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摘 要：以‘桃源大叶茶’1芽2叶为材料，研究多酚氧化酶、过氧化物酶和β-葡萄糖苷酶在工夫红茶加工工艺中的动态变化，分析加工叶水分含量对3种酶酶活性的影响，以期为高香高茶黄素红茶的加工提供参考。结果表明，随着萎凋时间延长，3种酶酶活性均呈现不同程度的增加，萎凋14 h后，多酚氧化酶酶活性达到鲜叶的2.9倍，过氧化物酶酶活性达到鲜叶的3.5倍，β-葡萄糖苷酶活性达到鲜叶的2.1倍，在揉捻、发酵、干燥工艺中，3种酶活性不同程度地下降。根据研究结果可推断，β-葡萄糖苷酶对红茶香气品质的影响主要表现在萎凋过程及发酵早期，多酚氧化酶、过氧化物酶对红茶滋味品质的影响主要集中在发酵工艺，可依据萎凋叶中3种酶的活性变化程度及失水情况，确定萎凋适度的标准，依据发酵叶中的多酚氧化酶与过氧化物酶的比值变化情况，确定发酵适度的标准。
关键词：茶叶加工；红茶；多酚氧化酶；过氧化物酶；β-葡萄糖苷酶
中图分类号：S571.1 文献标志码：A 论文编号：2014-0292
Activity Changes of Polyphenol Oxidase， Peroxidase and β-Glycosidase in Black Tea Processing
Feng Jinyu1， Liu Kunyan1， Qin Yu1， Xiong Shuo1， Deng Yanli1， Gong Zhihua1， Xiao Wenjun1，2
（1Hunan Agricultural University， Changsha 410128， Hunan， China；
2Changsha Herun Tea Industry Technology Ltd， Changsha 410128， Hunan， China）
Abstract： By using one bud two leaves of ‘Taiyuan big leaf’ species in the summer as materials， the dynamic activity changes of polyphenol oxidase， peroxidase and β-glycosidase in processing black tea and the effect of water moisture of processing leaves on the enzyme was studied in order to provide reference for processing high incense and high theaflavins black tea. The results showed that with the extension of withering time， the activity of the three enzymes increased differently， after 14 hours withering， polyphenol oxidase activity increased 2.9 times， peroxidase activity increased 3.5 times， and β-glycosidase activity increased 2.1 times. In rolling， fermentation， drying process， the activity of three kind enzymes decreased differently. According to the results， it could be inferred that β-glycosidase affected aroma quality of black tea mainly in the process of fermentation and early withering， polyphenol oxidase， peroxidase affected the taste quality of black tea mainly in the process of fermentation. According to the degree of activity change the three kind enzyme and the condition of water loss in the withering leaves， the appropriate criteria black tea processing could be determined， and the appropriate criteria of fermentation also could be determined according to the ratio changes of polyphenol oxidase and peroxidase.
Key words： Tea Processing； Black Tea； Polyphenol Oxidase； Peroxidase； β-Glycosidase
0 引言
