论文部分内容阅读
摘 要：为了建立一个重现性好、稳定性高，适用于海带属ISSR遗传分析的PCR反应体系，从海带属配子体材料中提取基因组DNA作为模板，应用正交设计试验对反应体系中各因子的不同浓度进行组合优化。结果显示：适用于海带ISSR扩增反应的最佳体系（20 μL）为：1×PCR buffer，1.2 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTPs，1.0 μmol/L ISSR引物，40 ng 模板DNA，0.25 U Taq DNA 聚合酶；扩增PCR程序为：95℃预变性3 min；95℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，共38个循环；最后72℃延伸10 min。在优化的海带ISSR反应条件下，扩增条带稳定，重现性好，为应用ISSR分子标记技术进行海带属遗传多样性研究和分子鉴定奠定了技术基础。
关键词：海带属；配子体；DNA提取；ISSR；体系优化
中图分类号：Q75 文献标志码：A 论文编号：2013-0938
Genomic DNA Extraction and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Saccharina
Li Yan， Cui Cuiju， Luo Shiju， Li Xiaojie， Zhao Juping， Sai Shan， Qian Rui， Wu Ruina
（Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd/National Alage Project Technology Research Centre/
Algae Genetic Breeding and Cultivation Technology Key Laboratory of Shandong Province， Yantai 264003， Shandong， China）
Abstract： In order to establish a reproducible， stable， and suitable reaction system of Saccharina for ISSR analysis of genetic differences， the genomic DNA extracted from gametophytes of Saccharina was used as template， the different concentrations of the factors in reaction system were optimized by orthogonal design experiment. The results showed that， the optimal ISSR reaction system （20 μL） contained 1 ×PCR buffer， 1.2 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTPs， 1 μmol/L ISSR primer， 40 ng template DNA and 0.25 U Taq DNA polymerase. The PCR program was pre-denatured at 95℃ for 3 min and followed by 38 cycles of 45 s at 95℃， 45 s at 52℃， 2 min at 72℃， and final extension of 10 min at 72℃. The optimal ISSR reaction system was stable and repeatable. This system could provide the technical foundation for the application of ISSR molecular marker technology for the study on genetic diversity and molecular identification of Saccharina.
Key words： Saccharina； Gametophyte； DNA Extraction； ISSR； System Optimization
0 引言
