论文部分内容阅读
[摘要]目的 探究穿心蓮内酯（AG）对人骨肉瘤（HOS）细胞的作用及机制。方法 以正常培养的HOS细胞为对照组，不同浓度AG作用后的HOS细胞为实验组。利用平板克隆实验观察AG对HOS细胞增殖能力的影响，Transwell实验观察AG对HOS细胞侵袭和迁移能力的影响，流式细胞术观察AG对HOS细胞周期分布的影响。结果 与对照组相比，实验组HOS细胞的生存率降低，抑制率升高，且呈现出浓度依赖性和时间依赖性，差异均有显著性（F=111.64、35.22，P<0.05）。实验组HOS细胞的增殖能力较对照组降低，也呈现出浓度依赖性，差异有显著性（F=250.95，P<0.05）。与对照组相比，实验组HOS细胞侵袭和迁移能力均降低，差异有显著性（t=21.23、23.36，P<0.05）。与对照组相比，实验组HOS细胞G1期比例降低，S期比例升高，G2期比例降低，差异均有统计学意义（t=4.12～38.88，P<0.05）;G1期浓度依赖性不明显（t=0.16～0.40，P>0.05），S期、G2期则表现出一定的浓度依赖性（t=5.41～11.90，P<0.05）。结论 AG能够明显降低HOS细胞的生存率，这可能与其影响HOS细胞的增殖能力、侵袭和迁移能力及细胞周期有关。
[关键词] 穿心莲内酯;骨肉瘤;细胞增殖;细胞运动;细胞周期
[中图分类号] R738.1 [文献标志码] A [文章编号] 2096-5532（2020）04-0451-04
doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.043
[网络出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200320.1519.005.html;2020-03-23 13：41：57
EFFECT OF ANDROGRAPHOLIDE ON HUMAN OSTEOSARCOMA CELLS AND ITS MECHANISM OF ACTION
ZHANG Xijin， LIU Xiaoqiang， GAO Tian， SHEN Ruowu
（Department of Special Medicine， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266021， China）
[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of andrographolide （AG） on human osteosarcoma （HOS） cells and its mechanism of action.Methods Normally cultured HOS cells were selected as control group and HOS cells treated with different concentrations of AG were selected as experimental group. Plate colony formation assay was used to observe the effect of AG on the proliferative capacity of HOS cells， Transwell assay was used to observe the effect of AG on the invasion and migration abilities of HOS cells， and flow cytometry was used to observe the effect of AG on HOS cell cycle distribution. Results Compared with the control group， the experimental group had a significant reduction in the viability of HOS cells and a significant increase in inhibition rate in a concentration- and time-dependent manner （F=111.64，35.22;P<0.05）. Compared with the control group， the experimental group had a significant reduction in proliferative capacity in a concentration-dependent manner （F=250.95，P<0.05）， as well as significant reductions in the invasion and migration abilities of HOS cells （t=21.23，23.36;P<0.05）. Compared with the control group， the experimental group had a significant reduction in the proportion of cells in G1 phase， a significant increase in the proportion of cells in S phase， and a significant reduction in the proportion of cells in G2 phase （t=4.12-38.88，P<0.05）; the change in the cells in G1 phase was not concentration-dependent （t=0.16-0.40，P>0.05）， and the changes in the cells in S phase and G2 phase showed a certain degree of concentration dependence （t=5.41-11.90，P<0.05）.Conclusion AG can significantly reduce the viability of HOS cells， possibly by affecting the proliferation， invasion， migration， and cell cycle of HOS cells. [KEY WORDS] andrographolide; osteosarcoma; cell proliferation; cell movement; cell cycle