多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和β-葡萄糖苷酶是红茶加工中影响红茶色、香、味品质形成的3种关键酶[1-2]，其中，PPO主要影响茶黄素的酶促合成，POD主要影响茶黄素的酶促过氧化，β-葡萄糖苷酶则主要影响糖苷类香气物质的释放，因而如何科学调控3种酶的活性并加工高香高茶黄素红茶，是红茶加工化学和品质化学的重点。Bokuchava等[3]、竹尾忠一等[4-5]研究表明，PPO、POD在茶鲜叶的萎凋、揉捻工艺中，活性逐渐增加，且揉捻叶酶活性高达茶鲜叶酶活性的2～3倍。阮宇成等[6]通过红碎茶加工中PPO活性及同工酶的变化研究，得到了类似的结果。刘莉华等[7]对祁门传统功夫红茶和红碎茶加工中β-葡萄糖苷酶的活性变化进行比较研究，认为β-葡萄糖苷酶在加工红碎茶的萎凋结束时酶活最高，以后持续下降，而在加工功夫红茶的揉捻阶段酶活最高。王沁[8]、陈向东[9]、宛晓春[10]等研究表明，β-葡萄糖苷酶适宜于酸性介质。Takao等[11-12]研究显示，β-葡萄糖苷酶可将结合态萜烯醇类和芳樟醇类转化为游离态。可见，相关研究主要集中于影响红茶滋味品质或香气品质中某一类酶及其在萎凋、揉捻工艺中的动态变化，而对同时研究影响红茶滋味品质与香气品质的多酶类，及其在红茶加工的发酵关键工艺与干燥工艺的酶活性变化，则鲜见报道。笔者以适制红茶的‘桃源大叶茶’1芽2叶为原料，研究了PPO、POD和β-葡萄糖苷酶在工夫红茶各加工工艺中的动态活性变化，分析加工叶水分含量对各酶酶活性的影响，以期为高香高茶黄素红茶的加工提供参考。 1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料 ‘桃源大叶茶’1芽2叶新梢，采自湖南农业大学长安教学实习基地。
1.1.2 试剂 PVPP（不溶性聚乙烯吡咯烷酮），pH 7.0的柠檬酸磷酸缓冲液，0.3%愈创木酚，0.3%过氧化氢，pH 5.6的磷酸柠檬酸缓冲液，0.1%脯氨酸，1%邻苯二酚，6 mol/L尿素，pH 6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液， 10 mol/L PNPG（对硝基苯-β-D-葡萄糖苷），1 mol/L Na2CO3。
1.2 主要仪器设备
H-2050R台式高速冷冻离心机（长沙市八方科学仪器有限公司），SB-3200DTD超声波清洗机（宁波新艺生物科技股份有限公司），HH.W21-600A数显式电热恒温水浴锅（金坛市金城国胜试验仪器厂），UV-2000紫外可见光分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司），DHG.9246A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏试验设备有限公司），6CR-40茶叶揉捻机（浙江上洋机械有限公司），272-1型干湿球湿度计（上海华辰医用仪表厂）。
1.3 方法
1.3.1 工夫红茶加工 采摘‘桃源大叶茶’1芽2叶新梢，薄摊于25～28℃（空调控制）下萎凋14 h左右，隔4、6、4 h分别取样1次；萎凋叶在揉捻机上揉捻60 min，在 30 min时取样1次；揉捻叶摊放于竹盘，上盖湿润的纱布，在30℃、90%相对湿度条件下发酵，隔1、1.5、1 h各取样1次；发酵叶置于恒温干燥箱中于110℃下烘至7成干，取样1次，摊凉，再在80℃下烘至足干，隔0.5、1.5 h分别取样1次。
取样编号：1（萎凋0 h），2（萎凋4 h），3（萎凋10 h），4（萎凋14 h），5（揉捻，发酵0 h），6（发酵1 h），7（发酵2.5 h），8（发酵3.5 h，干燥0 h），9（干燥1 h），10（干燥1.5 h），11（干燥2.5 h）。取样后，各样品迅速用锡箔纸包裹并标号，置于液氮罐中进行低温处理1～2 min，然后取出保存于-40℃低温冰箱中，备用。
1.3.2 PPO酶液制备及活性测定 在参照王伟伟等[13]方法的基础上稍作改动：将1.25 g样品加0.75 g PVPP、适量石英砂和适量pH 5.6的磷酸柠檬酸缓冲液，冰浴研磨成浆，定容，浸提12 h；4000 r/15 min离心，上清液定容至25 mL，即酶液。取酶液1 mL加入反应混合液3 mL（反应混合液按pH 5.6柠檬酸磷酸缓冲液：0.1%脯氨酸：1%邻苯二酚=10：2：3），37℃恒温水浴保温 10 min，立即加入6 mol/L尿素溶液3 mL终止反应，460 nm波长处用10 mm比色皿比色，空白混合液中用pH 5.6的缓冲液代替邻苯二酚，酶活以每克样每分钟E460增加0.1为1个活力单位。
1.3.3 POD酶液制备及活性测定 在参照王伟伟等方法的基础上稍作改动：将1.25 g样品加 0.75 g PVPP、适量石英砂和适量pH 7.0的柠檬酸磷酸缓冲液，冰浴研磨成浆，定容，浸提12 h；4000 r/15 min离心，上清液定容至25 mL，即酶液。试管中加入0.3%愈创木酚 1 mL，缓冲液1.5 mL，酶液0.5 mL，摇匀后加0.3%过氧化氢1 mL，用水代替愈创木酚做空白，在35℃恒温水浴保温4 min，立即取出，然后用10 mm比色皿于 470 nm波长处测光密度，从反应开始5 min时立即读数，酶活以每克样每分钟E470增加0.1为1个活力单位。