海带（Saccharina japonica）属于褐藻门（Phaeophyta）、海带目（Laminariales）、海带科（Laminariaceae） 、海带属（Saccharina）藻类，19世纪20年代从日本首次引进，并逐渐适应中国海域条件，现在是中国人工栽培历史最长、产量最高的大型经济海藻，在医药、食品、化工等方面都有广泛的应用[1-2]。近年来，中国又陆续引进了多个海带种类如Saccharina longissima、 Saccharina angustata、Saccharina ochotensis、Saccharina religiosa等丰富了海带种质资源，也为开展遗传育种和新品种杂交选育工作提供了材料[3-4]。海带的分子遗传学方面的基础研究开展较晚，目前针对海带遗传多样性研究的报道中主要以SSR、RAPD标记技术为主[5-6]。ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat，简单重复间序列）是在1994年由Ziekiewicz等[7]在SSR标记的基础上开发的一种新的分子标记，与SSR标记相比，ISSR不需要预先知道基因组的序列信息，也不需要开发引物，成本低、操作简便、反应的遗传多态性丰富。但在使用ISSR标记进行PCR扩增试验时，不同物种的试验材料对引物反应条件的要求也不同，因此需要对引物进行筛选和反应体系的优化。邵峰等[8]采用高盐低pH法提取紫色观赏辣椒的基因组DNA，并通过正交设计试验优化了ISSR-PCR反应体系；陈名红等[9]采用单因素试验对影响百合ISSR-PCR反应体系中的6个主要因素进行优化筛选，建立了适合百合属的ISSR最佳反应体系；汪斌等[10]筛选出适合红麻的ISSR引物，进行了体系优化，并利用ISSR扩增条带建立了6份红麻种质材料的指纹数据库；王新宇等[11]用ISSR分子标记技术构建了多态性水平较低的小麦种内指纹图谱，能将亲缘关系很近的品种或品系区分开。目前，ISSR已被广泛应用于物种的系统发育，品种鉴定和遗传多样性研究[12-14]，目前在国内，沈永宝等[15]、陈海云等[16]是利用ISSR分子标记技术在种质鉴定方面做得较好的专家。在海带属的分子标记技术研究中，尚未见有对ISSR反应体系优化的相关报道，因此本研究以海带配子体的基因组DNA为模板，应用正交设计试验对海带ISSR-PCR反应体系进行优化，为后续开展海带品种鉴定和遗传多样性研究奠定基础。 1 材料与方法
1.1 试验材料
以保存在国家海藻工程技术研究中心海藻种质库的海带配子体为试验材料，取状态良好，干净的克隆材料进行DNA提取。
1.2 基因组DNA提取
采用改进的CTAB法提取配子体基因组DNA，具体方法：取0.1 g湿重的配子体材料，尽可能的吸干水分，在1.5 μL离心管中，加入100 μL 2×CTAB提取缓冲液，包括2% CTAB（W/V），2%PVP（polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮），100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA（ pH 8.0），1.4 mmol/L NaCl，2%β-巯基乙醇（V/V）。用尖头研磨棒在离心管中将配子体迅速研碎，再加入600 μL 2×CTAB提取缓冲液，置于65℃水浴30 min， 期间每隔5 min上下颠倒数次；4℃1200 r/min 离心10 min；取上清，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），轻摇混匀； 4℃1200 r/min离心10 min；重复上述两个步骤2～3次，直至有机相和水相界面无白色蛋白层；加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀后-20℃静置2 h；4℃1200 r/min 离心10 min；70%乙醇洗涤2～3次，超净工作台中风干，加80 μL的TE溶解，用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA的浓度和纯度。DNA浓度统一稀释为40 ng/μL以方便后续使用。-20℃保存备用。
1.3 ISSR反应体系的优化
参照哥伦比亚大学公布的ISSR引物序列（UBC801-UBC900），由上海捷瑞生物工程有限公司合成，经预试验筛选，对Mg2+，dNTP，引物浓度，Taq DNA 聚合酶（Promega，USA）4个因素，分别取3个水平，设计L9（34）正交表进行正交试验（表1），取最适反应体系，进行退火温度的梯度试验。PCR反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，共38个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳检测。
2 结果与分析
2.1 海带配子体基因组DNA的提取
提取的海带配子体DNA条带整齐，无降解和杂质污染（图1）。紫外分光光度计测定的A260/A280比值在1.9左右，浓度约为50～100 ng/μL，可满足试验需要。该方法不需使用液氮研磨，只需用很少的试验材料便可提取质量符合要求的基因组DNA。
2.2 海带配子体ISSR反应体系优化