穿心莲是一种临床应用极为广泛的中药[1]，其药用部位为爵床科植物穿心莲的干燥地上部分。该药具有清热解毒、凉血、消肿、燥湿等功效[2]，临床常用于治疗呼吸道感染、泌尿系感染、腹泻、湿疹及痈疮等病症[3-6]。近年来国内外大量研究发现，穿心莲的主要成分穿心莲内酯（AG）具有良好的抗肿瘤活性，对多种肿瘤具有很好的疗效，例如肺癌[7]、卵巢癌[8]、胶质母细胞瘤[9]、前列腺癌[10]等。但AG对骨肉瘤的作用却一直鲜有研究。本研究旨在探讨AG对人骨肉瘤（HOS）细胞生物学行为的影响及其作用机制，从而为临床骨肉瘤的治疗提供一定的参考。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 细胞培养与分组
HOS细胞由青岛大学基础医学院特种医学系实验室提供，用含体积分数0.10胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）和体积分数0.01青链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司）的RPMI-1640培养液，在37 ℃、体积分数0.05 CO2、饱和湿度条件下培养。待细胞贴壁程度达到80%～90%时，进行传代或其他实验操作。以正常培养的HOS细胞为对照组，不同浓度AG（北京索莱宝科技有限公司）作用后的HOS细胞为实验组。
1.2 平板克隆实验检测细胞增殖能力
取生长状态良好的细胞1瓶，应用2.5 g/L的EDTA胰蛋白酶溶液消化，收集细胞。每组设3个复孔，以每孔2×104个细胞接种于24孔板中，贴壁生长24 h。去掉原培养液，分别加入不含AG和含有1、2、5、10 μmol/L AG的培养液1 mL，培养2周，中间及时换液。弃培养液，甲醇固定后以10 g/L结晶紫染色液（北京索莱宝科技有限公司）染色。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗去浮色，自然风干后拍照。
1.3 Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移能力
取生长状态良好的细胞1瓶，接种在6孔板中，每孔106个细胞，贴壁生长过夜。弃去旧培养液，分别加入2 mL不含AG和含有50 μmol/L AG的培养液作用48 h。按基质胶∶无血清培养液=1∶8的比例稀释基质胶，取100 μL按比例稀释后的基质胶铺于Transwell试剂盒（康宁公司）上室，过夜。分别设铺胶组和不铺胶组，铺胶组测侵袭能力，不铺胶组测迁移能力。收集细胞，离心，去上清，用无血清培养液重悬。上室接种5×104个HOS细胞，下室加入含体积分数0.20胎牛血清的RPMI-1640培养液500 μL，作用48 h。取出小室，吸除上室培养液，棉签擦净，甲醇固定后用10 g/L结晶紫染色液染色。用PBS洗去浮色后，棉签再次擦净未穿膜细胞，晾干，倒置显微镜（奥林巴斯公司）下拍照。
1.4 流式细胞术检测细胞周期分布
取生长状态良好的细胞4瓶，以PBS清洗后，每瓶加3 mL无血清RPMI-1640培养液同步化过夜。同步化处理以后，弃去培养液，4瓶分别加入3 mL不含AG以及含有5、10、50 μmol/L AG的RPMI-1640培养液。作用24 h后，收集细胞，用冰预冷PBS清洗，离心，去上清，加入500 μL冰预冷的體积分数0.70的乙醇溶液重悬，4 ℃固定过夜。离心，去上清，用冰预冷PBS清洗乙醇。再次离心，去上清，按照细胞周期检测试剂盒（金克隆生物技术有限公司）说明书的要求处理沉淀。处理沉淀后应用流式细胞仪（赛默飞世尔科技有限公司）检测细胞周期分布。
1.5 统计学分析
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料结果以[AKx-D]±s表示，两组数据之间比较采用配对t检验，多组数据之间比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 AG对HOS细胞生存率的影响
与对照组相比较，实验组HOS细胞的生存率降低，抑制率升高，且呈现出浓度依赖性和时间依赖性，差异均有统计学意义（F=111.64、35.22，P<0.05），浓度和时间无交互作用（F=0.33，P>0.05）。表明AG能够降低HOS细胞生存率。见表1。
2.2 AG对HOS细胞增殖能力的影响
平板克隆实验结果显示，在AG浓度分别为0、1、2、5、10 μmol/L的条件下，HOS细胞的增殖率分别为100%、（82.87±3.62）%、（66.83±2.40）%、（46.83±3.26）%和（22.83±1.63）%（n=3），实验组HOS细胞的增殖能力明显低于对照组，且呈现出浓度依赖性，差异有显著性（F=250.95，P<0.05）。说明AG可以降低HOS细胞的增殖能力。
2.3 AG对HOS细胞侵袭和迁移能力的影响