1.3.4 β-葡萄糖苷酶酶液制备及活性测定 在参照王迎春等[14]方法的基础上稍作改动：称取茶鲜叶2.5 g，加等量PVPP 2.5 g，0.1 mol/L pH 6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液20 mL，冰上研磨成糊状；10000 r/min，4℃离心5 min；上清液移至另一离心管中，14000 r/min，4℃离心10 min；上清液移用缓冲液定容至一定体积（100 mL），摇匀，4℃贮存备用。在试管中依次加入0.6 mL pH 6.0的缓冲液、0.2 mL 10 mol/L PNPG、稀释后酶液0.2 mL；将试管置于恒温水浴中，37℃温水浴30 min，加入 2.0 mL 1 mol/L Na2CO3终止反应；用缓冲液代替酶液做空白，405 nm测吸光度值，酶活以每克样每分钟E405增加0.1为1个活力单位。
1.3.5 加工叶含水量测定 参照国家标准（GB 8304—2002）茶 水分测定[15]。
2 结果与分析
2.1 红茶加工中PPO与POD活性的动态变化
图1显示，PPO在萎凋期间活性随萎凋时间的延长而增加，萎凋结束时PPO活性增加至5.59 0.1△OD/（g·min），达到鲜叶PPO活性的2.9倍；经揉捻工序后，由于细胞的破损，酶促氧化开始，酶活性开始呈下降趋势，相比萎凋工序降幅达37%；发酵过程中PPO活性降幅虽没有揉捻工序大，但是由于PPO催化氧化邻苯二酚、儿茶素等形成邻醌，邻醌等物质反过来又抑制PPO的活性，使得PPO活性出现明显的下降，酶活性从揉捻时的3.52 0.1△OD/（g·min）降至发酵完成时的1.30 0.1△OD/（g·min）；干燥工艺的前1 h内，酶活性下降59%，干燥工艺后，红茶中的酶活性仍有0.26 0.1△OD/（g·min）。
由图1亦可知，萎凋期间POD活性逐步增强，特别是在萎凋后期，达到鲜叶POD酶活性的3.5倍，增幅最大；萎凋叶一经揉捻，叶细胞破损，底物与酶蛋白大量接触，酶活性大幅下降，揉捻后，酶活性降至萎凋叶的80%左右；发酵过程中，酶活性持续下降趋势，茶黄素的过氧化开始，逐步向茶红素、茶褐素方向发展，且发酵前期酶活性下降速度较后期快；干燥后POD活性受高温影响，活性钝化，从发酵完成时的7.68 0.1△OD/（g·min）降低到干燥结束时的1.32 0.1△OD/（g·min）。 2.2 红茶加工中β-葡萄糖苷酶活性的动态变化
图2表明，萎凋期间，由于细胞失水，β-葡萄糖苷酶及其作用底物的相对浓度升高，酶活性不断增加，萎凋14 h后，β-葡萄糖苷酶活性达32.42 0.1△OD/（g·min），达鲜叶β-葡萄糖苷酶活性的2.1倍；揉捻过程中，茶叶组织细胞破损，底物和酶开始接触并发生酶促反应，揉捻结束时酶活性降低了19%，从萎凋后的最大值32.42 0.1△OD/（g·min）降低到26.38 0.1△OD/（g·min）；经过3.5 h发酵，β-葡萄糖苷活性从揉捻后的26.38 0.1△OD/（g·min）降到20.78 0.1△OD/（g·min）；干燥过程中β-葡萄糖苷酶活性明显下降，降幅达91%。
2.3 红茶加工中水分含量的动态变化
图3以及结合图1～2表明，萎凋0～4 h内，水分含量下降，细胞液浓度升高，酶活性呈现升高趋势，在萎凋4～10 h过程中，水分持续降低，但3种酶的活性变化不大，直到水分含量降至63.2%后，酶活性快速增加，故生产中可在萎凋前期加快水分散失速度，在缩短萎凋时间的同时实现酶活性的快速增加。萎凋14 h时，各种酶的活性均达到最大值，生产中可以根据酶活性变化情况指导萎凋适度的标准。毛火干燥对PPO和POD的失活作用较明显，分别降至萎凋叶的10%和28%左右。足火后，毛茶中的PPO、POD和β-葡萄糖苷酶活性仍有残余，分别为5%、8%及0.6%。因此，为了防止过度发酵，在发酵工艺过程中，也可根据3种酶的活性变化或其比值变化情况，来判别发酵适度的标准，并在干燥前期用适当高温最大限度地钝化酶活性。
3 结论
红茶加工过程中，随着萎凋时间的延长，PPO、POD和β-葡萄糖苷酶3种酶酶活性均呈现不同程度的增加，萎凋14 h后，PPO酶活性达到鲜叶的2.9倍，POD酶活性达到鲜叶的3.5倍，β-葡萄糖苷酶活性达到鲜叶的2.1倍，这可能与茶鲜叶内含成分降解为酸性物质以及水分的散失有关，如糖类物质降解成有机酸、酯型儿茶素降解生成没食子酸、原果胶生成果胶酸、叶绿素水解为叶绿酸等，从而使得萎凋叶逐步向酸性转化，pH逐步与酶的最适pH相适应；同时，随着萎凋叶的逐步失水，酶的相对浓度升高，进而导致酶活的增加。从本研究结果来看，β-葡萄糖苷酶对红茶香气的影响主要表现在萎凋过程及发酵早期。此外，在红茶发酵的前2.5 h内，PPO的活性降低速率较POD慢，PPO下降25%，POD下降到33%，说明在发酵前期，PPO起主导作用，主要以酶促合成茶黄素为主，而在发酵后期，POD起主导作用，主要以酶促合成茶红素、茶褐素为主。因此，可根据萎凋叶中3种酶的活性变化程度以及萎凋叶的失水情况，确定红茶加工中萎凋适度的标准，然后根据发酵过程中的POD与PPO的比值变化情况，确定发酵适度的标准。
4 讨论
