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摘要[目的]研究柽柳ThGSTT1基因的抗旱耐盐表达。[方法]通过对柽柳7个转录组分析，克隆获得一条谷胱甘肽转移酶基因，通过Blast比对及进化分析其结构，并采用qPCR分析基因的抗旱耐盐表达。[结果]该基因为谷胱甘肽Theta家族基因，因此命名为ThGSTT1基因；该基因编码的蛋白氨基酸残基数为231，分子量为26.1 kDa，理论等电点为7.14。表达谱分析显示，ThGSTT1在柽柳根和叶中的表达不同，具有一定的组织表达特异性。qPCR分析结果表明，盐胁迫明显诱导了ThGSTT1基因的表达，叶中胁迫7 d表达量为对照的7.48倍，根中胁迫9 d时最大。PEG胁迫下ThGSTT1基因的表达明显受抑制，根中胁迫第3 天的表达仅为对照的23.7%，而叶中胁迫第5 d表达量最低，为对照的12.7%。[结论]谷胱甘肽转移酶是一种重要的抗逆保护酶类，进行抗旱耐盐表达分析具有重要意义。
关键词刚毛柽柳；盐胁迫；表达分析；ThGSTT1
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04202-03
The Expression Analysis of a ThGSTT1 Gene from Tamarix hispida under Salt and Drought Stress
WANG Qiushui，GAO Caiqiu et al（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040）
Abstract[Objective] To study ThGSTT1 gene from Tamarix hispida under salt and drought stress.[Method] a full length cDNA of glutathione transferase gene was cloned from 7 transcriptome cDNA library of Tamarix hispida.[Result] The results of blast and phylogenetic tree showed that this gene was belonged to GST Theta family，so named as ThGSTT1.ThGSTT1 encoded protein of 231 amino acid residues with the molecular mass 26.1 kDa and theoretical isoelectric point of 7.14.The expression profile of ThGSTT1 under NaHCO3 showed difference between roots and leaves.The results of real time RTPCR showed that the expressions of ThGSTT1 were obvious induced after NaCl stress.In leaves，the expression level was highest at 7 d，it was 7.48 fold compared to the control； while in roots，its expression was 2.08 fold at 9 d.Under PEG stress，ThGSTT1 was mainly down-regulated，and in roots it was down regulated to 23.7% at 3 d，while in leaves it was expressed lowest at 5 d，only 12.7% of its in the control.[Conclusion] Glutathione transferase gene is an important protecting enzyme in plants，drought and salt resistance expression analysis has significance.
Key wordsTamarix hispida；Salt stress； Expression pattern； ThGSTT1
