患者45例作为对象，所有患者均行手术治疗，取病灶组织及癌旁组织（距离病灶≥3cm）。采用二代测序技术测定患者KRAS突变基因;采用免疫组织化学法测定患者p53蛋白表达。结果：45例肺腺癌患者均完成基因突变测定，结果表明：28例发生基因突变，突变率为62.22%。基因突变类型排在前三位分别为：EGFR、P53和KRAS，分别占：36.36%、22.73%和18.18%;肺腺癌患者病灶组织中p53高于癌旁组织（P<0.05）。结论：肺腺癌患者基因中存在多种基因突变和共突变，且患者常伴有p53、KRAS表達异常，能为临床诊疗提供参考依据。
关键词：肺腺癌;基因突变;基因谱;KRAS;二代测序技术;免疫组织化学法
肺腺癌属于肺癌的一种，是非小细胞肺癌。但是，肺腺癌不同于鳞状细胞肺癌，更容易发生在女性、不吸烟人群中[1]。目前，临床上对于肺腺癌发病机制尚未阐明，普遍认为与吸烟、电离辐射及多环形方向化合物有关，发病早期临床症状缺乏典型性，导致临床诊疗难度较大。既往研究表明：肺腺癌的发生与多种因素有关，而基因改变的遗传多样性及易感性在疾病的发生、发展中发挥了重要作用。P53作为重要的抑癌基因，在诱导细胞周期捕获、凋亡与DNA修复等多种生理功能中发挥了重要作用。鼠类肉瘤病毒癌基因（KRAS）属于原癌基因RAS家族成员之一，是表皮生长因子受体（EGFR）信号通路下游重要调节位点，能直接参与细胞生长增殖与分化的调节[2]。因此，本研究以肺腺癌患者为对象，探讨肺腺癌基因谱及p53、KRAS的表达及意义，报道如下。
1.资料与方法
1.1临床资料
选择2018年5月-2020年12月肺腺癌患者45例作为对象，男26例，女19例，年龄（43-75）岁，平均（58.95±6.49）岁;肿瘤直径（1-6）cm，平均（3.23±0.61）cm;TNM分期：I-II期31例，III-IV期14例;淋巴结转移：是21例，否24例;分化程度：高分化18例，中分化20例，低分化7例。纳入标准：（1）符合肺腺癌诊断标准，均经病理组织检查确诊;（2）均能完成腺癌基因谱及p53、KRAS检查，且患者均可耐受;（3）具有完整的基线及随访资料。排除标准：（1）精神异常、认知功能异常或器质性疾病者;（2）伴有自身免疫系统疾病、行放化疗治疗者。
1.2 方法
1.2.1 肺腺癌基因谱
采用二代测序法测定不同组织中KRAS基因突变位点，具体方法如下。试剂盒购置于Illumina提供的人类肺癌相关26个基因突变检测试剂盒。KRAS基因检测位点主要检测外显子2号12个密码子的16个不同的基因位点，并完成位于13密码子的1个突变位点，分析两种不同组织中KRAS基因突变情况。
1.2.2 P53蛋白
采用免疫组织化学法测定不同组织中P53蛋白表达水平，具体方法如下：将制备并获得的标本进行常规石蜡切片，常规脱蜡、水化后给予抗原进行热修复处理，去除内源性生物酶后、染色。P53工作液，常规采用DAB液（购自于基因科技有限公司）显色后，采用自来水进行冲洗，终止反应后进行苏木精1min染色，并利用盐酸乙醇分化。上述操作完毕后进行再冲洗、返蓝。梯度乙醇对标本脱水后再二甲苯的辅助作用下处理，中性树胶封固（免疫组化测定时，以盐酸盐缓冲液作为一抗阴性对照，利用已知阳性组织切片作为阳性对照）在400倍显微镜下对不同标本切片随机取5个视野，每个视野选择细胞200个计数。②判定方法。不同组织测定完毕后，采用半定量方法进行测定及判断。0分：阳性细胞占0%-10%;1分：阳性细胞占10.0%-25.0%;2分：阳性细胞占25%-50.0%;3分：阳性细胞占50.0%-75.0%;4分阳性细胞>75.0%。对于得分>3分视为阳性[3]。
1.3统计分析