综上所述，红茶加工过程中PPO、POD和β-葡萄糖苷酶3个酶的活性都是呈现低-高-低的变化趋势。萎凋过程中，随着萎凋时间的的延长，酶活性均出现不同程度的提高。早在20世纪50年代末期，Avouchable等就曾研究指出，红茶制造的萎凋过程中，PPO、POD、过氧化氢酶、脱氢酶等活性均有所增高。竹尾忠一认为鲜叶中的PPO活性在萎凋时逐渐增加，轻萎凋和重萎凋叶的PPO活性在揉捻时均快速增加，高达鲜叶的2～3倍，酶活性在揉捻后随同发酵过程而降低。阮宇成等研究了红碎茶制造中PPO活性及同工酶的变化，得到了类似的结果，并且，竹尾忠一还通过抑制剂试验发现，PPO在萎凋时活性增加是新的酶蛋白形成的结果。有人也对萎凋期间PPO各组分活性的变化进行了研究。而Perea和Willinghearted则未观察到萎凋阶段PPO活性的增加。Mullah等的试验结果表明，萎凋过程中PPO活性随着叶子失水而逐渐降低，当以适当方式补充水分后，酶活性又得以恢复。肖伟祥、叶庆生也得到了类似的研究结果，所以，究竟何种结果正确至今尚无定论。前人研究表明，红茶的香气主要产生于发酵过程，从本研究结果看，揉捻后β-葡萄糖苷酶活性的急剧下降，从萎凋后的32.42 0.1△OD/（g·min）降到揉捻后的26.38 0.1△OD/（g·min），显然会严重影响它在香气形成中的作用。从这里也可以看出，β-葡萄糖苷酶对红茶香气形成的作用主要表现在萎凋过程及发酵早期，而发酵中的香气大量产生则与多酚类的氧化作用有关，萎凋中酶活性的提高与叶组织内部酸化有关。由于糖类物质降解成有机酸，酯型儿茶素酯解生成没食子酸，原果胶生成果胶酸，叶绿素水解有叶绿酸的形成等，使萎凋叶逐步向酸性转化，pH从鲜叶的近乎中性降低到与三大酶酶的最适pH相适应，使酶的活性增加。此外，随叶子的逐步失水，酶及其作用物的相对浓度升高，结合态的酶部分可转化为游离态。萎凋中氧化酶活性的提高则为揉捻开始以后的发酵工序准备了良好的发酵条件。在揉捻过程中，茶叶组织损伤和细胞破损，膜透性增加，化学成分和酶得到混合，各种化学反应得以实现。在红茶发酵过程中，多酚类物质与酶接触引起酶活性的迅速下降，同时PPO和POD也催化儿茶素迅速氧化聚合成茶黄素、茶红素和高聚类物质。发酵后期由于酶活性降低、底物减少和产物积累，使发酵速度减慢。儿茶素氧化形成的中间产物酿类和茶黄素也对酶有较强的变性作用。所以茶黄素积累到一定量以后，反过来抑制了催化其合成的酶活性，而限制本身量的积累。与萎凋叶相比，在发酵期间PPO和POD活性持续下降，但PPO的活性降低较POD快，PPO活性由3.52 0.1△OD/（g·min）下降到1.30 0.1△OD/（g·min），下降63%，POD活性由12.87 0.1△OD/（g·min）]下降到7.68 0.1△OD/（g·min）]，下降40%。这主要是由于发酵叶中有机酸的增加，pH降至5.0以下，使PPO丧失了最适pH条件，而POD的活性因酸度适宜而下降缓慢，使得PPO与POD的活性比值下降，POD逐渐居于主导地位，并对茶多酚氧化产物的形成和积累产生一定的影响。高温能使酶产生不可逆热变性，但在较低温度下，温度如升高，反而会促进酶的催化。所以在红茶干燥时采用先毛火再足火的干燥方式。毛火干燥对PPO和POD的失活作用较明显，分别降至萎凋叶的10%和28%左右。足火干燥后，毛茶中的PPO、POD和β-葡萄糖苷酶活性仍有残余，分别为5%、8%及0.6%。这主要是高分子量、热稳定性强的PPO1、POD2和POD3，即在发酵过程中起主要作用的并在成茶中残余的均是那些热稳定性好，对多酚敏感性差的高分子酶蛋白组分。施和森认为，发酵中形成的挥发性物质经烘干后只剩下20%～25%。因此，如何在红茶干燥过程中的某一最佳时段采取某些适当措施既能使某些热化学、分解反应顺利进行以产生出更多芳香物，又能使前期发酵叶中的大部分芳香物，尤其是对决定其香气的香叶醇等几种主要芳香物，尽量保留下来具有重要的研究价值。 参考文献
[1] 萧伟祥.制茶发酵理论与制茶实践[J].福建茶叶，1987，3：2-6.
[2] Martinez M V， Whitaker J R. The biochemistry and control of enzymatic browning[J]. Trends in Food Science & Technology，1995，6（6）：195-200.
[3] Bokuchava M A.制荼工艺学与生物化学[M].杭州：中国农科院茶叶研究所情报资料研究室，1982：73-78.
[4] 竹尾忠一.红茶制造中多酚氧化酶活性变化研究[M].长沙：湖南农学院科技情报资料室，1973（3）：99-102.
[5] 竹尾忠一.抗生素对阶形成的影响[M].长沙：湖南农学院科技情报资料室，1973（3）：106-109.
[6] 阮宇成.红碎茶制造过程中多酚氧化醉活性及同工酶的变化[M].杭州：中国农科院茶叶研究所，1981：209-210.
[7] 刘莉华，宛晓春，文勇，等.祁门红茶加工过程中β-葡萄糖苷酶活性变化研究[J].安徽农业大学学报，2003，30（4）：386-389.
[8] 陈向东，藤尾雄策.日本根霉IF05318胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及部分特性[J].微生物学报，1997，37（5）：368-373.
[9] 王沁，赵学慧.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的纯化与性质[J].厦门大学学报：自然科学版，1992，31（6）：687-691.
[10] 宛晓春.水果风味及风味酶的研究[D].无锡：无锡轻工大学，1992.
[11] Takeo T. Production of linalool and geraniol by hydrolytic breakdown of bound forms in disrupted tea shoots[J].Fy-histochemistry，1981，120（9）：2145-2147.
