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摘 要：本课题主要基于野菊花和橙皮具有作为天然植物源防腐剂的潜能，且防腐效果较好、原料来源广泛、易提取，现阶段对于野菊花和橙皮的研究还处于初级阶段，具有较高的开发价值，因而采用滤纸片法和琼脂扩散法分别测定野菊花和橙皮对于常见菌种的最低抑菌浓度（MIC），以及两者联合使用时的最低抑菌浓度，同时由于环状糊精分子具有去除异味和提高药效的作用，故而用其对于两种提取物进行包被，并测定其最低抑菌浓度。初步探明提取液的最佳制备方法以及为寻找更为有效的天然防腐剂提供理论依据。
关键词：野菊花；橙皮；提取物；最低抑菌浓度；环状糊精
引言
目前人类对于防腐剂的应用非常广泛，比如食品工业、化妆品行业，以及药物行业[1]等。常用的防腐剂主要是化学合成的，如苯甲酸盐，但可能会引起食物中毒，甚至产生致癌性、致畸性等严重的危及人类生命安全的问题[2]。而天然防腐剂具有抗菌性强[3]、安全无毒、水溶性好、热稳定性好、作用范围广等合成防腐剂无法比拟的优点，因此开发高效、安全、稳定的天然防腐剂已成为食品科学研究的热点之一，天然防腐剂[4]不但对人体健康无害，而且还具有一定的营养价值，随着研究的深入，被揭示的天然抗菌物质越来越多。
国内外对植物源天然防腐剂的研究异常活跃，究其原因是自然界的天然植物中存在许多具有抗菌作用[5]的生理活性物质。近年来，我国众多学者进行了植物源天然食品防腐剂[6]的研究。他们研究了大蒜、生姜、丁香等50多种香辛科植物及大黄、甘草、银杏叶等200多种中草药[7]及其它植物如竹叶等提取物的抗菌试验，发现有150多种具有广谱的抑菌活性，各提取物之间也存在抗菌性的协同增效作用[8]，并作为天然防腐剂应用在某些食品中。
野菊花为菊科植物野菊（Chrysanthemum indicum L）的干燥头状花序，又称疟疾草、苦薏、山菊花等[9]。具有清热解毒、疏风平肝之功效，在我国民间药用历史悠久，中国药典也早有收载[10]。野菊花广泛分布于我國东北、华北、西北、华东、西南等地，野生资源比较丰富，多生于石质山坡、草地、田边、路旁等处[11]，本实验用的野菊花产自湖南。现代药理证明：野菊花具有广谱抗菌、抗病毒、降压、增加冠脉血流量、清除氧自由基等作用[12]。野菊花生物活性多样、清香宜人、安全可靠，同时药源广泛、价格低廉，在药品、食品、保健品、化妆品等多领域具有开发价值。野菊花在抗病原微生物、抗感染中也有很大作用[13]。对野菊花煎液与挥发油的抑菌和抗病毒活性实验研究结果表明，二者均具抑菌和抗病毒活性，且野菊花煎液的抑菌和抗病毒活性均强于挥发油[14]。野菊花煎液中含黄酮类化合物、甘油酯、棕榈酸、多糖、β-胡萝卜素和绿原酸等物质，抗菌谱较广，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白喉杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、铜绿孢假单孢菌、福氏志贺菌有较强的抑制作用[15]。
桔皮抑菌防腐的主要有效成分是醇溶性色素以及橙皮苷[16]，橙（Hesperidin）异名陈皮苷、橘皮苷，微溶于乙醇，橙皮苷分子结构中含有多个羟基，有酸性，有亲水性，属黄酮物质的黄烷酮[17]。早期作为维生素P，近年来发现其具有降血压，抗过敏，降低骨密度、胆固醇，改变体内酶活性，改善微循环，抗菌、抗炎、抗肝炎、抗肿瘤等药理作用[18]。橙皮苷在质量百分比为0.06%-0.9%、pH值为5-9时对食品污染有广谱抗菌作用[19]，经热处理后的橙皮苷仍有抑菌作用[20]。
环糊精（CD）系淀粉经酶解环合后得到的由6个以上葡萄糖分子连结而成的环状低聚化合物[21]，因具有环状中空圆筒状结构而呈现一系列特殊性质，没有还原端和非还原端，不易受外切α-淀粉酶的作用，但能为内切型淀粉酶作用[22]。这种结构很稳定，不易受酸碱、热等条件的作用而分解，其熔点达300-350℃。CD“内疏水、外亲水”的简状刚性结构赋予了其独特的包合性能[23]。CD可以认为是具有一定分子大小的空囊，它可以包埋多种分子于其空穴中，CD分子通过范德华力、疏水相互作用完全或部分将被包埋分子包裹于其中，是药物制剂、食品工业、化妆品工业等方面应用较广的新型包合材料，能包合许多有机化合物和稀有气体、卤素等无机化合物，被其包合后的物质稳定性、挥发性、溶解性等各种理化性质发生了显著变化，且环糊精本身基本无毒、无刺激性[24]。
1 材料与方法
1.1 实验材料
仪器：电热恒温培养箱、离心机、超净工作台、灭菌锅、分析天平、电热鼓风干燥箱、摇床、冰箱