Transwell实验结果显示，实验组HOS细胞的侵袭和迁移能力均明显低于对照组，差异有统计学意义（t=21.23、23.36，P<0.05）。表明AG能够降低HOS细胞的侵袭和迁移能力。见表2。
2.4 AG对HOS细胞周期分布的影响
流式细胞术结果显示，AG浓度与细胞周期存在交互作用（F=514.77，P<0.05）;与对照组相比，各实验组HOS细胞G1期比例降低，S期比例升高，G2期比例降低，差异均有统计学意义（t=4.12～38.88，P<0.05）;G1期的浓度依赖性不明显（t=0.16～0.40，P>0.05），S期、G2期则体现出一定的浓度依赖性（t=5.41～11.90，P<0.05）。表明AG能够影响HOS细胞的周期分布，阻滞其由S期至G2期。见表3。
3 讨 论 骨肉瘤是一种多发于青少年和儿童的原发性恶性骨肿瘤，发病年龄多在13～19岁之间，男性多于女性。骨肉瘤具有恶性程度高、转移早、发展快、预后差等4个特点[11]。现阶段骨肉瘤的临床治疗以手术联合新辅助化疗为主[12]。此外，基因治疗、分子靶向治疗、免疫治疗等新治疗技术的应用也取得了一定进展[13-20]。虽然骨肉瘤的临床治疗已经取得了长足的进步，但仍然存在很多局限性[21-22]，如化疗的毒副作用较大[23]，放疗对骨肉瘤的敏感性相对较差，复发性和转移性骨肿瘤缺乏有效的靶向治疗药物，骨肉瘤筛查率低，针对恶性肿瘤的标记物筛查缺少相应有效的研究等，这些都是现阶段骨肉瘤临床治疗中存在的问题[24]，仍有待进一步的研究。
相对西药来说，中药的毒副作用要小很多。近年来的研究结果表明，很多中药具有良好的抗肿瘤功效[25-26]，如柴胡、黄芩、大黄、蚤休、穿心莲等。穿心莲作为临床抗肿瘤的代表性药物之一，其主要成分AG具有良好的抗肿瘤活性，对多种肿瘤有效，包括肝癌、胃癌、肺癌、结直肠癌等[27-29]。然而，国内外极少有AG对骨肉瘤影响的研究报道，其作用机制更是不甚明了。因此，本研究探讨了AG对骨肉瘤细胞生物学行为的影响，以期发现新的可以用于骨肉瘤临床治疗的潜在药物。
药物对肿瘤的抑制作用主要体现在诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制细胞侵袭和迁移、调节机体免疫等方面[30]。本文研究结果显示，AG能够显著降低HOS细胞的生存率，且浓度越高，作用时间越长，HOS细胞的生存率越低，表明AG对HOS细胞有抑制作用。进一步的平板克隆实验结果表明，AG能够降低HOS细胞的增殖能力，浓度越高，HOS细胞的增殖能力越低。Transwell实验结果表明，AG能够抑制HOS细胞的侵袭和迁移。流式细胞术结果则表明，AG可以影响HOS细胞的周期分布，阻滞其由S期至G2期的过程，进而影响HOS细胞的增殖。以上结果说明，AG能够通过影响HOS细胞的增殖、侵袭迁移能力以及细胞周期分布等，发挥对HOS细胞的抑制作用，表明AG可能是一种潜在的治疗骨肉瘤的药物。
综上所述，本研究首次探讨了AG对骨肉瘤细胞的作用，证明了AG对HOS细胞的影响是多方面的，包括增殖能力、侵袭和转移能力以及细胞周期分布等，表明AG对HOS细胞有较强的抑制作用，可能是一种潜在的治疗骨肉瘤的药物。然而，本实验也存在局限性，如只证明了AG对HOS细胞有显著抑制作用，并初步探讨了其作用机制，而尚未探究AG对HOS细胞的分子作用机制，这将是我们后续研究的重点。希望本研究结果能够有助于发现更多的能夠安全有效治疗骨肉瘤的药物，进而对临床治疗骨肉瘤有所帮助。
[参考文献]
[1]谢璇，任莹璐，张惠敏，等. 穿心莲内酯的药理作用和应用研究进展[J]. 中西医结合心脑血管病杂志， 2018，16（19）：2809-2812.
[2]陈龙浩，黄涛阳，孙春玲，等. HPLC法同时测定慢性盆腔炎灌肠液中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量[J]. 西北药学杂志， 2015，30（5）：575-577.
[3]万新军. 穿心莲内酯及其衍生物的药理研究进展[J]. 中医临床研究， 2017，9（30）：144-145.
[4]张晓，唐力英，吴宏伟，等. 穿心莲现代研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志， 2018，24（18）：222-234.
[5]李梦诗，吴腾，曹静桦，等. 穿心莲内酯对糖尿病肾病小鼠的治疗作用及机制[J]. 中国药科大学学报， 2018，49（1）：97-101.
[6]黄春荣. 穿心莲内酯滴丸治疗风热证咽喉肿痛的疗效分析[J]. 内蒙古医学杂志， 2018，50（3）：353-354.
[7]LEE Y C， LIN H H， HSU C H， et al. Inhibitory effects of andrographolide on migration and invasion in human non-small cell lung cancer A549 cells via down-regulation of PI3K/Akt signaling pathway[J]. European Journal of Pharmacology， 2010，632（1/3）：23-32.
[8]苏芳静，张斌，田林燕. 穿心莲内酯对卵巢癌细胞株SKOV-3侵袭与凋亡的影响[J]. 中国病理生理杂志， 2017，33（7）：1328-1331.
[9]LI Yanchun， ZHANG Pengfei， QIU Feng， et al. Inactivation of PI3K/Akt signaling mediates proliferation inhibition and G2/M phase arrest induced by andrographolide in human glioblastoma cells[J]. Life Sciences， 2012，90（25/26）：962-967.