谷胱甘肽轉移酶（GST）是植物中常见的一种酶类，参与植物的耐盐[1]、抗干旱[2]、抗氧化[3-4]等不同胁迫的应答。过表达烟草GST基因能有效提高转基因烟草的GST/GPX活性、单脱氢抗坏血酸还原酶活性、脂质过氧化物酶活性，从而维持植株在盐胁迫和高温胁迫下相对稳定的生长[5]。拟南芥AtGSTU17基因可能通过光敏色素A协同调控GSH积累进而影响植株的光信号通路，但突变AtGSTU17基因的拟南芥反而增强了植株的抗旱耐盐性，表明同一谷胱甘肽转移酶基因对于不同的外界刺激可能具有不同的调控机理[6]。铝诱导型拟南芥AtGST1和AtGST11过表达拟南芥后，在铝胁迫下的转基因根和叶中体现时间依赖型表达方式，AtGST1在2 h被诱导最大，AtGST11在8 h最大，且二者的表达均受冷、热、重金属、氧化等胁迫诱导，表明不同的GST基因可能响应于同一种胁迫，但具体的诱导情况不同[7]。
前期研究表明，柽柳谷胱甘肽转移酶基因ThGSTZ1（zeta亚家族GST基因）过表达酵母后能有效的提高酵母在山梨醇、盐、重金属、异常温度等胁迫下的存活力[8]，过表达ThGSTZ1拟南芥提高了盐和干旱胁迫下转基因拟南芥的发芽率、生物量积累以及保护酶类活性，从而有效的改善植株的抗旱耐盐能力。植物GST基因是一个超家族基因，根据序列特征被分为alpha、mu、pi、sigma、theta、kappa、zeta和microsomal 8个不同的亚家族，每个家族的基因既有独自的功能特点，也有互相相似的调控方式[9]。为了进一步研究柽柳中其他亚家族GST基因在抗逆调控过程中的作用，笔者通过从刚毛柽柳7个cDNA文库中查找克隆获得一个Theta家族GST基因（ThGSTT1基因），对其进行生物信息学分析，了解其基本特征；并利用实时荧光定量PCR对ThGSTT1在NaCl胁迫和PEG胁迫不同时间的表达模式进行分析，以期为进一步的了解ThGSTT1基因的抗逆功能和抗逆机理奠定基础。 1材料与方法
1.1材料刚毛柽柳种子播种于沙土（1∶2）（V/V）基质中，在平均温度24 ℃，光照时间14 h/d，相对湿度70%～75%的温室中培养。挑选长势一致的4月龄柽柳用于研究。
1.2方法
谷胱甘肽转移酶（GST）在植物的许多生理过程和适应环境条件变化的过程中起重要作用。GST基因的表达受到许多因子的影响，其中氧化胁迫可诱导GST基因的表达。并且在前期研究中，GST可作为生物活性配体的结合蛋白，有些也可作为运输蛋白，可能在细胞间的运输中起作用[12]。因此，认为GST在植物细胞信号转导中可能具有重要作用。在植物中，GST的主要功能在于其能催化还原型谷胱甘肽（glutathione）的巯基与多种亲电、亲脂底物的结合，生成水溶性的产物，从而降低底物的毒性解除外界毒素以及内源有毒代谢物的侵害[9，13]。但植物的them，zeta类GST则较少参与外源物质代谢，其主要具有谷胱甘肽过氧化物酶活性，而参与氧化胁迫代谢，在氧胁迫下，Theta类GST具有还原组织氢过氧化物的作用[14]。胁迫后柽柳不同转录组中ThGSTT1基因的表达比较显示，ThGSTT1基因在胁迫后表达发生明显改变，进一步对柽柳PEG和NaCl胁迫后ThGSTT1基因的表达模式分析发现，其在柽柳叶与根中也都能对NaCl和PEG胁迫做出应答，受盐和干旱胁迫的调控，表明ThGSTT1基因可能参与柽柳的耐盐和抗旱过程。对于ThGSTT1是否与ThGSTZ1相似，都是通过增强过氧化物的清除能力从而提高抗旱耐盐能力的，还有待进一步的研究。
参考文献
[1] MOONS A.Osgstu3 and Osgtu4，Encoding Tau Class Glutathione STransferases，Are Heavy Metaland Hypoxic StressInduced and Differentially Salt StressResponsive in Rice Roots[J].FEBS Letters，2003，553（3）：427-432.
[2] BIANCHI M W，ROUX C，VARTANIAN N.Drought Regulation of GST8，Encoding the Arabidopsis Homologue of PARC/Nt107 Glutathione Transferase/Peroxidase[J].Physiologia Plantarum，2002，116（1）：96-105.
[3] CHEN W，CHAO G，SINGH K B.The Promoter of a H2O2Inducible，Arabidopsis Glutathione S[Transferase Gene Contains Closely Linked OBF and OBP1Binding Sites[J].The Plant Journal，1996，10（6）：955-966
[4] CHEN W，SINGH K B.The Auxin，Hydrogen Peroxide and Salicylic Acid Induced Expression of the Arabidopsis GST6 Promoter Is Mediated in Part by an OCS Element[J].The Plant Journal，2002，19（6）：667-677.