[12] 李远华.β-葡萄糖苷酶的研究进展[J].安徽农业大学学报，2002，29（4）：421-425.
[13] 王伟伟，江和源，江用文，等.红茶萎凋处理温湿度条件对PPO，POD及茶多酚和色素的影响[J].食品工业科技，2013，34（13）：86-90.
[14] 王迎春，李春华，刘晓军，等.茶叶中β-葡萄糖苷酶研究进展[J].安徽农业科学，2008，36（10）：4151-4153.
[15] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 8304—2002，茶水分测定[S].北京：中国标准出版社，2002：230.
关键词：茶叶加工；红茶；多酚氧化酶；过氧化物酶；β-葡萄糖苷酶
中图分类号：S571.1 文献标志码：A 论文编号：2014-0292
Activity Changes of Polyphenol Oxidase， Peroxidase and β-Glycosidase in Black Tea Processing
Feng Jinyu1， Liu Kunyan1， Qin Yu1， Xiong Shuo1， Deng Yanli1， Gong Zhihua1， Xiao Wenjun1，2
（1Hunan Agricultural University， Changsha 410128， Hunan， China；
2Changsha Herun Tea Industry Technology Ltd， Changsha 410128， Hunan， China）
Abstract： By using one bud two leaves of ‘Taiyuan big leaf’ species in the summer as materials， the dynamic activity changes of polyphenol oxidase， peroxidase and β-glycosidase in processing black tea and the effect of water moisture of processing leaves on the enzyme was studied in order to provide reference for processing high incense and high theaflavins black tea. The results showed that with the extension of withering time， the activity of the three enzymes increased differently， after 14 hours withering， polyphenol oxidase activity increased 2.9 times， peroxidase activity increased 3.5 times， and β-glycosidase activity increased 2.1 times. In rolling， fermentation， drying process， the activity of three kind enzymes decreased differently. According to the results， it could be inferred that β-glycosidase affected aroma quality of black tea mainly in the process of fermentation and early withering， polyphenol oxidase， peroxidase affected the taste quality of black tea mainly in the process of fermentation. According to the degree of activity change the three kind enzyme and the condition of water loss in the withering leaves， the appropriate criteria black tea processing could be determined， and the appropriate criteria of fermentation also could be determined according to the ratio changes of polyphenol oxidase and peroxidase.
Key words： Tea Processing； Black Tea； Polyphenol Oxidase； Peroxidase； β-Glycosidase
0 引言