本试验根据4因素3水平正交设计表共有9个试验组合，PCR扩增结果见图2，可知，除个别泳道条带模糊之外，大部分组合都能扩出清晰的条带。综合考虑各因素及用量，觉得第5号组合扩增效果最好，扩增位点多，条带清楚，该体系（20 μL）为：1×PCR buffer，1.2 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTPs，1.0 μmol/L 引物，40 ng 模板DNA，0.25 U Taq DNA 聚合酶；扩增PCR程序为：95℃预变性3 min；95℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，共38个循环；最后72℃延伸10 min。选取5号组合的反应体系进行温度梯度试验，另选取4个个体，分设48、52、55℃3个温度，扩增结果电泳图谱见图3。48℃时扩增条带明亮、清晰、扩增效率高，但相比较52℃条件下，个体间的特异条带较多，能较好地反映出个体间的差异，虽然扩增效率不如48℃高，但条带也清晰可见。所以综合各方面考虑，选取52℃作为最适反应条件，用于后续群体的扩增。
2.3 海带配子体ISSR反应体系稳定性检测
利用优化的ISSR反应体系，选择12个海带配子体材料DNA，对该体系进行稳定性检测，从图4可以看出，经正交试验优化和温度梯度试验后的PCR体系扩增出的条带清晰、位点多，表明该体系稳定可靠，可用于后续海带配子体种质鉴定和遗传多样性分析等相关研究。
3 结论
试验找到了一种适用于ISSR-PCR反应的海带基因组DNA提取方法，该方法不需使用液氮研磨，只需用很少的试验材料便可提取质量符合要求的基因组DNA，节约材料。通过预试验和多因子正交设计试验得到适合海带的ISSR-PCR反应体系：1×PCR buffer，1.2 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTPs，1.0 μmol/L ISSR引物，40 ng模板DNA，0.25U Taq DNA聚合酶；扩增PCR程序为：95℃预变性3 min；95℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，共38个循环；72℃延伸10 min。
姜翠翠等[17]研究发现PCR反应体系中的各因素间存在一定的互作效应，所以本试验用正交试验代替单因素试验进行PCR体系的优化，对ISSR-PCR反应体系中主要的4个因素（Mg2+、dNTP、引物浓度、Taq DNA 聚合酶）分别选取3个水平进化优化试验。从试验结果看出：不同的引物浓度对扩增的条带有无或亮度无明显影响，但Mg2+浓度对条带的影响非常明显，当Mg2+浓度低时，出现部分条带的缺失；dNTP浓度的影响也无明显差异；退火温度影响扩增条带的式样，这点研究结果与邵峰等[8]和陈名红等[9]的研究相符合。
4 讨论
ISSR-PCR反应对基因组DNA的质量要求很高，预试验中也采用基因组DNA提取试剂盒（天根，中国）进行过海带的基因组DNA提取，但因海带本身含多糖、多酚，目前还没有针对海带专门设计的基因组提取试剂盒，所以效果不佳。本试验采用直接研磨配子体法，并利用改良的CTAB法进行基因组DNA的提取，得到的DNA纯度好、无杂质、无降解，在PCR扩增中稳定性高。但此方法步骤较繁琐，还需用到有机试剂，所以还有待进一步探索研究。 在设计优化试验的预试验中，试用了不同商家的Taq DNA 聚合酶，发现聚合酶的质量对PCR扩增结果影响非常大，不论是从条带的有无、带型的清晰度，还是扩增的重现性和稳定性等方面都有着直接的影响，这与何礼等[18]、姜翠翠等[17]、陈名红等[9]在进行随机引物扩增时得出的结论相同，结合条带扩增的质量和DNA聚合酶的价格，评估了不同商家聚合酶的性价比，决定选用Promega生产的GoTaq? Flexi DNA 聚合酶进行PCR扩增条件优化和后续的ISSR试验。本研究通过对ISSR-PCR反应体系中各因素的调整和优化，建立了适合海带进行ISSR-PCR扩增反应的体系和PCR扩增程序，为以后利用ISSR标记技术进行海带种质鉴定和遗传多样性分析提供了技术支持。
参考文献
[1] 李宏基.中国海带养殖若干问题[M].北京：海洋出版社，1996：3-14.
[2] Tseng C K. Algal biotechnology industries and research activities in China[J].Journal of Applied Phycology， 2001，13： 375-380.
[3] Masao O， Alan T C. Seaweed cultivation and marine ranching[J].Taxon，1993，43：151.
[4] 张全胜，曲善村，解建祖，等.芝罘湾养殖日本长海带实验[J].齐鲁渔业，2000，17（1）：10-11.
[5] Li B J， Shi Y Y， Yang G P， et al. Microsatellite DNA variation of the gametophyte clones isolated from introduced Laminaria japonica （phaeophyta） and L.longissima of China and varieties derived from them[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2008，50（3）：352-359.