器材： 培养皿、移液管、试管、三角烧瓶、容量瓶、滤纸、纱布（用来过滤）
菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
1.2 提取物的制备及材料的准备
1.2.1 野菊花提取物的制备
（1）水煮法：称取100g野菊花，加10倍量蒸馏水小火煮沸2次，每次1h，合并2次水煎液，浓缩至100ml，最终得浓缩液的质量浓度为1g/ml，调整pH值至7.0～7.2，冰箱保存备用。
（2）醇提法：称取一定量野菊花，适当粉碎，加5倍量对5O%乙醇浸泡24h，60℃水浴3h，过滤后残渣再加5倍量对50%乙醇热浸3h，合并醇浸液，回收乙醇，最终得浓缩液的质量浓度为1g/ml，调整pH值至7.0～7.2，冰箱保存备用。
1.2.2 橙皮提取物的制备
橙皮的干燥：摘取新鲜柑桔果皮，用蒸馏水洗净后放入鼓风干燥箱在60℃恒温干燥12 h。将干燥后的柑桔果皮用高速组织捣碎机破碎，备用。
橙皮苷的提取：
（1）水煮法：称取100g橙皮，加10倍量蒸馏水小火煮沸2次，每次1h，合并2次水煎液，浓缩至100ml，最终得浓缩液的质量浓度为1g/ml，调整pH值至7.0～7.2，冰箱保存备用。 （2） 醇提法：称取50g干燥橙皮，加500ml85%乙醇， 80℃水浴8h，过滤取滤液，加盐酸调PH至4.0，低温过夜，11000rpm 10min，弃上清，抽真空（过夜），得到粉末。
1.2.3 培养基的制备
固体培养基（1000ml）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g、水1000ml
液体培养基（50ml）：牛肉膏0.15g、蛋白胨0.5g、氯化钠0.25g、水50ml
1.2.4 材料的灭菌：将实验所需的培养皿、移液管、镊子、玻璃刮棒等用牛皮纸包好；将实验所需培养基以及装好蒸馏水的锥形瓶等也用牛皮纸包好；将滤纸用打孔器制成直径6mm的圆纸片，分装于洁净干燥的小培养皿内，以上所有实验材料放在高压蒸汽灭菌锅中，湿热灭菌（121℃，20min），备用。
1.2.5 菌种的活化：将所有供试的菌种移接入相应的试管斜面培养基上，每种菌接支重复。细菌置37℃恒温培养箱内培养24h。每种菌株取2支供测试用，其余注明日期，置4℃冰箱冷藏备用。
1.2.6 供试菌株悬浮液制备：把预先进行菌种斜面活化的各菌种分别挑取2环制成菌悬液，然后对每种菌取2支盛有10ml无菌水的试管排在试管架上，稀释菌液浓度，使其含菌体为107-108个/ml，即得供试菌种，将各种菌的菌悬液贴好标签，备用。
1.3 抑菌实验方案
（1）二倍稀释法。最小抑菌浓度（MIC）的测定用二倍稀释法将提取液分别稀释成100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%等浓度梯度。
（2）滤纸片法。待培养基冷却到适当温度，将扩大培养好的菌液按5ml/100ml培养基接种，混匀后每一平皿倒入约15ml。待培养基凝固后，用无菌镊子夹取浸泡于野菊花提取物的滤纸片，滤去多余的汁液，以无菌操作将滤纸片对号放在培养基表面，每皿3片，每片相隔一定距离，以防止其相互影响。将放好濾纸片的含菌培养皿分别在37℃恒温箱中培养24h后，测定抑菌圈大小。
（3）琼脂扩散法。在直径为9cm的培养皿中倒入10ml左右的无菌培养基，待凝固后在上面安放牛津杯（规格：外径：8mm；内径6mm；高10mm），每平皿三个，再倒入含菌的培养基15ml，待其凝固后拔出牛津杯，每孔加入150μl稀释液，每个浓度设置三个平行对照，37℃恒温培养24h，然后测定其抑菌圈的大小。
1.4 CD分子包被方法
取100ml水加温到60℃，加入1.8gCD分子溶解后，搅拌下加入20ml野菊花提取液，用磁力搅拌器连续搅拌2h，加热煮沸，并稀释至100ml，则包被液原始浓度为0.2g/ml。琼脂扩散法测定抑菌圈直径大小。
实验结果：
用滤纸片法测定野菊花、橙皮水提物及其混合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用，结果见表1（质量浓度：1g/ml；滤纸片直径6mm）。
由表1可知野菊花和橙皮的提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，且两者联合使用比单独使用抑菌效果有所提高。
滤纸片法测定橙皮醇提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用，结果如表2（滤纸片直径6mm）。
