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摘要：
目的：研究不同剂量的双氢青蒿素联合顺铂对荷瘤大鼠的免疫抑制作用的影响。方法：1.将低分化上皮性卵巢癌细胞株NUTU-19注入F344大鼠的右腋皮下，建立人卵巢癌移植瘤的动物模型。2.将建模成功的40只F344大鼠分随机为5组，即顺铂对照组、空白对照组、顺铂+双氢青蒿素高剂量组、顺铂+双氢青蒿素中剂量组、顺铂+双氢青蒿素低剂量组。观察干预后各组移植瘤抑瘤率，取出瘤体，进行肿瘤形态学观察，显微镜下进行组织病理学检测。无菌取脾，测T/B淋巴细胞转化功能的测定，用ELISA方法检测大鼠血清IL-2及IFN-γ变化情况。结果：1.顺铂+双氢青蒿素各组抑瘤率与顺铂组相比升高显著，差异有统计学意义（P<0.001）。2.移植瘤组织病理学监测：瘤细胞的体积较大，胞质疏松，核深染，有不同程度的核固缩、核碎裂及核溶解，细胞中可见局灶性坏死。3.顺铂+双氢青蒿素高剂量组大鼠T/B淋巴细胞转化率、血清IL-2及IFN-γ明显高于顺铂组（P0.001）。结论：（1）DHA联合顺铂对荷瘤大鼠卵巢癌皮下移植瘤的生长有抑制作用，其联合作用功效强于单用顺铂，增强了顺铂的敏感性。（2）DHA联合顺铂对荷瘤大鼠机体免疫功能有增强作用，通过提高荷瘤大鼠脾淋巴细胞转化功能及血清IL-2和IFN-γ的水平，可能降低患者卵巢癌复发和淋巴结转移的风险。
关键词：双氢青蒿素；卵巢癌；大鼠；顺铂；淋巴细胞转化率；IL-2 IFN-γ
【中图分类号】
R711.75 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）05-0004-02
卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，因其早期诊断困难，且死亡率居妇科恶性肿瘤首位，成为直接威胁着妇女生命健康的疾病之一。虽然经典的卵巢癌细胞减灭术和化疗水平不断改进，但晚期卵巢癌五年存活率仍未明显升高。随着免疫生物学、分子生物学和肿瘤免疫学的深入研究，为肿瘤的免疫治疗提供了新的思路。本实验旨在研究青蒿素及其衍生物抗肿瘤作用，尝试将顺铂与其联合使用，探讨使用青蒿素后荷瘤大鼠免疫状态的改变，试图寻找青蒿素降低复发风险，改变其转归的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料：
低分化上皮性卵巢癌细胞株NUTU-19，购自上海桥杜商贸有限公司细胞中心；F344大鼠40只， 8-9周龄，雌性，体重140～150g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，饲养于山西医科大学寄生虫实验动物房。
1.2 实验方法
1.2.1 培养细胞操作过程 将卵巢癌细胞株NUTU-19，复苏后移至培养瓶中，加入培养基，放于培养箱中（37℃，5%CO2），在细胞的对数生长期进行计数。
1.2.2 动物模型建立 建立F344大鼠卵巢癌动物模型，共40只。调整卵巢癌细胞株NUTU-19细胞悬液浓度为4x107/ml，于每只大鼠右腋皮下注射0.2ml细胞悬液，观察移植瘤生长情况。
1.2.3 实验分组及给药方法
接种后第10天每只大鼠右腋长有约0.4*0.4cm肿瘤，将荷瘤大鼠随机分为5组，每组8只。各组大鼠同时治疗，如下：
（1）空白对照组：每只腹腔注射生理盐水2ml，隔天一次。
（2）顺铂组：每只腹腔注射顺铂3mg/kg，隔天一次。
（3）DHA高剂量+顺铂组：DHA400mg/kg +顺铂3mg/kg腹腔注射，隔天一次。
（4）DHA中剂量+顺铂组：DHA300mg/kg +顺铂3mg/kg腹腔注射，隔天一次。
（5）DHA低剂量+顺铂组：DHA200mg/kg +顺铂3mg/kg腹腔注射，隔天一次。