采用SPSS24.0软件处理，计数资料行χ2检验，采用n（%）表示，计量资料行t检验，采用（ ）表示，P<0.05差异有统计学意义。
2结果
2.1 肺腺癌患者基因突变类型及构成比
45例肺腺癌患者均完成基因突变测定，结果表明：28例发生基因突变，突变率为62.22%。基因突变类型排在前三位分别为：EGFR、P53和KRAS，分别占：36.36%、22.73%和18.18%，见表1。
2.2 肺腺癌患者不同组织中p53蛋白阳性率比较
肺腺癌患者病灶组织中p53蛋白阳性率均高于癌旁组织（P<0.05），见表2。
3 讨论
本研究中采用二代测序法对肺腺癌患者完成基因谱分析，结果表明：基因突变类型排在前三位分别为：EGFR、P53和KRAS，分别占：36.36%、22.73%和18.18%。EGFR基因突变主要集中在19和21号外显子上，突变率较高，可发生共突变。而KRAS基因突变主要集中在2号外显子上。而p53基因突变多集中在4-8号外显子上。本研究中，肺腺癌患者病灶组织中p53、KRAS蛋白阳性率均高于癌旁组织（P<0.05），说明p53、KRAS蛋白在肺腺癌患者中表达异常。因此，临床上肺腺癌患者应加强基因突变、p53、KRAS蛋白测定，评估患者预后，指导临床治疗。
综上所述，肺腺癌患者基因中存在多种基因突变和共突变，且患者常伴有p53、KRAS蛋白表达异常，能为临床诊疗提供参考依据。
参考文献
[1]柴荣，范银星，赵家义，等.非小细胞肺癌中KRAS基因突变与PD-1/PD-L1信号通路相关性的研究进展[J].国际呼吸杂志，2019，39（23）：1822-1826.
[2]陈珑，王琳，何冬雷，等.T790M基因突变阳性的肺腺癌并骨转移患者个体化治疗远期疗效及预后的相关因素分析[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2019，26（2）：200-205.
[3]郑瑞锋，文海英，罗俊波，等.非小细胞肺癌Kras基因突变相关因素及其与一线同步放化疗疗效相关性研究[J].中华肿瘤防治杂志，2020，27（5）：47-52.
（佛山市禅城区中心病理科 广东 佛山 528000）
关键词：肺腺癌;基因突变;基因谱;KRAS;二代测序技术;免疫组织化学法
肺腺癌属于肺癌的一种，是非小细胞肺癌。但是，肺腺癌不同于鳞状细胞肺癌，更容易发生在女性、不吸烟人群中[1]。目前，临床上对于肺腺癌发病机制尚未阐明，普遍认为与吸烟、电离辐射及多环形方向化合物有关，发病早期临床症状缺乏典型性，导致临床诊疗难度较大。既往研究表明：肺腺癌的发生与多种因素有关，而基因改变的遗传多样性及易感性在疾病的发生、发展中发挥了重要作用。P53作为重要的抑癌基因，在诱导细胞周期捕获、凋亡与DNA修复等多种生理功能中发挥了重要作用。鼠类肉瘤病毒癌基因（KRAS）属于原癌基因RAS家族成员之一，是表皮生长因子受体（EGFR）信号通路下游重要调节位点，能直接参与细胞生长增殖与分化的调节[2]。因此，本研究以肺腺癌患者为对象，探讨肺腺癌基因谱及p53、KRAS的表达及意义，报道如下。
1.资料与方法
1.1临床资料
选择2018年5月-2020年12月肺腺癌患者45例作为对象，男26例，女19例，年龄（43-75）岁，平均（58.95±6.49）岁;肿瘤直径（1-6）cm，平均（3.23±0.61）cm;TNM分期：I-II期31例，III-IV期14例;淋巴结转移：是21例，否24例;分化程度：高分化18例，中分化20例，低分化7例。纳入标准：（1）符合肺腺癌诊断标准，均经病理组织检查确诊;（2）均能完成腺癌基因谱及p53、KRAS检查，且患者均可耐受;（3）具有完整的基线及随访资料。排除标准：（1）精神异常、认知功能异常或器质性疾病者;（2）伴有自身免疫系统疾病、行放化疗治疗者。