由图1可知：橙皮提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑菌作用，并且在一定范围内随着浓度的提高其抑菌效果逐渐提高。
琼脂扩散法测定野菊花醇提物对大肠杆菌抑菌作用（牛津杯的规格：外径8mm；内径6mm；高10mm），结果见表3。
由图2可知：CD分子包被野菊花提取物后的抑菌效果有所提高，同时经过CD包被后的野菊花对大肠杆菌最低抑菌浓度为0.26mg/ml，比野菊花提取液对大肠杆菌的最低抑菌浓度（1.06mg/ml）低，且相同浓度下经过CD包被后的提取液的抑菌作用比包被前增加了15%。
琼脂扩散法测定野菊花醇提物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用（牛津杯的规格：外径8mm；内径6mm；高10mm），结果见表4。
由图3可知：CD分子包被野菊花提取物后的抑菌效果有所提高，同时经过CD包被后的野菊花对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度为0.26mg/ml，比野菊花提取液对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（0.52mg/ml）低，且相同浓度下经过CD包被后的提取液的抑菌作用比包被前增加了15%。
实验结论：
（1）野菊花和橙皮的提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，在一定范围内随着浓度的提高其抑菌效果逐渐提高。
（2）野菊花醇提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为1.06mg/ml、 0.52mg/ml。
（3）橙皮醇提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为0.05%。
（4）经过CD包被后的野菊花对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为0.26mg/ml。CD分子包被后两种提取物的抑菌作用均有所提高，相同浓度下经过CD包被后的野菊花醇提物的抑菌作用比包被前增加了15%，并且野菊花的气味也有所减少，达到了去味的效果。
（5）两种提取物联合使用比单独使用的抑菌作用较强。
（6）探讨出了两种提取野菊花和橙皮的方法，以及CD分子包被野菊花提取物的方法，并在比较中得到了较为优化的实验方案。
参考文献
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关键词：野菊花；橙皮；提取物；最低抑菌浓度；环状糊精
引言
目前人类对于防腐剂的应用非常广泛，比如食品工业、化妆品行业，以及药物行业[1]等。常用的防腐剂主要是化学合成的，如苯甲酸盐，但可能会引起食物中毒，甚至产生致癌性、致畸性等严重的危及人类生命安全的问题[2]。而天然防腐剂具有抗菌性强[3]、安全无毒、水溶性好、热稳定性好、作用范围广等合成防腐剂无法比拟的优点，因此开发高效、安全、稳定的天然防腐剂已成为食品科学研究的热点之一，天然防腐剂[4]不但对人体健康无害，而且还具有一定的营养价值，随着研究的深入，被揭示的天然抗菌物质越来越多。
国内外对植物源天然防腐剂的研究异常活跃，究其原因是自然界的天然植物中存在许多具有抗菌作用[5]的生理活性物质。近年来，我国众多学者进行了植物源天然食品防腐剂[6]的研究。他们研究了大蒜、生姜、丁香等50多种香辛科植物及大黄、甘草、银杏叶等200多种中草药[7]及其它植物如竹叶等提取物的抗菌试验，发现有150多种具有广谱的抑菌活性，各提取物之间也存在抗菌性的协同增效作用[8]，并作为天然防腐剂应用在某些食品中。
野菊花为菊科植物野菊（Chrysanthemum indicum L）的干燥头状花序，又称疟疾草、苦薏、山菊花等[9]。具有清热解毒、疏风平肝之功效，在我国民间药用历史悠久，中国药典也早有收载[10]。野菊花广泛分布于我國东北、华北、西北、华东、西南等地，野生资源比较丰富，多生于石质山坡、草地、田边、路旁等处[11]，本实验用的野菊花产自湖南。现代药理证明：野菊花具有广谱抗菌、抗病毒、降压、增加冠脉血流量、清除氧自由基等作用[12]。野菊花生物活性多样、清香宜人、安全可靠，同时药源广泛、价格低廉，在药品、食品、保健品、化妆品等多领域具有开发价值。野菊花在抗病原微生物、抗感染中也有很大作用[13]。对野菊花煎液与挥发油的抑菌和抗病毒活性实验研究结果表明，二者均具抑菌和抗病毒活性，且野菊花煎液的抑菌和抗病毒活性均强于挥发油[14]。野菊花煎液中含黄酮类化合物、甘油酯、棕榈酸、多糖、β-胡萝卜素和绿原酸等物质，抗菌谱较广，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白喉杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、铜绿孢假单孢菌、福氏志贺菌有较强的抑制作用[15]。