1.2.4 测定抑瘤率：给药5次后禁食，第二天乙醚麻醉处死大鼠，迅速摘取瘤体，称重并记录。抑瘤率（%）=（空白荷瘤组平均瘤重-各实验组平均瘤重）/空白荷瘤组平均瘤重×100%2.5脾淋巴细胞转化率的测定 乙醚麻醉处死大鼠，无菌取大鼠脾脏，剪碎、研磨，200目筛过滤，制备为单个细胞悬液，加入10ml的NH4Cl于37℃水浴10分钟裂解红细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，制成脾淋巴细胞悬液。用MTT法测定脾淋巴细胞转化率，用酶标仪在490nm波长处测定光密度（OD）值，以SI（刺激指數）值高低反映脾淋巴细胞转化率的高低，SI计算公式：SI=PHA刺激孔OD平均值/细胞对照孔OD平均值。
1.2.6 检测大鼠血清IL-2和IFN-γ的浓度 按照上述ELisa试剂盒说明书操作。
1.3 统计学方法： 统计数据X±s表示，所有实验数据均采用SPSSl3.5软件进行统计学分析，行单因素方差分析及组问比较最小显著差（1east significant difference，LSD）法。以=0.05为检验水准，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 顺铂+双氢青蒿素对大鼠肿瘤生长的作用：
顺铂+双氢青蒿素高剂量组、中剂量组和低计量组对卵巢肿瘤抑制率分别为30.26%、47.32%及62.13%，顺铂组抑瘤率28.14%，顺铂+双氢青蒿素各组、顺铂组与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.001）。顺铂+双氢青蒿素各组抑瘤率与顺铂组相比，高剂量双氢青蒿素组抑瘤率最高，差异有统计学意义（P<0.001）。
2.2 移植瘤组织病理学检测：
接种10天后，每只大鼠右侧腋下接种处均长出一瘤结节，大小约0.4*0.4cm。呈球形，质硬，活动尚可，表明皮肤血管丰富。各组干预后处死大鼠取瘤体制片，镜下观察：瘤细胞的体积较大，胞质疏松，核深染，有不同程度的核固缩、核碎裂及核溶解，细胞中可见局灶性坏死。
2.3 双氢青蒿素对大鼠的免疫功能的影响： 2.3.1 實验各组大鼠T/B淋巴细胞转化率的变化： 实验各组大鼠T/B淋巴细胞转化率见表1。同空白组比较，顺铂+双氢青蒿素高剂量组、中剂量组和低剂量组大鼠T/B淋巴细胞转化率均升高，差异有显著统计学意义（P<0.001）。顺铂+双氢青蒿素高剂量组大鼠T/B淋巴细胞转化率明显高于顺铂组，且有统计学差异（P<0.001）。如表-1。
3.2 各组大鼠血清IL-2及IFN-γ水平变化。同空白对照组相比，顺铂治疗组大鼠血清IL-2及IFN-γ水平均有所下降（P<0.001）。顺铂+青蒿素中剂量组和低剂量组血清IL-2及IFN-γ水平与顺铂组比较差异无统计学意义（P>0.05）；顺铂+青蒿素高剂量组与顺铂组比较有统计学意义（P<0.001）。如表-2、表-3。
3 讨论
卵巢癌是一种常见的恶性肿瘤，威胁妇女的生命健康，近年来虽然在治疗方面有了一定的进展，但是耐药性的出现，
肿瘤的短期复发、转移使得患者五年存活率仍旧没有明显改善，故寻找新的抗肿瘤治疗途径成为现今的研究热点。
3.1 双氢青蒿素抗肿瘤的作用：
在不断研制新药的同时，老药新用也是研究抗肿瘤药物的一个途径。1991年，我国学者邓有安等[1]首次报道了青蒿素衍生物能有选择性杀伤活白血病P388细胞。随后孙玮辰等[2]研究人员发现青蒿素能杀伤具有增生分裂能力的肿瘤干细胞。美国华盛顿大学的Lai研究员[3]及Singh副研究员[4]也先后研究发现，加入全转铁蛋白，DHA对培养的人白血病淋巴细胞的具有很强杀伤作用，而比对正常人淋巴细胞的不敏感。此后的研究发现，青蒿素对肝癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌等多种肿瘤均具有抗癌活性，且作用广泛。青蒿素还可以通过抑制肿瘤新生血管形成、与Fe2+作用的细胞毒作用、抑制端粒酶活性以及损伤细胞线粒体等多种作用机制而实现抗肿瘤作用[6-10]。经病理组织观察发现，青蒿素各干预组卵巢肿瘤细胞凋亡、坏死程度明显升高，从而发挥了其抑制肿瘤生长的作用，增加了顺铂化疗的敏感性。