1.2 方法
1.2.1 肺腺癌基因谱
采用二代测序法测定不同组织中KRAS基因突变位点，具体方法如下。试剂盒购置于Illumina提供的人类肺癌相关26个基因突变检测试剂盒。KRAS基因检测位点主要检测外显子2号12个密码子的16个不同的基因位点，并完成位于13密码子的1个突变位点，分析两种不同组织中KRAS基因突变情况。
1.2.2 P53蛋白
采用免疫组织化学法测定不同组织中P53蛋白表达水平，具体方法如下：将制备并获得的标本进行常规石蜡切片，常规脱蜡、水化后给予抗原进行热修复处理，去除内源性生物酶后、染色。P53工作液，常规采用DAB液（购自于基因科技有限公司）显色后，采用自来水进行冲洗，终止反应后进行苏木精1min染色，并利用盐酸乙醇分化。上述操作完毕后进行再冲洗、返蓝。梯度乙醇对标本脱水后再二甲苯的辅助作用下处理，中性树胶封固（免疫组化测定时，以盐酸盐缓冲液作为一抗阴性对照，利用已知阳性组织切片作为阳性对照）在400倍显微镜下对不同标本切片随机取5个视野，每个视野选择细胞200个计数。②判定方法。不同组织测定完毕后，采用半定量方法进行测定及判断。0分：阳性细胞占0%-10%;1分：阳性细胞占10.0%-25.0%;2分：阳性细胞占25%-50.0%;3分：阳性细胞占50.0%-75.0%;4分阳性细胞>75.0%。对于得分>3分视为阳性[3]。
1.3统计分析
采用SPSS24.0软件处理，计数资料行χ2检验，采用n（%）表示，计量资料行t检验，采用（ ）表示，P<0.05差异有统计学意义。
2结果
2.1 肺腺癌患者基因突变类型及构成比
45例肺腺癌患者均完成基因突变测定，结果表明：28例发生基因突变，突变率为62.22%。基因突变类型排在前三位分别为：EGFR、P53和KRAS，分别占：36.36%、22.73%和18.18%，见表1。
2.2 肺腺癌患者不同组织中p53蛋白阳性率比较
肺腺癌患者病灶组织中p53蛋白阳性率均高于癌旁组织（P<0.05），见表2。
3 讨论
本研究中采用二代测序法对肺腺癌患者完成基因谱分析，结果表明：基因突变类型排在前三位分别为：EGFR、P53和KRAS，分别占：36.36%、22.73%和18.18%。EGFR基因突变主要集中在19和21号外显子上，突变率较高，可发生共突变。而KRAS基因突变主要集中在2号外显子上。而p53基因突变多集中在4-8号外显子上。本研究中，肺腺癌患者病灶组织中p53、KRAS蛋白阳性率均高于癌旁组织（P<0.05），说明p53、KRAS蛋白在肺腺癌患者中表达异常。因此，临床上肺腺癌患者应加强基因突变、p53、KRAS蛋白测定，评估患者预后，指导临床治疗。
综上所述，肺腺癌患者基因中存在多种基因突变和共突变，且患者常伴有p53、KRAS蛋白表达异常，能为临床诊疗提供参考依据。
参考文献
[1]柴荣，范银星，赵家义，等.非小细胞肺癌中KRAS基因突变与PD-1/PD-L1信号通路相关性的研究进展[J].国际呼吸杂志，2019，39（23）：1822-1826.
[2]陈珑，王琳，何冬雷，等.T790M基因突变阳性的肺腺癌并骨转移患者个体化治疗远期疗效及预后的相关因素分析[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2019，26（2）：200-205.
[3]郑瑞锋，文海英，罗俊波，等.非小细胞肺癌Kras基因突变相关因素及其与一线同步放化疗疗效相关性研究[J].中华肿瘤防治杂志，2020，27（5）：47-52.
（佛山市禅城区中心病理科 广东 佛山 528000）