多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和β-葡萄糖苷酶是红茶加工中影响红茶色、香、味品质形成的3种关键酶[1-2]，其中，PPO主要影响茶黄素的酶促合成，POD主要影响茶黄素的酶促过氧化，β-葡萄糖苷酶则主要影响糖苷类香气物质的释放，因而如何科学调控3种酶的活性并加工高香高茶黄素红茶，是红茶加工化学和品质化学的重点。Bokuchava等[3]、竹尾忠一等[4-5]研究表明，PPO、POD在茶鲜叶的萎凋、揉捻工艺中，活性逐渐增加，且揉捻叶酶活性高达茶鲜叶酶活性的2～3倍。阮宇成等[6]通过红碎茶加工中PPO活性及同工酶的变化研究，得到了类似的结果。刘莉华等[7]对祁门传统功夫红茶和红碎茶加工中β-葡萄糖苷酶的活性变化进行比较研究，认为β-葡萄糖苷酶在加工红碎茶的萎凋结束时酶活最高，以后持续下降，而在加工功夫红茶的揉捻阶段酶活最高。王沁[8]、陈向东[9]、宛晓春[10]等研究表明，β-葡萄糖苷酶适宜于酸性介质。Takao等[11-12]研究显示，β-葡萄糖苷酶可将结合态萜烯醇类和芳樟醇类转化为游离态。可见，相关研究主要集中于影响红茶滋味品质或香气品质中某一类酶及其在萎凋、揉捻工艺中的动态变化，而对同时研究影响红茶滋味品质与香气品质的多酶类，及其在红茶加工的发酵关键工艺与干燥工艺的酶活性变化，则鲜见报道。笔者以适制红茶的‘桃源大叶茶’1芽2叶为原料，研究了PPO、POD和β-葡萄糖苷酶在工夫红茶各加工工艺中的动态活性变化，分析加工叶水分含量对各酶酶活性的影响，以期为高香高茶黄素红茶的加工提供参考。 1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料 ‘桃源大叶茶’1芽2叶新梢，采自湖南农业大学长安教学实习基地。
1.1.2 试剂 PVPP（不溶性聚乙烯吡咯烷酮），pH 7.0的柠檬酸磷酸缓冲液，0.3%愈创木酚，0.3%过氧化氢，pH 5.6的磷酸柠檬酸缓冲液，0.1%脯氨酸，1%邻苯二酚，6 mol/L尿素，pH 6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液， 10 mol/L PNPG（对硝基苯-β-D-葡萄糖苷），1 mol/L Na2CO3。
1.2 主要仪器设备
H-2050R台式高速冷冻离心机（长沙市八方科学仪器有限公司），SB-3200DTD超声波清洗机（宁波新艺生物科技股份有限公司），HH.W21-600A数显式电热恒温水浴锅（金坛市金城国胜试验仪器厂），UV-2000紫外可见光分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司），DHG.9246A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏试验设备有限公司），6CR-40茶叶揉捻机（浙江上洋机械有限公司），272-1型干湿球湿度计（上海华辰医用仪表厂）。
1.3 方法
1.3.1 工夫红茶加工 采摘‘桃源大叶茶’1芽2叶新梢，薄摊于25～28℃（空调控制）下萎凋14 h左右，隔4、6、4 h分别取样1次；萎凋叶在揉捻机上揉捻60 min，在 30 min时取样1次；揉捻叶摊放于竹盘，上盖湿润的纱布，在30℃、90%相对湿度条件下发酵，隔1、1.5、1 h各取样1次；发酵叶置于恒温干燥箱中于110℃下烘至7成干，取样1次，摊凉，再在80℃下烘至足干，隔0.5、1.5 h分别取样1次。
取样编号：1（萎凋0 h），2（萎凋4 h），3（萎凋10 h），4（萎凋14 h），5（揉捻，发酵0 h），6（发酵1 h），7（发酵2.5 h），8（发酵3.5 h，干燥0 h），9（干燥1 h），10（干燥1.5 h），11（干燥2.5 h）。取样后，各样品迅速用锡箔纸包裹并标号，置于液氮罐中进行低温处理1～2 min，然后取出保存于-40℃低温冰箱中，备用。
1.3.2 PPO酶液制备及活性测定 在参照王伟伟等[13]方法的基础上稍作改动：将1.25 g样品加0.75 g PVPP、适量石英砂和适量pH 5.6的磷酸柠檬酸缓冲液，冰浴研磨成浆，定容，浸提12 h；4000 r/15 min离心，上清液定容至25 mL，即酶液。取酶液1 mL加入反应混合液3 mL（反应混合液按pH 5.6柠檬酸磷酸缓冲液：0.1%脯氨酸：1%邻苯二酚=10：2：3），37℃恒温水浴保温 10 min，立即加入6 mol/L尿素溶液3 mL终止反应，460 nm波长处用10 mm比色皿比色，空白混合液中用pH 5.6的缓冲液代替邻苯二酚，酶活以每克样每分钟E460增加0.1为1个活力单位。
1.3.3 POD酶液制备及活性测定 在参照王伟伟等方法的基础上稍作改动：将1.25 g样品加 0.75 g PVPP、适量石英砂和适量pH 7.0的柠檬酸磷酸缓冲液，冰浴研磨成浆，定容，浸提12 h；4000 r/15 min离心，上清液定容至25 mL，即酶液。试管中加入0.3%愈创木酚 1 mL，缓冲液1.5 mL，酶液0.5 mL，摇匀后加0.3%过氧化氢1 mL，用水代替愈创木酚做空白，在35℃恒温水浴保温4 min，立即取出，然后用10 mm比色皿于 470 nm波长处测光密度，从反应开始5 min时立即读数，酶活以每克样每分钟E470增加0.1为1个活力单位。
1.3.4 β-葡萄糖苷酶酶液制备及活性测定 在参照王迎春等[14]方法的基础上稍作改动：称取茶鲜叶2.5 g，加等量PVPP 2.5 g，0.1 mol/L pH 6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液20 mL，冰上研磨成糊状；10000 r/min，4℃离心5 min；上清液移至另一离心管中，14000 r/min，4℃离心10 min；上清液移用缓冲液定容至一定体积（100 mL），摇匀，4℃贮存备用。在试管中依次加入0.6 mL pH 6.0的缓冲液、0.2 mL 10 mol/L PNPG、稀释后酶液0.2 mL；将试管置于恒温水浴中，37℃温水浴30 min，加入 2.0 mL 1 mol/L Na2CO3终止反应；用缓冲液代替酶液做空白，405 nm测吸光度值，酶活以每克样每分钟E405增加0.1为1个活力单位。