2 双氢青蒿素对卵巢恶性肿瘤的免疫调节作用
2.1 双氢青蒿素对免疫细胞的影响：
免疫细胞包括淋巴细胞和辅助细胞两大类。研究表明DHA能抑制B淋巴细胞分裂增殖，促进CD4T细胞和CD8T细胞的分裂增殖；并且减少B细胞分泌抗体，减轻体液免疫反应，免疫复合物生成减少 [16]；青蒿素等通过活化Ts细胞，抑制体液免疫，Ts细胞增多会进一步降低抗体水平[12-15]。本实验中高剂量组青蒿素联合顺铂治疗卵巢癌荷瘤大鼠后其体内T/B淋巴细胞转化率明显上升，表明青蒿素可能通过增强T淋巴细胞的免疫反应从而增强其抑制肿瘤生长的作用。
2.2 双氢青蒿素对免疫因子的影响：
免疫细胞及其分泌的免疫因子在肿瘤的发病中发挥了重要的作用。活化淋巴细胞及巨噬细胞分泌的许多细胞因子，如TNF-γ等，因其能专一杀伤肿瘤细胞而无碍于正常细胞而日趋受到人们的重视。谭先杰等[17]的研究结论为DHA能制卵巢癌细胞的体外增殖，该作用可能与其下调癌细胞内ERK 1/2的磷酸化水平有关。董妍君等人[18-19]还进一步深入探讨了DHA治疗LA的免疫分子机理，主要是通过调节免疫活性物质产生起作用，包括IL-1、6，肿瘤坏死因子等免疫因子的表达。IL-2是新近发现的具有潜在抗肿瘤作用的免疫调节性因子，是由辅助性T细胞产生的，具有促进T细胞增殖，诱导Lak细胞促进B细胞分泌抗体，促进T细胞杀伤作用以及增强NK细胞活性等作用[20]。我们的实验结果中IL-2、IFN-γ在青蒿素高剂量联合顺铂组明显高于其他各组，根据结果推断青蒿素联合顺铂治疗卵巢癌不仅抑制了肿瘤的生长，而且通过改变机体免疫状态，增加细胞因子水平对，从而对其预后进行了改善，降低了患者复发和淋巴结转移的风险。该实验结果为我们今后卵巢癌提供了崭新的治疗途径，为肿瘤免疫治疗提供了理论基础。
参考文献
[1] 邓友安.有抗肿瘤活性的青蒿B衍生物[J].药学学报，1992，（4）：317-320
[2] 孙玮辰，韩家娴，杨蔚怡等.4种青蒿酸及青蒿B衍生物的体外抗癌作用[J].中国药理学报，1992，13（6）：541
[3] Singh NP；Lai H Selective toxicity of dihydmartemisinin and holotransforrin toward human breast cancer cell [外文期刊]2001（01）doi：10.1016/S0024-3205（01）01372-8
[4] LaiH；Li JR Oraladministration of ferroussulfate retarded implanted growth in the rat 1995（01）
[5] JiaoY，GOCM. Meng QH.Dihydroartemisinin is an inhibitor of ovarian cancer cell growth[J].Acts Pharmacol Sinica，2007，28：1045-1056.
[6] 林芳，钱之玉，薛红卫等.青蒿索和青蒿琥酯对人乳腺癌MCF27细胞的体外抑制作用比较研究[J].中草药，2003，34（4）：347-349
[7] Zhou HJ，WangZ，LiA.Dihydroartemisinin leukemia cells HL60 via downregulation of transferrin receptor expression [J]. Anticancer Drugs，2008，19（3）：247-255.