[6] Bi Y H， Hu Y J， Zhou Z G. Genetic variation of Laminaria japonica （phaeophyta） populations in China as revealed by RAPD markers[J].Acta Oceanologica Sinica，2011，30（2）：103-112.
[7] Ziekiewicz E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification [J]. Genomics，1994（20）：176-183.
[8] 邵峰，乙引，徐娟，等.紫色观赏辣椒基因组DNA提取及ISSR-PCR体系的优化[J].中国农学通报，2013，29（28）：101-104.
[9] 陈名红，李玉，刘多，等.百合属ISSR反应条件优化的研究[J].中国农学通报，2013，29（4）：118-122.
[10] 汪斌，祁伟，兰涛，等.应用ISSR分子标记绘制红麻种质资源DNA指纹图谱[J].作物学报，2011，37（6）：1116-1123.
[11] 王新宇，陈佩度，亓增军，等. ISSR标记在小麦指纹图普分析中的应用研究初探[J]. 农业生物技术，2001， 9 （ 3）：261- 263.
[12] Guo W H， Jeong J H， Kim Z S， et al. Genetic diversity of Lilium tsingtauense in China and Korea revealed by ISSR markers and morphological characters[J].Biochemical Systematics and Ecology，2011，39（4-6）：352-360.
[13] 朱岩芳，祝水金，李永平，等.ISSR分子标记技术在植物种质资源研究中的应用[J].种子，2010，29（2）： 55-60.
[14] 黄光文，陈觉梁，王伟成，等.运用ISSR标记鉴别水稻品种的初步研究[J].杂交水稻，2006，21（3）：64-67.
[15] 沈永宝，施季森，赵洪亮.利用ISSR DNA标记鉴定主要银杏栽培品种[J].林业科学，2005，41（1）：202-204.
[16] 陈海云，宁德鲁，李勇杰，等.59个油橄榄种质的ISSR分子鉴定[J].东北林业大学学报，2013，41（3）：13-17.
[17] 姜翠翠，卢新坤，方智振，等.无患子基因组DNA提取及ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J].东南园艺，2013（1）：19-23.
[18] 何礼，袁水全，莫邦辉，等.RAPD扩增中商品酶体系对扩增产物的影响[J].应用与环境生物学报，2002，8（3）：308-313.
关键词：海带属；配子体；DNA提取；ISSR；体系优化
中图分类号：Q75 文献标志码：A 论文编号：2013-0938
Genomic DNA Extraction and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Saccharina
Li Yan， Cui Cuiju， Luo Shiju， Li Xiaojie， Zhao Juping， Sai Shan， Qian Rui， Wu Ruina
（Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd/National Alage Project Technology Research Centre/
Algae Genetic Breeding and Cultivation Technology Key Laboratory of Shandong Province， Yantai 264003， Shandong， China）
Abstract： In order to establish a reproducible， stable， and suitable reaction system of Saccharina for ISSR analysis of genetic differences， the genomic DNA extracted from gametophytes of Saccharina was used as template， the different concentrations of the factors in reaction system were optimized by orthogonal design experiment. The results showed that， the optimal ISSR reaction system （20 μL） contained 1 ×PCR buffer， 1.2 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTPs， 1 μmol/L ISSR primer， 40 ng template DNA and 0.25 U Taq DNA polymerase. The PCR program was pre-denatured at 95℃ for 3 min and followed by 38 cycles of 45 s at 95℃， 45 s at 52℃， 2 min at 72℃， and final extension of 10 min at 72℃. The optimal ISSR reaction system was stable and repeatable. This system could provide the technical foundation for the application of ISSR molecular marker technology for the study on genetic diversity and molecular identification of Saccharina.