[5] ROXAS V P，LODHI S A，GARRETT D K，et al.Stress Tolerance in Transgenic Tobacco Seedlings That Overexpress Glutathione STransferase/Glutathione Peroxidase[J].Plant and Cell Physiology，2000，41（11）：1229-1234.
[6] CHEN J H，JIANG H W，HSIEH E J，et al.Lin.Drought and Salt Stress Tolerance of an Arabidopsis Glutathione STransferase U17 Knockout Mutant Are Attributed to the Combined Effect of Glutathione and Abscisic Acid[J].Plant Physiology，2012，158（1）：340-351.
[7] EZAKI B，SUZUKI M，MOTODA H，et al.Matsumoto.Mechanism of Gene Expression of Arabidopsis Glutathione STransferase，AtGST1，and AtGST11 in Response to Aluminum Stress[J].Plant Physiology，2004，134（4）：1672-1682.
[8] 楊桂燕，郭宇聪，王玉成，等.柽柳谷胱甘肽转移酶基因（THGSTZ1）转入酵母的抗逆能力分析[J].安徽农业科学，2013，28（41）：11272-11274，11135.
[9] DIXON D P，LAPTHORN A，EDWARDS R.Plant Glutathione Transferases[J].Genome Biology，2002，3（3）：1-10.
[10] MORTAZAVI A，WILLIAMS B A，MCCUE K，et al.Mapping and Quantifying Mammalian Transcriptomes by RNASeq[J].Nature Methods，2008，5（7）：621-628.
[11] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 2-ΔΔct Method[J].Methods（San Diego，Calif.），2001，25（4）：402-408.
[12] MOONS A.Regulatory and Functional Interactions of Plant Growth Regulators and Plant Glutathione STransferases（GSTs）[J].Vitamins & Hormones，2005，72：155-202.
[13] ARAKAWA Y，MASAOKA Y，SAKAI J，et al.An Alfalfa Gene Similar to Glutathione STransferase Is Induced in Root by Iron Deficiency[J].Soil Science and Plant Nutrition，2002，48（1）：111-116.
[14] KOUNO T，EZAKI B.Multiple Regulation of Arabidopsis AtGST11 Gene Expression by Four Transcription Factors under Abiotic Stresses[J].Physiologia Plantarum，2013，148（1）：97-104.
关键词刚毛柽柳；盐胁迫；表达分析；ThGSTT1
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04202-03
The Expression Analysis of a ThGSTT1 Gene from Tamarix hispida under Salt and Drought Stress
WANG Qiushui，GAO Caiqiu et al（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040）
Abstract[Objective] To study ThGSTT1 gene from Tamarix hispida under salt and drought stress.[Method] a full length cDNA of glutathione transferase gene was cloned from 7 transcriptome cDNA library of Tamarix hispida.[Result] The results of blast and phylogenetic tree showed that this gene was belonged to GST Theta family，so named as ThGSTT1.ThGSTT1 encoded protein of 231 amino acid residues with the molecular mass 26.1 kDa and theoretical isoelectric point of 7.14.The expression profile of ThGSTT1 under NaHCO3 showed difference between roots and leaves.The results of real time RTPCR showed that the expressions of ThGSTT1 were obvious induced after NaCl stress.In leaves，the expression level was highest at 7 d，it was 7.48 fold compared to the control； while in roots，its expression was 2.08 fold at 9 d.Under PEG stress，ThGSTT1 was mainly down-regulated，and in roots it was down regulated to 23.7% at 3 d，while in leaves it was expressed lowest at 5 d，only 12.7% of its in the control.[Conclusion] Glutathione transferase gene is an important protecting enzyme in plants，drought and salt resistance expression analysis has significance.