桔皮抑菌防腐的主要有效成分是醇溶性色素以及橙皮苷[16]，橙（Hesperidin）异名陈皮苷、橘皮苷，微溶于乙醇，橙皮苷分子结构中含有多个羟基，有酸性，有亲水性，属黄酮物质的黄烷酮[17]。早期作为维生素P，近年来发现其具有降血压，抗过敏，降低骨密度、胆固醇，改变体内酶活性，改善微循环，抗菌、抗炎、抗肝炎、抗肿瘤等药理作用[18]。橙皮苷在质量百分比为0.06%-0.9%、pH值为5-9时对食品污染有广谱抗菌作用[19]，经热处理后的橙皮苷仍有抑菌作用[20]。
环糊精（CD）系淀粉经酶解环合后得到的由6个以上葡萄糖分子连结而成的环状低聚化合物[21]，因具有环状中空圆筒状结构而呈现一系列特殊性质，没有还原端和非还原端，不易受外切α-淀粉酶的作用，但能为内切型淀粉酶作用[22]。这种结构很稳定，不易受酸碱、热等条件的作用而分解，其熔点达300-350℃。CD“内疏水、外亲水”的简状刚性结构赋予了其独特的包合性能[23]。CD可以认为是具有一定分子大小的空囊，它可以包埋多种分子于其空穴中，CD分子通过范德华力、疏水相互作用完全或部分将被包埋分子包裹于其中，是药物制剂、食品工业、化妆品工业等方面应用较广的新型包合材料，能包合许多有机化合物和稀有气体、卤素等无机化合物，被其包合后的物质稳定性、挥发性、溶解性等各种理化性质发生了显著变化，且环糊精本身基本无毒、无刺激性[24]。
1 材料与方法
1.1 实验材料
仪器：电热恒温培养箱、离心机、超净工作台、灭菌锅、分析天平、电热鼓风干燥箱、摇床、冰箱
器材： 培养皿、移液管、试管、三角烧瓶、容量瓶、滤纸、纱布（用来过滤）
菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
1.2 提取物的制备及材料的准备
1.2.1 野菊花提取物的制备
（1）水煮法：称取100g野菊花，加10倍量蒸馏水小火煮沸2次，每次1h，合并2次水煎液，浓缩至100ml，最终得浓缩液的质量浓度为1g/ml，调整pH值至7.0～7.2，冰箱保存备用。
（2）醇提法：称取一定量野菊花，适当粉碎，加5倍量对5O%乙醇浸泡24h，60℃水浴3h，过滤后残渣再加5倍量对50%乙醇热浸3h，合并醇浸液，回收乙醇，最终得浓缩液的质量浓度为1g/ml，调整pH值至7.0～7.2，冰箱保存备用。
1.2.2 橙皮提取物的制备
橙皮的干燥：摘取新鲜柑桔果皮，用蒸馏水洗净后放入鼓风干燥箱在60℃恒温干燥12 h。将干燥后的柑桔果皮用高速组织捣碎机破碎，备用。
橙皮苷的提取：
（1）水煮法：称取100g橙皮，加10倍量蒸馏水小火煮沸2次，每次1h，合并2次水煎液，浓缩至100ml，最终得浓缩液的质量浓度为1g/ml，调整pH值至7.0～7.2，冰箱保存备用。 （2） 醇提法：称取50g干燥橙皮，加500ml85%乙醇， 80℃水浴8h，过滤取滤液，加盐酸调PH至4.0，低温过夜，11000rpm 10min，弃上清，抽真空（过夜），得到粉末。
1.2.3 培养基的制备
固体培养基（1000ml）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g、水1000ml
液体培养基（50ml）：牛肉膏0.15g、蛋白胨0.5g、氯化钠0.25g、水50ml
1.2.4 材料的灭菌：将实验所需的培养皿、移液管、镊子、玻璃刮棒等用牛皮纸包好；将实验所需培养基以及装好蒸馏水的锥形瓶等也用牛皮纸包好；将滤纸用打孔器制成直径6mm的圆纸片，分装于洁净干燥的小培养皿内，以上所有实验材料放在高压蒸汽灭菌锅中，湿热灭菌（121℃，20min），备用。
1.2.5 菌种的活化：将所有供试的菌种移接入相应的试管斜面培养基上，每种菌接支重复。细菌置37℃恒温培养箱内培养24h。每种菌株取2支供测试用，其余注明日期，置4℃冰箱冷藏备用。
1.2.6 供试菌株悬浮液制备：把预先进行菌种斜面活化的各菌种分别挑取2环制成菌悬液，然后对每种菌取2支盛有10ml无菌水的试管排在试管架上，稀释菌液浓度，使其含菌体为107-108个/ml，即得供试菌种，将各种菌的菌悬液贴好标签，备用。
1.3 抑菌实验方案