Key words： Saccharina； Gametophyte； DNA Extraction； ISSR； System Optimization
0 引言
海带（Saccharina japonica）属于褐藻门（Phaeophyta）、海带目（Laminariales）、海带科（Laminariaceae） 、海带属（Saccharina）藻类，19世纪20年代从日本首次引进，并逐渐适应中国海域条件，现在是中国人工栽培历史最长、产量最高的大型经济海藻，在医药、食品、化工等方面都有广泛的应用[1-2]。近年来，中国又陆续引进了多个海带种类如Saccharina longissima、 Saccharina angustata、Saccharina ochotensis、Saccharina religiosa等丰富了海带种质资源，也为开展遗传育种和新品种杂交选育工作提供了材料[3-4]。海带的分子遗传学方面的基础研究开展较晚，目前针对海带遗传多样性研究的报道中主要以SSR、RAPD标记技术为主[5-6]。ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat，简单重复间序列）是在1994年由Ziekiewicz等[7]在SSR标记的基础上开发的一种新的分子标记，与SSR标记相比，ISSR不需要预先知道基因组的序列信息，也不需要开发引物，成本低、操作简便、反应的遗传多态性丰富。但在使用ISSR标记进行PCR扩增试验时，不同物种的试验材料对引物反应条件的要求也不同，因此需要对引物进行筛选和反应体系的优化。邵峰等[8]采用高盐低pH法提取紫色观赏辣椒的基因组DNA，并通过正交设计试验优化了ISSR-PCR反应体系；陈名红等[9]采用单因素试验对影响百合ISSR-PCR反应体系中的6个主要因素进行优化筛选，建立了适合百合属的ISSR最佳反应体系；汪斌等[10]筛选出适合红麻的ISSR引物，进行了体系优化，并利用ISSR扩增条带建立了6份红麻种质材料的指纹数据库；王新宇等[11]用ISSR分子标记技术构建了多态性水平较低的小麦种内指纹图谱，能将亲缘关系很近的品种或品系区分开。目前，ISSR已被广泛应用于物种的系统发育，品种鉴定和遗传多样性研究[12-14]，目前在国内，沈永宝等[15]、陈海云等[16]是利用ISSR分子标记技术在种质鉴定方面做得较好的专家。在海带属的分子标记技术研究中，尚未见有对ISSR反应体系优化的相关报道，因此本研究以海带配子体的基因组DNA为模板，应用正交设计试验对海带ISSR-PCR反应体系进行优化，为后续开展海带品种鉴定和遗传多样性研究奠定基础。 1 材料与方法
1.1 试验材料
以保存在国家海藻工程技术研究中心海藻种质库的海带配子体为试验材料，取状态良好，干净的克隆材料进行DNA提取。
1.2 基因组DNA提取
采用改进的CTAB法提取配子体基因组DNA，具体方法：取0.1 g湿重的配子体材料，尽可能的吸干水分，在1.5 μL离心管中，加入100 μL 2×CTAB提取缓冲液，包括2% CTAB（W/V），2%PVP（polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮），100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA（ pH 8.0），1.4 mmol/L NaCl，2%β-巯基乙醇（V/V）。用尖头研磨棒在离心管中将配子体迅速研碎，再加入600 μL 2×CTAB提取缓冲液，置于65℃水浴30 min， 期间每隔5 min上下颠倒数次；4℃1200 r/min 离心10 min；取上清，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），轻摇混匀； 4℃1200 r/min离心10 min；重复上述两个步骤2～3次，直至有机相和水相界面无白色蛋白层；加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀后-20℃静置2 h；4℃1200 r/min 离心10 min；70%乙醇洗涤2～3次，超净工作台中风干，加80 μL的TE溶解，用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA的浓度和纯度。DNA浓度统一稀释为40 ng/μL以方便后续使用。-20℃保存备用。
1.3 ISSR反应体系的优化
参照哥伦比亚大学公布的ISSR引物序列（UBC801-UBC900），由上海捷瑞生物工程有限公司合成，经预试验筛选，对Mg2+，dNTP，引物浓度，Taq DNA 聚合酶（Promega，USA）4个因素，分别取3个水平，设计L9（34）正交表进行正交试验（表1），取最适反应体系，进行退火温度的梯度试验。PCR反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，共38个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳检测。