1.3.5 加工叶含水量测定 参照国家标准（GB 8304—2002）茶 水分测定[15]。
2 结果与分析
2.1 红茶加工中PPO与POD活性的动态变化
图1显示，PPO在萎凋期间活性随萎凋时间的延长而增加，萎凋结束时PPO活性增加至5.59 0.1△OD/（g·min），达到鲜叶PPO活性的2.9倍；经揉捻工序后，由于细胞的破损，酶促氧化开始，酶活性开始呈下降趋势，相比萎凋工序降幅达37%；发酵过程中PPO活性降幅虽没有揉捻工序大，但是由于PPO催化氧化邻苯二酚、儿茶素等形成邻醌，邻醌等物质反过来又抑制PPO的活性，使得PPO活性出现明显的下降，酶活性从揉捻时的3.52 0.1△OD/（g·min）降至发酵完成时的1.30 0.1△OD/（g·min）；干燥工艺的前1 h内，酶活性下降59%，干燥工艺后，红茶中的酶活性仍有0.26 0.1△OD/（g·min）。
由图1亦可知，萎凋期间POD活性逐步增强，特别是在萎凋后期，达到鲜叶POD酶活性的3.5倍，增幅最大；萎凋叶一经揉捻，叶细胞破损，底物与酶蛋白大量接触，酶活性大幅下降，揉捻后，酶活性降至萎凋叶的80%左右；发酵过程中，酶活性持续下降趋势，茶黄素的过氧化开始，逐步向茶红素、茶褐素方向发展，且发酵前期酶活性下降速度较后期快；干燥后POD活性受高温影响，活性钝化，从发酵完成时的7.68 0.1△OD/（g·min）降低到干燥结束时的1.32 0.1△OD/（g·min）。 2.2 红茶加工中β-葡萄糖苷酶活性的动态变化
图2表明，萎凋期间，由于细胞失水，β-葡萄糖苷酶及其作用底物的相对浓度升高，酶活性不断增加，萎凋14 h后，β-葡萄糖苷酶活性达32.42 0.1△OD/（g·min），达鲜叶β-葡萄糖苷酶活性的2.1倍；揉捻过程中，茶叶组织细胞破损，底物和酶开始接触并发生酶促反应，揉捻结束时酶活性降低了19%，从萎凋后的最大值32.42 0.1△OD/（g·min）降低到26.38 0.1△OD/（g·min）；经过3.5 h发酵，β-葡萄糖苷活性从揉捻后的26.38 0.1△OD/（g·min）降到20.78 0.1△OD/（g·min）；干燥过程中β-葡萄糖苷酶活性明显下降，降幅达91%。
2.3 红茶加工中水分含量的动态变化
图3以及结合图1～2表明，萎凋0～4 h内，水分含量下降，细胞液浓度升高，酶活性呈现升高趋势，在萎凋4～10 h过程中，水分持续降低，但3种酶的活性变化不大，直到水分含量降至63.2%后，酶活性快速增加，故生产中可在萎凋前期加快水分散失速度，在缩短萎凋时间的同时实现酶活性的快速增加。萎凋14 h时，各种酶的活性均达到最大值，生产中可以根据酶活性变化情况指导萎凋适度的标准。毛火干燥对PPO和POD的失活作用较明显，分别降至萎凋叶的10%和28%左右。足火后，毛茶中的PPO、POD和β-葡萄糖苷酶活性仍有残余，分别为5%、8%及0.6%。因此，为了防止过度发酵，在发酵工艺过程中，也可根据3种酶的活性变化或其比值变化情况，来判别发酵适度的标准，并在干燥前期用适当高温最大限度地钝化酶活性。
3 结论
红茶加工过程中，随着萎凋时间的延长，PPO、POD和β-葡萄糖苷酶3种酶酶活性均呈现不同程度的增加，萎凋14 h后，PPO酶活性达到鲜叶的2.9倍，POD酶活性达到鲜叶的3.5倍，β-葡萄糖苷酶活性达到鲜叶的2.1倍，这可能与茶鲜叶内含成分降解为酸性物质以及水分的散失有关，如糖类物质降解成有机酸、酯型儿茶素降解生成没食子酸、原果胶生成果胶酸、叶绿素水解为叶绿酸等，从而使得萎凋叶逐步向酸性转化，pH逐步与酶的最适pH相适应；同时，随着萎凋叶的逐步失水，酶的相对浓度升高，进而导致酶活的增加。从本研究结果来看，β-葡萄糖苷酶对红茶香气的影响主要表现在萎凋过程及发酵早期。此外，在红茶发酵的前2.5 h内，PPO的活性降低速率较POD慢，PPO下降25%，POD下降到33%，说明在发酵前期，PPO起主导作用，主要以酶促合成茶黄素为主，而在发酵后期，POD起主导作用，主要以酶促合成茶红素、茶褐素为主。因此，可根据萎凋叶中3种酶的活性变化程度以及萎凋叶的失水情况，确定红茶加工中萎凋适度的标准，然后根据发酵过程中的POD与PPO的比值变化情况，确定发酵适度的标准。
4 讨论
综上所述，红茶加工过程中PPO、POD和β-葡萄糖苷酶3个酶的活性都是呈现低-高-低的变化趋势。萎凋过程中，随着萎凋时间的的延长，酶活性均出现不同程度的提高。早在20世纪50年代末期，Avouchable等就曾研究指出，红茶制造的萎凋过程中，PPO、POD、过氧化氢酶、脱氢酶等活性均有所增高。竹尾忠一认为鲜叶中的PPO活性在萎凋时逐渐增加，轻萎凋和重萎凋叶的PPO活性在揉捻时均快速增加，高达鲜叶的2～3倍，酶活性在揉捻后随同发酵过程而降低。阮宇成等研究了红碎茶制造中PPO活性及同工酶的变化，得到了类似的结果，并且，竹尾忠一还通过抑制剂试验发现，PPO在萎凋时活性增加是新的酶蛋白形成的结果。有人也对萎凋期间PPO各组分活性的变化进行了研究。而Perea和Willinghearted则未观察到萎凋阶段PPO活性的增加。Mullah等的试验结果表明，萎凋过程中PPO活性随着叶子失水而逐渐降低，当以适当方式补充水分后，酶活性又得以恢复。肖伟祥、叶庆生也得到了类似的研究结果，所以，究竟何种结果正确至今尚无定论。