目的：研究不同剂量的双氢青蒿素联合顺铂对荷瘤大鼠的免疫抑制作用的影响。方法：1.将低分化上皮性卵巢癌细胞株NUTU-19注入F344大鼠的右腋皮下，建立人卵巢癌移植瘤的动物模型。2.将建模成功的40只F344大鼠分随机为5组，即顺铂对照组、空白对照组、顺铂+双氢青蒿素高剂量组、顺铂+双氢青蒿素中剂量组、顺铂+双氢青蒿素低剂量组。观察干预后各组移植瘤抑瘤率，取出瘤体，进行肿瘤形态学观察，显微镜下进行组织病理学检测。无菌取脾，测T/B淋巴细胞转化功能的测定，用ELISA方法检测大鼠血清IL-2及IFN-γ变化情况。结果：1.顺铂+双氢青蒿素各组抑瘤率与顺铂组相比升高显著，差异有统计学意义（P<0.001）。2.移植瘤组织病理学监测：瘤细胞的体积较大，胞质疏松，核深染，有不同程度的核固缩、核碎裂及核溶解，细胞中可见局灶性坏死。3.顺铂+双氢青蒿素高剂量组大鼠T/B淋巴细胞转化率、血清IL-2及IFN-γ明显高于顺铂组（P0.001）。结论：（1）DHA联合顺铂对荷瘤大鼠卵巢癌皮下移植瘤的生长有抑制作用，其联合作用功效强于单用顺铂，增强了顺铂的敏感性。（2）DHA联合顺铂对荷瘤大鼠机体免疫功能有增强作用，通过提高荷瘤大鼠脾淋巴细胞转化功能及血清IL-2和IFN-γ的水平，可能降低患者卵巢癌复发和淋巴结转移的风险。
关键词：双氢青蒿素；卵巢癌；大鼠；顺铂；淋巴细胞转化率；IL-2 IFN-γ
【中图分类号】
R711.75 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）05-0004-02
卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，因其早期诊断困难，且死亡率居妇科恶性肿瘤首位，成为直接威胁着妇女生命健康的疾病之一。虽然经典的卵巢癌细胞减灭术和化疗水平不断改进，但晚期卵巢癌五年存活率仍未明显升高。随着免疫生物学、分子生物学和肿瘤免疫学的深入研究，为肿瘤的免疫治疗提供了新的思路。本实验旨在研究青蒿素及其衍生物抗肿瘤作用，尝试将顺铂与其联合使用，探讨使用青蒿素后荷瘤大鼠免疫状态的改变，试图寻找青蒿素降低复发风险，改变其转归的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料：
低分化上皮性卵巢癌细胞株NUTU-19，购自上海桥杜商贸有限公司细胞中心；F344大鼠40只， 8-9周龄，雌性，体重140～150g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，饲养于山西医科大学寄生虫实验动物房。
1.2 实验方法
1.2.1 培养细胞操作过程 将卵巢癌细胞株NUTU-19，复苏后移至培养瓶中，加入培养基，放于培养箱中（37℃，5%CO2），在细胞的对数生长期进行计数。
1.2.2 动物模型建立 建立F344大鼠卵巢癌动物模型，共40只。调整卵巢癌细胞株NUTU-19细胞悬液浓度为4x107/ml，于每只大鼠右腋皮下注射0.2ml细胞悬液，观察移植瘤生长情况。
1.2.3 实验分组及给药方法
接种后第10天每只大鼠右腋长有约0.4*0.4cm肿瘤，将荷瘤大鼠随机分为5组，每组8只。各组大鼠同时治疗，如下：
（1）空白对照组：每只腹腔注射生理盐水2ml，隔天一次。
（2）顺铂组：每只腹腔注射顺铂3mg/kg，隔天一次。
（3）DHA高剂量+顺铂组：DHA400mg/kg +顺铂3mg/kg腹腔注射，隔天一次。
（4）DHA中剂量+顺铂组：DHA300mg/kg +顺铂3mg/kg腹腔注射，隔天一次。
（5）DHA低剂量+顺铂组：DHA200mg/kg +顺铂3mg/kg腹腔注射，隔天一次。