2 结果与分析
2.1 海带配子体基因组DNA的提取
提取的海带配子体DNA条带整齐，无降解和杂质污染（图1）。紫外分光光度计测定的A260/A280比值在1.9左右，浓度约为50～100 ng/μL，可满足试验需要。该方法不需使用液氮研磨，只需用很少的试验材料便可提取质量符合要求的基因组DNA。
2.2 海带配子体ISSR反应体系优化
本试验根据4因素3水平正交设计表共有9个试验组合，PCR扩增结果见图2，可知，除个别泳道条带模糊之外，大部分组合都能扩出清晰的条带。综合考虑各因素及用量，觉得第5号组合扩增效果最好，扩增位点多，条带清楚，该体系（20 μL）为：1×PCR buffer，1.2 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTPs，1.0 μmol/L 引物，40 ng 模板DNA，0.25 U Taq DNA 聚合酶；扩增PCR程序为：95℃预变性3 min；95℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，共38个循环；最后72℃延伸10 min。选取5号组合的反应体系进行温度梯度试验，另选取4个个体，分设48、52、55℃3个温度，扩增结果电泳图谱见图3。48℃时扩增条带明亮、清晰、扩增效率高，但相比较52℃条件下，个体间的特异条带较多，能较好地反映出个体间的差异，虽然扩增效率不如48℃高，但条带也清晰可见。所以综合各方面考虑，选取52℃作为最适反应条件，用于后续群体的扩增。
2.3 海带配子体ISSR反应体系稳定性检测
利用优化的ISSR反应体系，选择12个海带配子体材料DNA，对该体系进行稳定性检测，从图4可以看出，经正交试验优化和温度梯度试验后的PCR体系扩增出的条带清晰、位点多，表明该体系稳定可靠，可用于后续海带配子体种质鉴定和遗传多样性分析等相关研究。
3 结论
试验找到了一种适用于ISSR-PCR反应的海带基因组DNA提取方法，该方法不需使用液氮研磨，只需用很少的试验材料便可提取质量符合要求的基因组DNA，节约材料。通过预试验和多因子正交设计试验得到适合海带的ISSR-PCR反应体系：1×PCR buffer，1.2 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTPs，1.0 μmol/L ISSR引物，40 ng模板DNA，0.25U Taq DNA聚合酶；扩增PCR程序为：95℃预变性3 min；95℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸2 min，共38个循环；72℃延伸10 min。
姜翠翠等[17]研究发现PCR反应体系中的各因素间存在一定的互作效应，所以本试验用正交试验代替单因素试验进行PCR体系的优化，对ISSR-PCR反应体系中主要的4个因素（Mg2+、dNTP、引物浓度、Taq DNA 聚合酶）分别选取3个水平进化优化试验。从试验结果看出：不同的引物浓度对扩增的条带有无或亮度无明显影响，但Mg2+浓度对条带的影响非常明显，当Mg2+浓度低时，出现部分条带的缺失；dNTP浓度的影响也无明显差异；退火温度影响扩增条带的式样，这点研究结果与邵峰等[8]和陈名红等[9]的研究相符合。
4 讨论
ISSR-PCR反应对基因组DNA的质量要求很高，预试验中也采用基因组DNA提取试剂盒（天根，中国）进行过海带的基因组DNA提取，但因海带本身含多糖、多酚，目前还没有针对海带专门设计的基因组提取试剂盒，所以效果不佳。本试验采用直接研磨配子体法，并利用改良的CTAB法进行基因组DNA的提取，得到的DNA纯度好、无杂质、无降解，在PCR扩增中稳定性高。但此方法步骤较繁琐，还需用到有机试剂，所以还有待进一步探索研究。 在设计优化试验的预试验中，试用了不同商家的Taq DNA 聚合酶，发现聚合酶的质量对PCR扩增结果影响非常大，不论是从条带的有无、带型的清晰度，还是扩增的重现性和稳定性等方面都有着直接的影响，这与何礼等[18]、姜翠翠等[17]、陈名红等[9]在进行随机引物扩增时得出的结论相同，结合条带扩增的质量和DNA聚合酶的价格，评估了不同商家聚合酶的性价比，决定选用Promega生产的GoTaq? Flexi DNA 聚合酶进行PCR扩增条件优化和后续的ISSR试验。本研究通过对ISSR-PCR反应体系中各因素的调整和优化，建立了适合海带进行ISSR-PCR扩增反应的体系和PCR扩增程序，为以后利用ISSR标记技术进行海带种质鉴定和遗传多样性分析提供了技术支持。
参考文献
[1] 李宏基.中国海带养殖若干问题[M].北京：海洋出版社，1996：3-14.