前人研究表明，红茶的香气主要产生于发酵过程，从本研究结果看，揉捻后β-葡萄糖苷酶活性的急剧下降，从萎凋后的32.42 0.1△OD/（g·min）降到揉捻后的26.38 0.1△OD/（g·min），显然会严重影响它在香气形成中的作用。从这里也可以看出，β-葡萄糖苷酶对红茶香气形成的作用主要表现在萎凋过程及发酵早期，而发酵中的香气大量产生则与多酚类的氧化作用有关，萎凋中酶活性的提高与叶组织内部酸化有关。由于糖类物质降解成有机酸，酯型儿茶素酯解生成没食子酸，原果胶生成果胶酸，叶绿素水解有叶绿酸的形成等，使萎凋叶逐步向酸性转化，pH从鲜叶的近乎中性降低到与三大酶酶的最适pH相适应，使酶的活性增加。此外，随叶子的逐步失水，酶及其作用物的相对浓度升高，结合态的酶部分可转化为游离态。萎凋中氧化酶活性的提高则为揉捻开始以后的发酵工序准备了良好的发酵条件。在揉捻过程中，茶叶组织损伤和细胞破损，膜透性增加，化学成分和酶得到混合，各种化学反应得以实现。在红茶发酵过程中，多酚类物质与酶接触引起酶活性的迅速下降，同时PPO和POD也催化儿茶素迅速氧化聚合成茶黄素、茶红素和高聚类物质。发酵后期由于酶活性降低、底物减少和产物积累，使发酵速度减慢。儿茶素氧化形成的中间产物酿类和茶黄素也对酶有较强的变性作用。所以茶黄素积累到一定量以后，反过来抑制了催化其合成的酶活性，而限制本身量的积累。与萎凋叶相比，在发酵期间PPO和POD活性持续下降，但PPO的活性降低较POD快，PPO活性由3.52 0.1△OD/（g·min）下降到1.30 0.1△OD/（g·min），下降63%，POD活性由12.87 0.1△OD/（g·min）]下降到7.68 0.1△OD/（g·min）]，下降40%。这主要是由于发酵叶中有机酸的增加，pH降至5.0以下，使PPO丧失了最适pH条件，而POD的活性因酸度适宜而下降缓慢，使得PPO与POD的活性比值下降，POD逐渐居于主导地位，并对茶多酚氧化产物的形成和积累产生一定的影响。高温能使酶产生不可逆热变性，但在较低温度下，温度如升高，反而会促进酶的催化。所以在红茶干燥时采用先毛火再足火的干燥方式。毛火干燥对PPO和POD的失活作用较明显，分别降至萎凋叶的10%和28%左右。足火干燥后，毛茶中的PPO、POD和β-葡萄糖苷酶活性仍有残余，分别为5%、8%及0.6%。这主要是高分子量、热稳定性强的PPO1、POD2和POD3，即在发酵过程中起主要作用的并在成茶中残余的均是那些热稳定性好，对多酚敏感性差的高分子酶蛋白组分。施和森认为，发酵中形成的挥发性物质经烘干后只剩下20%～25%。因此，如何在红茶干燥过程中的某一最佳时段采取某些适当措施既能使某些热化学、分解反应顺利进行以产生出更多芳香物，又能使前期发酵叶中的大部分芳香物，尤其是对决定其香气的香叶醇等几种主要芳香物，尽量保留下来具有重要的研究价值。 参考文献
[1] 萧伟祥.制茶发酵理论与制茶实践[J].福建茶叶，1987，3：2-6.
[2] Martinez M V， Whitaker J R. The biochemistry and control of enzymatic browning[J]. Trends in Food Science & Technology，1995，6（6）：195-200.
[3] Bokuchava M A.制荼工艺学与生物化学[M].杭州：中国农科院茶叶研究所情报资料研究室，1982：73-78.
[4] 竹尾忠一.红茶制造中多酚氧化酶活性变化研究[M].长沙：湖南农学院科技情报资料室，1973（3）：99-102.
[5] 竹尾忠一.抗生素对阶形成的影响[M].长沙：湖南农学院科技情报资料室，1973（3）：106-109.
[6] 阮宇成.红碎茶制造过程中多酚氧化醉活性及同工酶的变化[M].杭州：中国农科院茶叶研究所，1981：209-210.
[7] 刘莉华，宛晓春，文勇，等.祁门红茶加工过程中β-葡萄糖苷酶活性变化研究[J].安徽农业大学学报，2003，30（4）：386-389.
[8] 陈向东，藤尾雄策.日本根霉IF05318胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及部分特性[J].微生物学报，1997，37（5）：368-373.
[9] 王沁，赵学慧.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的纯化与性质[J].厦门大学学报：自然科学版，1992，31（6）：687-691.
[10] 宛晓春.水果风味及风味酶的研究[D].无锡：无锡轻工大学，1992.
[11] Takeo T. Production of linalool and geraniol by hydrolytic breakdown of bound forms in disrupted tea shoots[J].Fy-histochemistry，1981，120（9）：2145-2147.
[12] 李远华.β-葡萄糖苷酶的研究进展[J].安徽农业大学学报，2002，29（4）：421-425.
[13] 王伟伟，江和源，江用文，等.红茶萎凋处理温湿度条件对PPO，POD及茶多酚和色素的影响[J].食品工业科技，2013，34（13）：86-90.
[14] 王迎春，李春华，刘晓军，等.茶叶中β-葡萄糖苷酶研究进展[J].安徽农业科学，2008，36（10）：4151-4153.
[15] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 8304—2002，茶水分测定[S].北京：中国标准出版社，2002：230.