Key wordsTamarix hispida；Salt stress； Expression pattern； ThGSTT1
谷胱甘肽轉移酶（GST）是植物中常见的一种酶类，参与植物的耐盐[1]、抗干旱[2]、抗氧化[3-4]等不同胁迫的应答。过表达烟草GST基因能有效提高转基因烟草的GST/GPX活性、单脱氢抗坏血酸还原酶活性、脂质过氧化物酶活性，从而维持植株在盐胁迫和高温胁迫下相对稳定的生长[5]。拟南芥AtGSTU17基因可能通过光敏色素A协同调控GSH积累进而影响植株的光信号通路，但突变AtGSTU17基因的拟南芥反而增强了植株的抗旱耐盐性，表明同一谷胱甘肽转移酶基因对于不同的外界刺激可能具有不同的调控机理[6]。铝诱导型拟南芥AtGST1和AtGST11过表达拟南芥后，在铝胁迫下的转基因根和叶中体现时间依赖型表达方式，AtGST1在2 h被诱导最大，AtGST11在8 h最大，且二者的表达均受冷、热、重金属、氧化等胁迫诱导，表明不同的GST基因可能响应于同一种胁迫，但具体的诱导情况不同[7]。
前期研究表明，柽柳谷胱甘肽转移酶基因ThGSTZ1（zeta亚家族GST基因）过表达酵母后能有效的提高酵母在山梨醇、盐、重金属、异常温度等胁迫下的存活力[8]，过表达ThGSTZ1拟南芥提高了盐和干旱胁迫下转基因拟南芥的发芽率、生物量积累以及保护酶类活性，从而有效的改善植株的抗旱耐盐能力。植物GST基因是一个超家族基因，根据序列特征被分为alpha、mu、pi、sigma、theta、kappa、zeta和microsomal 8个不同的亚家族，每个家族的基因既有独自的功能特点，也有互相相似的调控方式[9]。为了进一步研究柽柳中其他亚家族GST基因在抗逆调控过程中的作用，笔者通过从刚毛柽柳7个cDNA文库中查找克隆获得一个Theta家族GST基因（ThGSTT1基因），对其进行生物信息学分析，了解其基本特征；并利用实时荧光定量PCR对ThGSTT1在NaCl胁迫和PEG胁迫不同时间的表达模式进行分析，以期为进一步的了解ThGSTT1基因的抗逆功能和抗逆机理奠定基础。 1材料与方法
1.1材料刚毛柽柳种子播种于沙土（1∶2）（V/V）基质中，在平均温度24 ℃，光照时间14 h/d，相对湿度70%～75%的温室中培养。挑选长势一致的4月龄柽柳用于研究。
1.2方法
谷胱甘肽转移酶（GST）在植物的许多生理过程和适应环境条件变化的过程中起重要作用。GST基因的表达受到许多因子的影响，其中氧化胁迫可诱导GST基因的表达。并且在前期研究中，GST可作为生物活性配体的结合蛋白，有些也可作为运输蛋白，可能在细胞间的运输中起作用[12]。因此，认为GST在植物细胞信号转导中可能具有重要作用。在植物中，GST的主要功能在于其能催化还原型谷胱甘肽（glutathione）的巯基与多种亲电、亲脂底物的结合，生成水溶性的产物，从而降低底物的毒性解除外界毒素以及内源有毒代谢物的侵害[9，13]。但植物的them，zeta类GST则较少参与外源物质代谢，其主要具有谷胱甘肽过氧化物酶活性，而参与氧化胁迫代谢，在氧胁迫下，Theta类GST具有还原组织氢过氧化物的作用[14]。胁迫后柽柳不同转录组中ThGSTT1基因的表达比较显示，ThGSTT1基因在胁迫后表达发生明显改变，进一步对柽柳PEG和NaCl胁迫后ThGSTT1基因的表达模式分析发现，其在柽柳叶与根中也都能对NaCl和PEG胁迫做出应答，受盐和干旱胁迫的调控，表明ThGSTT1基因可能参与柽柳的耐盐和抗旱过程。对于ThGSTT1是否与ThGSTZ1相似，都是通过增强过氧化物的清除能力从而提高抗旱耐盐能力的，还有待进一步的研究。
参考文献
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[11] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 2-ΔΔct Method[J].Methods（San Diego，Calif.），2001，25（4）：402-408.
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