[10]MIR H， KAPUR N， SINGH R， et al. Andrographolide inhi-
bits prostate cancer by targeting cell cycle regulators， CXCR3 and CXCR7 chemokine receptors[J]. Cell Cycle （Georgetown， Tex.）， 2016，15（6）：819-826.
[11]ZHANG Ya， YANG Jingqing， ZHAO Na， et al. Progress in the chemotherapeutic treatment of osteosarcoma[J]. Oncology Letters， 2018，16（5）：6228-6237. [12]AZNAB M， HEMATTI M. Evaluation of clinical process in osteosarcoma patients treated with chemotherapy including cisplatin， adriamycin， ifosfamide， and etoposide and determination of the treatment sequels in a long-term 11-year follow-up[J]. Journal of Cancer Research and Therapeutics， 2017，13（2）：291-296.
[13]ZHANG Chunlin， ZHU Kunpeng， MA Xiaolong. Antisense lncRNA FOXC2-AS1 promotes doxorubicin resistance in osteosarcoma by increasing the expression of FOXC2[J]. Cancer Letters， 2017，396：66-75.
[14]DEL MARE S， HUSANIE H， IANCU O， et al. WWOX and p53 dysregulation synergize to drive the development of osteosarcoma[J]. Cancer Research， 2016，76（20）：6107-6117.
[15]PAN Jianqing， WANG Hao， LIU Xinmin， et al. Tumor restrictive suicide gene therapy for glioma controlled by the FOS promoter[J]. PLoS One， 2015，10（11）：e0143112.
[16]DUPAIN C， HARTTRAMPF A C， URBINATI G， et al. Relevance of fusion genes in pediatric cancers： toward precision medicine[J]. Molecular Therapy-Nucleic Acids， 2017，6：315-326.
[17]GUAN Ying， ZHANG Rui， PENG Zhibin， et al. Inhibition of IL-18-mediated myeloid derived suppressor cell accumulation enhances anti-PD1 efficacy against osteosarcoma cancer[J]. Journal of Bone Oncology， 2017，9：59-64.
[18]OTOUKESH B， BODDOUHI B， MOGHTADAEI M， et al. Novel molecular insights and new therapeutic strategies in osteosarcoma[J]. Cancer Cell International， 2018，18：158.
[19]XU Qiaolong， CHENG Li， CHEN Jianyang， et al. miR-376a inhibits the proliferation and invasion of osteosarcoma by targeting FBXO11[J]. Human Cell， 2019，32（3）：390-396.
[20]LI Chen， XIAO Xiaoqing， QIAN Yihong， et al. The CtBP1-p300-FOXO3a transcriptional complex represses the expression of the apoptotic regulators Bax and Bim in human osteosarcoma cells[J]. Journal of Cellular Physiology， 2019，234（12）：22365-22377.
[21]RUSSO C， LAVORGNA M， ESEN M， et al. Evaluation of acute and chronic ecotoxicity of cyclophosphamide， ifosfamide， their metabolites/transformation products and UV treated samples[J]. Environmental Pollution （Barking， Essex：1987）， 2018，233：356-363.
[22]TURNER H， SGUIN B， WORLEY D R， et al. Prognosis for dogs with stage Ⅲ osteosarcoma following treatment with amputation and chemotherapy with and without metastasectomy[J]. Journal of the American Veterinary Medical Association， 2017，251（11）：1293-1305.
[23]CIERNIK I F， NIEMIERKO A， HARMON D C， et al. Proton-based radiotherapy for unresectable or incompletely resected osteosarcoma[J]. Cancer， 2011，117（19）：4522-4530. [24]WONG P， HOUGHTON P， KIRSCH D G， et al. Combining targeted agents with modern radiotherapy in soft tissue sarcomas[J]. Journal of the National Cancer Institute， 2014，106（11）：2-15.
[25]黃弦歌，李和根. 中医药在治疗晚期非小细胞肺癌中的作用及优势[J]. 中医学， 2018，7（6）：340-347.
[26]唐德才. 活血化瘀药在抗肿瘤及转移中的运用思考[J]. 南京中医药大学学报， 2019，35（1）：1-4.
[27]JI Lili， SHEN Kaikai， JIANG Ping， et al. Critical roles of cellular glutathione homeostasis and jnk activation in andrographolide-mediated apoptotic cell death in human hepatoma cells[J]. Molecular Carcinogenesis， 2011，50（8）：580-591.
[28]SHI M D， LIN H H， CHIANG T A， et al. Andrographolide could inhibit human colorectal carcinoma Lovo cells migration and invasion via down-regulation of MMP-7 expression[J]. Chemico-Biological Interactions， 2009，180（3）：344-352.
