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摘 要：本研究对在黑龙江省科学合理地使用甲霜灵这类苯基酰胺类杀菌剂防治马铃薯晚疫病，对当地晚疫病的防治药剂轮换，防治策略的制定等具有重要的指导意义。
关键词：马铃薯；晚疫病菌；甲霜灵；敏感性
马铃薯晚疫病是当前黑龙江省危害马铃薯生产较为严重的病害之一，一般造成减产20 %～50 %，严重达50 %以上，甚至绝产。进入2000年以来，黑龙江省晚疫病呈现出逐年加重的趋势，而且发生地时间大幅度提前，经济损失更加严重。晚疫病的发生和流行，已经严重地阻碍了黑龙江省马铃薯生产发展和实现产业化的进程。目前生产上对晚疫病的防治主要有培育抗病品种和药剂防治两种方法。以甲霜灵为代表的苯基酰胺类杀菌剂是防治晚疫病的有效药剂之一，1977年在生产上推广应用，该类药剂对马铃薯晚疫病有很好防效，具有保护兼治疗的作用，但在推广3年之后就出现了抗药菌株，Davidse等和Dowley等首先报道在荷兰和爱尔兰分别出现了抗甲霜灵的菌株，随后在欧洲、中东、亚洲、墨西哥、加拿大和美国等地相继出现抗性菌株，当前世界各国凡是使用以甲霜灵为代表的苯基酰胺类杀菌剂的地区，都不同程度地出现了晚疫病菌的抗药性问题。在国内李炜等最先报道了1994年采自河北、黑龙江、内蒙、甘肃等地的马铃薯晚疫病菌对甲霜灵的抗性情况，随后朱杰华、杨志辉等、袁善奎等、金光辉先后进行了我国及黑龙江省马铃薯晚疫病菌甲霜灵类药剂敏感性的研究，所有研究结果均表明在我国黑龙江省不仅普遍存在对甲霜灵具有抗药性的晚疫病菌株，而且抗药菌株的出现频率很高。
晚疫病菌对甲霜灵药剂的敏感性是研究晚疫病菌表型结构的重要内容。在前人研究的基础上继续进行黑龙江省马铃薯晚疫病菌对甲霜灵药剂敏感性的监测研究，这对在黑龙江省科学、合理、有效的使用甲霜灵药剂防治马铃薯晚疫病，以及化学药剂防治策略的制定，具有重要的指导意义。
1 材料与方法
1.1晚疫病菌标本的分离和纯化
1.1.1病样的采集 2012年7～9月份晚疫病发生和流行的时候，在黑龙江省加格达奇市、海伦市、哈尔滨市和牡丹江市未施用过甲霜灵的马铃薯田块中采集晚疫病病叶，采集病样时用消毒小刀在健康的马铃薯块茎上切一小口，然后在田间将病叶的单个病斑剪下并夹入薯块中，最后用吸水纸和线绳包扎好后放入保鲜袋中带回实验室。采集的寄主品种有东农303、早大白、鲁引1号、大西洋、克新13号、龙引薯1号、春薯4号共7个寄主品种。
1.1.2病菌的分离纯化保存 将病叶用自来水冲洗干净，取其病健交界处的部分，剪成小块儿，放在薯片上，每一薯片上放一小块病叶。把接有病叶的薯片放在培养皿中保湿培养。在18℃培养箱中黑暗保湿培养。3～5 d后，待薯片上长出白色的菌丝，即可把薯片上的菌丝转入纯化培养基上。把纯化好的晚疫病菌从纯化培养基上转入试管中，放入18 ℃黑麦培养基中，黑暗培养至菌丝铺满试管培养基斜面后，转入14 ℃低温黑暗保存，备用。
黑麦培养基制作方法：黑麦60 g浸泡在800 mL蒸馏水中36 h，之后用粉碎机粉碎，过滤获得的滤液中加蒸馏水定容至1000 mL，再加入琼脂16 g，蔗糖15 g，121 ℃灭菌30 min，在无菌条件下倒入平板或试管中备用。
1.2晚疫病菌对甲霜灵药剂的敏感性测定
1.2.1供试药剂 98 %甲霜灵原药由中华人民共和国农业部农药检定所袁善奎博士提供。以甲醇为溶剂，将原药配制成浓度为5000 μg·mL-1母液，于4 ℃冰箱中保存备用。