[2] Tseng C K. Algal biotechnology industries and research activities in China[J].Journal of Applied Phycology， 2001，13： 375-380.
[3] Masao O， Alan T C. Seaweed cultivation and marine ranching[J].Taxon，1993，43：151.
[4] 张全胜，曲善村，解建祖，等.芝罘湾养殖日本长海带实验[J].齐鲁渔业，2000，17（1）：10-11.
[5] Li B J， Shi Y Y， Yang G P， et al. Microsatellite DNA variation of the gametophyte clones isolated from introduced Laminaria japonica （phaeophyta） and L.longissima of China and varieties derived from them[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2008，50（3）：352-359.
[6] Bi Y H， Hu Y J， Zhou Z G. Genetic variation of Laminaria japonica （phaeophyta） populations in China as revealed by RAPD markers[J].Acta Oceanologica Sinica，2011，30（2）：103-112.
[7] Ziekiewicz E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification [J]. Genomics，1994（20）：176-183.
[8] 邵峰，乙引，徐娟，等.紫色观赏辣椒基因组DNA提取及ISSR-PCR体系的优化[J].中国农学通报，2013，29（28）：101-104.
[9] 陈名红，李玉，刘多，等.百合属ISSR反应条件优化的研究[J].中国农学通报，2013，29（4）：118-122.
[10] 汪斌，祁伟，兰涛，等.应用ISSR分子标记绘制红麻种质资源DNA指纹图谱[J].作物学报，2011，37（6）：1116-1123.
[11] 王新宇，陈佩度，亓增军，等. ISSR标记在小麦指纹图普分析中的应用研究初探[J]. 农业生物技术，2001， 9 （ 3）：261- 263.
[12] Guo W H， Jeong J H， Kim Z S， et al. Genetic diversity of Lilium tsingtauense in China and Korea revealed by ISSR markers and morphological characters[J].Biochemical Systematics and Ecology，2011，39（4-6）：352-360.
[13] 朱岩芳，祝水金，李永平，等.ISSR分子标记技术在植物种质资源研究中的应用[J].种子，2010，29（2）： 55-60.
[14] 黄光文，陈觉梁，王伟成，等.运用ISSR标记鉴别水稻品种的初步研究[J].杂交水稻，2006，21（3）：64-67.
[15] 沈永宝，施季森，赵洪亮.利用ISSR DNA标记鉴定主要银杏栽培品种[J].林业科学，2005，41（1）：202-204.
[16] 陈海云，宁德鲁，李勇杰，等.59个油橄榄种质的ISSR分子鉴定[J].东北林业大学学报，2013，41（3）：13-17.
[17] 姜翠翠，卢新坤，方智振，等.无患子基因组DNA提取及ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J].东南园艺，2013（1）：19-23.
[18] 何礼，袁水全，莫邦辉，等.RAPD扩增中商品酶体系对扩增产物的影响[J].应用与环境生物学报，2002，8（3）：308-313.