[29]毕然，杜玉君，魏伟，等. 穿心莲内酯对人肾细胞癌786-0细胞增殖、迁移和凋亡的影响[J]. 吉林大学学报（医学版）， 2018，44（1）：18-20.
[30]焦存，芦现杰，谷万里. 大蒜素抗妇科恶性肿瘤机制的研究进展[J]. 现代中西医结合杂志， 2019，28（2）：222-225.
（本文编辑 马伟平）
[收稿日期]2019-04-05; [修订日期]2020-02-18
[基金项目]山东省高等学校科技计划项目（L16LK04）
[第一作者]张希劲（1993-），男，硕士研究生。
[通信作者]沈若武（1973-），男，硕士，教授，硕士生导师。E-mail：shenruowu@aliyun.com。
[关键词] 穿心莲内酯;骨肉瘤;细胞增殖;细胞运动;细胞周期
[中图分类号] R738.1 [文献标志码] A [文章编号] 2096-5532（2020）04-0451-04
doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.043
[网络出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200320.1519.005.html;2020-03-23 13：41：57
EFFECT OF ANDROGRAPHOLIDE ON HUMAN OSTEOSARCOMA CELLS AND ITS MECHANISM OF ACTION
ZHANG Xijin， LIU Xiaoqiang， GAO Tian， SHEN Ruowu
（Department of Special Medicine， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266021， China）
[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of andrographolide （AG） on human osteosarcoma （HOS） cells and its mechanism of action.Methods Normally cultured HOS cells were selected as control group and HOS cells treated with different concentrations of AG were selected as experimental group. Plate colony formation assay was used to observe the effect of AG on the proliferative capacity of HOS cells， Transwell assay was used to observe the effect of AG on the invasion and migration abilities of HOS cells， and flow cytometry was used to observe the effect of AG on HOS cell cycle distribution. Results Compared with the control group， the experimental group had a significant reduction in the viability of HOS cells and a significant increase in inhibition rate in a concentration- and time-dependent manner （F=111.64，35.22;P<0.05）. Compared with the control group， the experimental group had a significant reduction in proliferative capacity in a concentration-dependent manner （F=250.95，P<0.05）， as well as significant reductions in the invasion and migration abilities of HOS cells （t=21.23，23.36;P<0.05）. Compared with the control group， the experimental group had a significant reduction in the proportion of cells in G1 phase， a significant increase in the proportion of cells in S phase， and a significant reduction in the proportion of cells in G2 phase （t=4.12-38.88，P<0.05）; the change in the cells in G1 phase was not concentration-dependent （t=0.16-0.40，P>0.05）， and the changes in the cells in S phase and G2 phase showed a certain degree of concentration dependence （t=5.41-11.90，P<0.05）.Conclusion AG can significantly reduce the viability of HOS cells， possibly by affecting the proliferation， invasion， migration， and cell cycle of HOS cells. [KEY WORDS] andrographolide; osteosarcoma; cell proliferation; cell movement; cell cycle