1.2.4 测定抑瘤率：给药5次后禁食，第二天乙醚麻醉处死大鼠，迅速摘取瘤体，称重并记录。抑瘤率（%）=（空白荷瘤组平均瘤重-各实验组平均瘤重）/空白荷瘤组平均瘤重×100%2.5脾淋巴细胞转化率的测定 乙醚麻醉处死大鼠，无菌取大鼠脾脏，剪碎、研磨，200目筛过滤，制备为单个细胞悬液，加入10ml的NH4Cl于37℃水浴10分钟裂解红细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，制成脾淋巴细胞悬液。用MTT法测定脾淋巴细胞转化率，用酶标仪在490nm波长处测定光密度（OD）值，以SI（刺激指數）值高低反映脾淋巴细胞转化率的高低，SI计算公式：SI=PHA刺激孔OD平均值/细胞对照孔OD平均值。
1.2.6 检测大鼠血清IL-2和IFN-γ的浓度 按照上述ELisa试剂盒说明书操作。
1.3 统计学方法： 统计数据X±s表示，所有实验数据均采用SPSSl3.5软件进行统计学分析，行单因素方差分析及组问比较最小显著差（1east significant difference，LSD）法。以=0.05为检验水准，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 顺铂+双氢青蒿素对大鼠肿瘤生长的作用：
顺铂+双氢青蒿素高剂量组、中剂量组和低计量组对卵巢肿瘤抑制率分别为30.26%、47.32%及62.13%，顺铂组抑瘤率28.14%，顺铂+双氢青蒿素各组、顺铂组与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.001）。顺铂+双氢青蒿素各组抑瘤率与顺铂组相比，高剂量双氢青蒿素组抑瘤率最高，差异有统计学意义（P<0.001）。
2.2 移植瘤组织病理学检测：
接种10天后，每只大鼠右侧腋下接种处均长出一瘤结节，大小约0.4*0.4cm。呈球形，质硬，活动尚可，表明皮肤血管丰富。各组干预后处死大鼠取瘤体制片，镜下观察：瘤细胞的体积较大，胞质疏松，核深染，有不同程度的核固缩、核碎裂及核溶解，细胞中可见局灶性坏死。
2.3 双氢青蒿素对大鼠的免疫功能的影响： 2.3.1 實验各组大鼠T/B淋巴细胞转化率的变化： 实验各组大鼠T/B淋巴细胞转化率见表1。同空白组比较，顺铂+双氢青蒿素高剂量组、中剂量组和低剂量组大鼠T/B淋巴细胞转化率均升高，差异有显著统计学意义（P<0.001）。顺铂+双氢青蒿素高剂量组大鼠T/B淋巴细胞转化率明显高于顺铂组，且有统计学差异（P<0.001）。如表-1。
3.2 各组大鼠血清IL-2及IFN-γ水平变化。同空白对照组相比，顺铂治疗组大鼠血清IL-2及IFN-γ水平均有所下降（P<0.001）。顺铂+青蒿素中剂量组和低剂量组血清IL-2及IFN-γ水平与顺铂组比较差异无统计学意义（P>0.05）；顺铂+青蒿素高剂量组与顺铂组比较有统计学意义（P<0.001）。如表-2、表-3。
3 讨论
卵巢癌是一种常见的恶性肿瘤，威胁妇女的生命健康，近年来虽然在治疗方面有了一定的进展，但是耐药性的出现，
肿瘤的短期复发、转移使得患者五年存活率仍旧没有明显改善，故寻找新的抗肿瘤治疗途径成为现今的研究热点。
3.1 双氢青蒿素抗肿瘤的作用：
在不断研制新药的同时，老药新用也是研究抗肿瘤药物的一个途径。1991年，我国学者邓有安等[1]首次报道了青蒿素衍生物能有选择性杀伤活白血病P388细胞。随后孙玮辰等[2]研究人员发现青蒿素能杀伤具有增生分裂能力的肿瘤干细胞。美国华盛顿大学的Lai研究员[3]及Singh副研究员[4]也先后研究发现，加入全转铁蛋白，DHA对培养的人白血病淋巴细胞的具有很强杀伤作用，而比对正常人淋巴细胞的不敏感。此后的研究发现，青蒿素对肝癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌等多种肿瘤均具有抗癌活性，且作用广泛。青蒿素还可以通过抑制肿瘤新生血管形成、与Fe2+作用的细胞毒作用、抑制端粒酶活性以及损伤细胞线粒体等多种作用机制而实现抗肿瘤作用[6-10]。经病理组织观察发现，青蒿素各干预组卵巢肿瘤细胞凋亡、坏死程度明显升高，从而发挥了其抑制肿瘤生长的作用，增加了顺铂化疗的敏感性。