（1）二倍稀释法。最小抑菌浓度（MIC）的测定用二倍稀释法将提取液分别稀释成100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%等浓度梯度。
（2）滤纸片法。待培养基冷却到适当温度，将扩大培养好的菌液按5ml/100ml培养基接种，混匀后每一平皿倒入约15ml。待培养基凝固后，用无菌镊子夹取浸泡于野菊花提取物的滤纸片，滤去多余的汁液，以无菌操作将滤纸片对号放在培养基表面，每皿3片，每片相隔一定距离，以防止其相互影响。将放好濾纸片的含菌培养皿分别在37℃恒温箱中培养24h后，测定抑菌圈大小。
（3）琼脂扩散法。在直径为9cm的培养皿中倒入10ml左右的无菌培养基，待凝固后在上面安放牛津杯（规格：外径：8mm；内径6mm；高10mm），每平皿三个，再倒入含菌的培养基15ml，待其凝固后拔出牛津杯，每孔加入150μl稀释液，每个浓度设置三个平行对照，37℃恒温培养24h，然后测定其抑菌圈的大小。
1.4 CD分子包被方法
取100ml水加温到60℃，加入1.8gCD分子溶解后，搅拌下加入20ml野菊花提取液，用磁力搅拌器连续搅拌2h，加热煮沸，并稀释至100ml，则包被液原始浓度为0.2g/ml。琼脂扩散法测定抑菌圈直径大小。
实验结果：
用滤纸片法测定野菊花、橙皮水提物及其混合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用，结果见表1（质量浓度：1g/ml；滤纸片直径6mm）。
由表1可知野菊花和橙皮的提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，且两者联合使用比单独使用抑菌效果有所提高。
滤纸片法测定橙皮醇提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用，结果如表2（滤纸片直径6mm）。
由图1可知：橙皮提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑菌作用，并且在一定范围内随着浓度的提高其抑菌效果逐渐提高。
琼脂扩散法测定野菊花醇提物对大肠杆菌抑菌作用（牛津杯的规格：外径8mm；内径6mm；高10mm），结果见表3。
由图2可知：CD分子包被野菊花提取物后的抑菌效果有所提高，同时经过CD包被后的野菊花对大肠杆菌最低抑菌浓度为0.26mg/ml，比野菊花提取液对大肠杆菌的最低抑菌浓度（1.06mg/ml）低，且相同浓度下经过CD包被后的提取液的抑菌作用比包被前增加了15%。
琼脂扩散法测定野菊花醇提物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用（牛津杯的规格：外径8mm；内径6mm；高10mm），结果见表4。
由图3可知：CD分子包被野菊花提取物后的抑菌效果有所提高，同时经过CD包被后的野菊花对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度为0.26mg/ml，比野菊花提取液对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（0.52mg/ml）低，且相同浓度下经过CD包被后的提取液的抑菌作用比包被前增加了15%。
实验结论：
（1）野菊花和橙皮的提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，在一定范围内随着浓度的提高其抑菌效果逐渐提高。
（2）野菊花醇提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为1.06mg/ml、 0.52mg/ml。
（3）橙皮醇提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为0.05%。
（4）经过CD包被后的野菊花对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为0.26mg/ml。CD分子包被后两种提取物的抑菌作用均有所提高，相同浓度下经过CD包被后的野菊花醇提物的抑菌作用比包被前增加了15%，并且野菊花的气味也有所减少，达到了去味的效果。
（5）两种提取物联合使用比单独使用的抑菌作用较强。
（6）探讨出了两种提取野菊花和橙皮的方法，以及CD分子包被野菊花提取物的方法，并在比较中得到了较为优化的实验方案。
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