穿心莲是一种临床应用极为广泛的中药[1]，其药用部位为爵床科植物穿心莲的干燥地上部分。该药具有清热解毒、凉血、消肿、燥湿等功效[2]，临床常用于治疗呼吸道感染、泌尿系感染、腹泻、湿疹及痈疮等病症[3-6]。近年来国内外大量研究发现，穿心莲的主要成分穿心莲内酯（AG）具有良好的抗肿瘤活性，对多种肿瘤具有很好的疗效，例如肺癌[7]、卵巢癌[8]、胶质母细胞瘤[9]、前列腺癌[10]等。但AG对骨肉瘤的作用却一直鲜有研究。本研究旨在探讨AG对人骨肉瘤（HOS）细胞生物学行为的影响及其作用机制，从而为临床骨肉瘤的治疗提供一定的参考。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 细胞培养与分组
HOS细胞由青岛大学基础医学院特种医学系实验室提供，用含体积分数0.10胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）和体积分数0.01青链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司）的RPMI-1640培养液，在37 ℃、体积分数0.05 CO2、饱和湿度条件下培养。待细胞贴壁程度达到80%～90%时，进行传代或其他实验操作。以正常培养的HOS细胞为对照组，不同浓度AG（北京索莱宝科技有限公司）作用后的HOS细胞为实验组。
1.2 平板克隆实验检测细胞增殖能力
取生长状态良好的细胞1瓶，应用2.5 g/L的EDTA胰蛋白酶溶液消化，收集细胞。每组设3个复孔，以每孔2×104个细胞接种于24孔板中，贴壁生长24 h。去掉原培养液，分别加入不含AG和含有1、2、5、10 μmol/L AG的培养液1 mL，培养2周，中间及时换液。弃培养液，甲醇固定后以10 g/L结晶紫染色液（北京索莱宝科技有限公司）染色。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗去浮色，自然风干后拍照。
1.3 Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移能力
取生长状态良好的细胞1瓶，接种在6孔板中，每孔106个细胞，贴壁生长过夜。弃去旧培养液，分别加入2 mL不含AG和含有50 μmol/L AG的培养液作用48 h。按基质胶∶无血清培养液=1∶8的比例稀释基质胶，取100 μL按比例稀释后的基质胶铺于Transwell试剂盒（康宁公司）上室，过夜。分别设铺胶组和不铺胶组，铺胶组测侵袭能力，不铺胶组测迁移能力。收集细胞，离心，去上清，用无血清培养液重悬。上室接种5×104个HOS细胞，下室加入含体积分数0.20胎牛血清的RPMI-1640培养液500 μL，作用48 h。取出小室，吸除上室培养液，棉签擦净，甲醇固定后用10 g/L结晶紫染色液染色。用PBS洗去浮色后，棉签再次擦净未穿膜细胞，晾干，倒置显微镜（奥林巴斯公司）下拍照。
1.4 流式细胞术检测细胞周期分布
取生长状态良好的细胞4瓶，以PBS清洗后，每瓶加3 mL无血清RPMI-1640培养液同步化过夜。同步化处理以后，弃去培养液，4瓶分别加入3 mL不含AG以及含有5、10、50 μmol/L AG的RPMI-1640培养液。作用24 h后，收集细胞，用冰预冷PBS清洗，离心，去上清，加入500 μL冰预冷的體积分数0.70的乙醇溶液重悬，4 ℃固定过夜。离心，去上清，用冰预冷PBS清洗乙醇。再次离心，去上清，按照细胞周期检测试剂盒（金克隆生物技术有限公司）说明书的要求处理沉淀。处理沉淀后应用流式细胞仪（赛默飞世尔科技有限公司）检测细胞周期分布。
1.5 统计学分析
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料结果以[AKx-D]±s表示，两组数据之间比较采用配对t检验，多组数据之间比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 AG对HOS细胞生存率的影响
与对照组相比较，实验组HOS细胞的生存率降低，抑制率升高，且呈现出浓度依赖性和时间依赖性，差异均有统计学意义（F=111.64、35.22，P<0.05），浓度和时间无交互作用（F=0.33，P>0.05）。表明AG能够降低HOS细胞生存率。见表1。
2.2 AG对HOS细胞增殖能力的影响
平板克隆实验结果显示，在AG浓度分别为0、1、2、5、10 μmol/L的条件下，HOS细胞的增殖率分别为100%、（82.87±3.62）%、（66.83±2.40）%、（46.83±3.26）%和（22.83±1.63）%（n=3），实验组HOS细胞的增殖能力明显低于对照组，且呈现出浓度依赖性，差异有显著性（F=250.95，P<0.05）。说明AG可以降低HOS细胞的增殖能力。
2.3 AG对HOS细胞侵袭和迁移能力的影响
Transwell实验结果显示，实验组HOS细胞的侵袭和迁移能力均明显低于对照组，差异有统计学意义（t=21.23、23.36，P<0.05）。表明AG能够降低HOS细胞的侵袭和迁移能力。见表2。
2.4 AG对HOS细胞周期分布的影响
流式细胞术结果显示，AG浓度与细胞周期存在交互作用（F=514.77，P<0.05）;与对照组相比，各实验组HOS细胞G1期比例降低，S期比例升高，G2期比例降低，差异均有统计学意义（t=4.12～38.88，P<0.05）;G1期的浓度依赖性不明显（t=0.16～0.40，P>0.05），S期、G2期则体现出一定的浓度依赖性（t=5.41～11.90，P<0.05）。表明AG能够影响HOS细胞的周期分布，阻滞其由S期至G2期。见表3。
3 讨 论 骨肉瘤是一种多发于青少年和儿童的原发性恶性骨肿瘤，发病年龄多在13～19岁之间，男性多于女性。骨肉瘤具有恶性程度高、转移早、发展快、预后差等4个特点[11]。现阶段骨肉瘤的临床治疗以手术联合新辅助化疗为主[12]。此外，基因治疗、分子靶向治疗、免疫治疗等新治疗技术的应用也取得了一定进展[13-20]。虽然骨肉瘤的临床治疗已经取得了长足的进步，但仍然存在很多局限性[21-22]，如化疗的毒副作用较大[23]，放疗对骨肉瘤的敏感性相对较差，复发性和转移性骨肿瘤缺乏有效的靶向治疗药物，骨肉瘤筛查率低，针对恶性肿瘤的标记物筛查缺少相应有效的研究等，这些都是现阶段骨肉瘤临床治疗中存在的问题[24]，仍有待进一步的研究。