2 双氢青蒿素对卵巢恶性肿瘤的免疫调节作用
2.1 双氢青蒿素对免疫细胞的影响：
免疫细胞包括淋巴细胞和辅助细胞两大类。研究表明DHA能抑制B淋巴细胞分裂增殖，促进CD4T细胞和CD8T细胞的分裂增殖；并且减少B细胞分泌抗体，减轻体液免疫反应，免疫复合物生成减少 [16]；青蒿素等通过活化Ts细胞，抑制体液免疫，Ts细胞增多会进一步降低抗体水平[12-15]。本实验中高剂量组青蒿素联合顺铂治疗卵巢癌荷瘤大鼠后其体内T/B淋巴细胞转化率明显上升，表明青蒿素可能通过增强T淋巴细胞的免疫反应从而增强其抑制肿瘤生长的作用。
2.2 双氢青蒿素对免疫因子的影响：
免疫细胞及其分泌的免疫因子在肿瘤的发病中发挥了重要的作用。活化淋巴细胞及巨噬细胞分泌的许多细胞因子，如TNF-γ等，因其能专一杀伤肿瘤细胞而无碍于正常细胞而日趋受到人们的重视。谭先杰等[17]的研究结论为DHA能制卵巢癌细胞的体外增殖，该作用可能与其下调癌细胞内ERK 1/2的磷酸化水平有关。董妍君等人[18-19]还进一步深入探讨了DHA治疗LA的免疫分子机理，主要是通过调节免疫活性物质产生起作用，包括IL-1、6，肿瘤坏死因子等免疫因子的表达。IL-2是新近发现的具有潜在抗肿瘤作用的免疫调节性因子，是由辅助性T细胞产生的，具有促进T细胞增殖，诱导Lak细胞促进B细胞分泌抗体，促进T细胞杀伤作用以及增强NK细胞活性等作用[20]。我们的实验结果中IL-2、IFN-γ在青蒿素高剂量联合顺铂组明显高于其他各组，根据结果推断青蒿素联合顺铂治疗卵巢癌不仅抑制了肿瘤的生长，而且通过改变机体免疫状态，增加细胞因子水平对，从而对其预后进行了改善，降低了患者复发和淋巴结转移的风险。该实验结果为我们今后卵巢癌提供了崭新的治疗途径，为肿瘤免疫治疗提供了理论基础。
参考文献
[1] 邓友安.有抗肿瘤活性的青蒿B衍生物[J].药学学报，1992，（4）：317-320
[2] 孙玮辰，韩家娴，杨蔚怡等.4种青蒿酸及青蒿B衍生物的体外抗癌作用[J].中国药理学报，1992，13（6）：541
[3] Singh NP；Lai H Selective toxicity of dihydmartemisinin and holotransforrin toward human breast cancer cell [外文期刊]2001（01）doi：10.1016/S0024-3205（01）01372-8
[4] LaiH；Li JR Oraladministration of ferroussulfate retarded implanted growth in the rat 1995（01）
[5] JiaoY，GOCM. Meng QH.Dihydroartemisinin is an inhibitor of ovarian cancer cell growth[J].Acts Pharmacol Sinica，2007，28：1045-1056.
[6] 林芳，钱之玉，薛红卫等.青蒿索和青蒿琥酯对人乳腺癌MCF27细胞的体外抑制作用比较研究[J].中草药，2003，34（4）：347-349
[7] Zhou HJ，WangZ，LiA.Dihydroartemisinin leukemia cells HL60 via downregulation of transferrin receptor expression [J]. Anticancer Drugs，2008，19（3）：247-255.