相对西药来说，中药的毒副作用要小很多。近年来的研究结果表明，很多中药具有良好的抗肿瘤功效[25-26]，如柴胡、黄芩、大黄、蚤休、穿心莲等。穿心莲作为临床抗肿瘤的代表性药物之一，其主要成分AG具有良好的抗肿瘤活性，对多种肿瘤有效，包括肝癌、胃癌、肺癌、结直肠癌等[27-29]。然而，国内外极少有AG对骨肉瘤影响的研究报道，其作用机制更是不甚明了。因此，本研究探讨了AG对骨肉瘤细胞生物学行为的影响，以期发现新的可以用于骨肉瘤临床治疗的潜在药物。
药物对肿瘤的抑制作用主要体现在诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制细胞侵袭和迁移、调节机体免疫等方面[30]。本文研究结果显示，AG能够显著降低HOS细胞的生存率，且浓度越高，作用时间越长，HOS细胞的生存率越低，表明AG对HOS细胞有抑制作用。进一步的平板克隆实验结果表明，AG能够降低HOS细胞的增殖能力，浓度越高，HOS细胞的增殖能力越低。Transwell实验结果表明，AG能够抑制HOS细胞的侵袭和迁移。流式细胞术结果则表明，AG可以影响HOS细胞的周期分布，阻滞其由S期至G2期的过程，进而影响HOS细胞的增殖。以上结果说明，AG能够通过影响HOS细胞的增殖、侵袭迁移能力以及细胞周期分布等，发挥对HOS细胞的抑制作用，表明AG可能是一种潜在的治疗骨肉瘤的药物。
综上所述，本研究首次探讨了AG对骨肉瘤细胞的作用，证明了AG对HOS细胞的影响是多方面的，包括增殖能力、侵袭和转移能力以及细胞周期分布等，表明AG对HOS细胞有较强的抑制作用，可能是一种潜在的治疗骨肉瘤的药物。然而，本实验也存在局限性，如只证明了AG对HOS细胞有显著抑制作用，并初步探讨了其作用机制，而尚未探究AG对HOS细胞的分子作用机制，这将是我们后续研究的重点。希望本研究结果能够有助于发现更多的能夠安全有效治疗骨肉瘤的药物，进而对临床治疗骨肉瘤有所帮助。
[参考文献]
[1]谢璇，任莹璐，张惠敏，等. 穿心莲内酯的药理作用和应用研究进展[J]. 中西医结合心脑血管病杂志， 2018，16（19）：2809-2812.
[2]陈龙浩，黄涛阳，孙春玲，等. HPLC法同时测定慢性盆腔炎灌肠液中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量[J]. 西北药学杂志， 2015，30（5）：575-577.
[3]万新军. 穿心莲内酯及其衍生物的药理研究进展[J]. 中医临床研究， 2017，9（30）：144-145.
[4]张晓，唐力英，吴宏伟，等. 穿心莲现代研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志， 2018，24（18）：222-234.
[5]李梦诗，吴腾，曹静桦，等. 穿心莲内酯对糖尿病肾病小鼠的治疗作用及机制[J]. 中国药科大学学报， 2018，49（1）：97-101.
[6]黄春荣. 穿心莲内酯滴丸治疗风热证咽喉肿痛的疗效分析[J]. 内蒙古医学杂志， 2018，50（3）：353-354.
[7]LEE Y C， LIN H H， HSU C H， et al. Inhibitory effects of andrographolide on migration and invasion in human non-small cell lung cancer A549 cells via down-regulation of PI3K/Akt signaling pathway[J]. European Journal of Pharmacology， 2010，632（1/3）：23-32.
[8]苏芳静，张斌，田林燕. 穿心莲内酯对卵巢癌细胞株SKOV-3侵袭与凋亡的影响[J]. 中国病理生理杂志， 2017，33（7）：1328-1331.
[9]LI Yanchun， ZHANG Pengfei， QIU Feng， et al. Inactivation of PI3K/Akt signaling mediates proliferation inhibition and G2/M phase arrest induced by andrographolide in human glioblastoma cells[J]. Life Sciences， 2012，90（25/26）：962-967.
[10]MIR H， KAPUR N， SINGH R， et al. Andrographolide inhi-
bits prostate cancer by targeting cell cycle regulators， CXCR3 and CXCR7 chemokine receptors[J]. Cell Cycle （Georgetown， Tex.）， 2016，15（6）：819-826.
[11]ZHANG Ya， YANG Jingqing， ZHAO Na， et al. Progress in the chemotherapeutic treatment of osteosarcoma[J]. Oncology Letters， 2018，16（5）：6228-6237. [12]AZNAB M， HEMATTI M. Evaluation of clinical process in osteosarcoma patients treated with chemotherapy including cisplatin， adriamycin， ifosfamide， and etoposide and determination of the treatment sequels in a long-term 11-year follow-up[J]. Journal of Cancer Research and Therapeutics， 2017，13（2）：291-296.
[13]ZHANG Chunlin， ZHU Kunpeng， MA Xiaolong. Antisense lncRNA FOXC2-AS1 promotes doxorubicin resistance in osteosarcoma by increasing the expression of FOXC2[J]. Cancer Letters， 2017，396：66-75.
[14]DEL MARE S， HUSANIE H， IANCU O， et al. WWOX and p53 dysregulation synergize to drive the development of osteosarcoma[J]. Cancer Research， 2016，76（20）：6107-6117.
[15]PAN Jianqing， WANG Hao， LIU Xinmin， et al. Tumor restrictive suicide gene therapy for glioma controlled by the FOS promoter[J]. PLoS One， 2015，10（11）：e0143112.
[16]DUPAIN C， HARTTRAMPF A C， URBINATI G， et al. Relevance of fusion genes in pediatric cancers： toward precision medicine[J]. Molecular Therapy-Nucleic Acids， 2017，6：315-326.
[17]GUAN Ying， ZHANG Rui， PENG Zhibin， et al. Inhibition of IL-18-mediated myeloid derived suppressor cell accumulation enhances anti-PD1 efficacy against osteosarcoma cancer[J]. Journal of Bone Oncology， 2017，9：59-64.
[18]OTOUKESH B， BODDOUHI B， MOGHTADAEI M， et al. Novel molecular insights and new therapeutic strategies in osteosarcoma[J]. Cancer Cell International， 2018，18：158.
[19]XU Qiaolong， CHENG Li， CHEN Jianyang， et al. miR-376a inhibits the proliferation and invasion of osteosarcoma by targeting FBXO11[J]. Human Cell， 2019，32（3）：390-396.
[20]LI Chen， XIAO Xiaoqing， QIAN Yihong， et al. The CtBP1-p300-FOXO3a transcriptional complex represses the expression of the apoptotic regulators Bax and Bim in human osteosarcoma cells[J]. Journal of Cellular Physiology， 2019，234（12）：22365-22377.
[21]RUSSO C， LAVORGNA M， ESEN M， et al. Evaluation of acute and chronic ecotoxicity of cyclophosphamide， ifosfamide， their metabolites/transformation products and UV treated samples[J]. Environmental Pollution （Barking， Essex：1987）， 2018，233：356-363.
[22]TURNER H， SGUIN B， WORLEY D R， et al. Prognosis for dogs with stage Ⅲ osteosarcoma following treatment with amputation and chemotherapy with and without metastasectomy[J]. Journal of the American Veterinary Medical Association， 2017，251（11）：1293-1305.
[23]CIERNIK I F， NIEMIERKO A， HARMON D C， et al. Proton-based radiotherapy for unresectable or incompletely resected osteosarcoma[J]. Cancer， 2011，117（19）：4522-4530. [24]WONG P， HOUGHTON P， KIRSCH D G， et al. Combining targeted agents with modern radiotherapy in soft tissue sarcomas[J]. Journal of the National Cancer Institute， 2014，106（11）：2-15.
[25]黃弦歌，李和根. 中医药在治疗晚期非小细胞肺癌中的作用及优势[J]. 中医学， 2018，7（6）：340-347.
[26]唐德才. 活血化瘀药在抗肿瘤及转移中的运用思考[J]. 南京中医药大学学报， 2019，35（1）：1-4.
[27]JI Lili， SHEN Kaikai， JIANG Ping， et al. Critical roles of cellular glutathione homeostasis and jnk activation in andrographolide-mediated apoptotic cell death in human hepatoma cells[J]. Molecular Carcinogenesis， 2011，50（8）：580-591.
[28]SHI M D， LIN H H， CHIANG T A， et al. Andrographolide could inhibit human colorectal carcinoma Lovo cells migration and invasion via down-regulation of MMP-7 expression[J]. Chemico-Biological Interactions， 2009，180（3）：344-352.
[29]毕然，杜玉君，魏伟，等. 穿心莲内酯对人肾细胞癌786-0细胞增殖、迁移和凋亡的影响[J]. 吉林大学学报（医学版）， 2018，44（1）：18-20.
[30]焦存，芦现杰，谷万里. 大蒜素抗妇科恶性肿瘤机制的研究进展[J]. 现代中西医结合杂志， 2019，28（2）：222-225.
（本文编辑 马伟平）
[收稿日期]2019-04-05; [修订日期]2020-02-18
[基金项目]山东省高等学校科技计划项目（L16LK04）
[第一作者]张希劲（1993-），男，硕士研究生。
[通信作者]沈若武（1973-），男，硕士，教授，硕士生导师。E-mail：shenruowu@aliyun.com。