1.2.2晚疫病菌对甲霜灵的敏感性测定 参照Shattock的方法，用打孔器在培养好的病菌菌落中随机取直径为5 mm的菌饼，分别接种到含甲霜灵10 μg·mL-1及无药的黑麦培养基平板上，每个处理重复3次，18 ℃下黑暗培养，7 d后测定菌落直径（mm），并计算各菌株的相对生长量。
各菌株对甲霜灵的敏感性划分标准为：PG≤10 %为敏感菌株；10 % 2 结果与分析
2.1黑龙江省马铃薯晚疫病菌对甲霜灵药剂的敏感性
表1 黑龙江省马铃薯晚疫病菌对甲霜灵药剂的敏感性测定结果
从黑龙江省4个地区（牡丹江，加格达奇，哈尔滨，海伦）共分离获得44株晚疫病菌，其中来自牡丹江和海伦市有12个菌株，哈尔滨9个菌株，加格达奇11个菌株，这44个菌株中敏感菌株有20个，出现的频率为45.45 %；中抗菌株有2个，出现频率为4.54 %，高抗菌株为22个，出现的频率为50 %（表2）。从总体来看，黑龙江省的马铃薯晚疫病菌中对甲霜灵药剂具有抗药性菌株的出现频率高于敏感菌株。而且该地区的马铃薯晚疫病菌的群体结构中，高抗菌株不仅占优势，而且抗性程度很高。
表2 黑龙江省马铃薯晚疫病菌对甲霜灵药剂的敏感性情况
2.2黑龙江省不同地区晚疫病菌对甲霜灵药剂的敏感性
无论是马铃薯主产区还是非主产区，都存在着对甲霜灵产生抗药性的菌株。但是不同地区对甲霜灵产生的抗药性的菌株出现的频率不同。各地区的菌株数及其对甲霜灵药剂的敏感性的测定情况见表3，从表中可以看出，各地区之间抗药菌株的频率存在着较大的差异，除了加格达奇地区之外，其他三个地区都存在着抗甲霜灵药剂的晚疫病菌，其中牡丹江抗药菌株为12株，哈尔滨地区抗药菌株为9株，两地区的抗药菌株达到了100 %，而海伦地区抗药菌株为3株，海伦的抗药菌株占被测菌株的16.6 %，加格达奇没有出现抗药菌株，11株菌株全为敏感菌株。
表3 黑龙江省不同地区晚疫病菌对甲霜灵药剂敏感性的测定
3 讨论
3.1黑龙江省马铃薯晚疫病菌对甲霜灵药剂敏感性年度间的动态变化。黑龙江省自1988年开始在生产中大面积使用甲霜灵药剂来防治马铃薯晚疫病，在国内相对于其它省区，对黑龙江省马铃薯晚疫病菌敏感性的研究报道较早，李炜等[4]利用薯盘测定法对采自1994年黑龙江省克山县的8个马铃薯晚疫病菌株进行了甲霜灵药剂的敏感性测定，抗药菌株的频率为87.5 %。朱杰华采自2001～2002年黑龙江省的哈尔滨、克山、望奎和大兴安岭31个菌株进行了甲霜灵药剂的敏感性研究，结果31个菌株均为高抗，抗性频率为100 %。杨志辉等利用菌落直径法对1998～2003年采自黑龙江省23个马铃薯晚疫病菌菌株对甲霜灵的抗性测定，结果被检测的所有菌株均为高抗菌株，其抗性频率为100 %。袁善奎等对采自黑龙江省2003年的29个菌株和2004年的69个菌株进行了甲霜灵敏感性检测，结果表明，抗性菌株的频率分别达到86.2 %和82.6 %。金光辉对2004～2006年来自黑龙江省10个县市的70个马铃薯晚疫病菌进行了甲霜灵药剂敏感性测定，结果具有抗药性的菌株有52个，占菌株总数的74.29 %。其中2004年测试的菌株中抗药菌株的频率为81.82 %；2005年抗药菌株的频率为70.00 %；2006年抗药菌株的频率为73.46 %。本实验的抗药菌株出现频率为50 %。从近些年来年度间抗药菌株的频率变化情况来看，在黑龙江省对甲霜灵药剂具有抗药性菌株的出现频率整体上呈现下降的趋势。
3.2黑龙江省不同地区晚疫病菌对甲霜灵药剂敏感性的差异。本研究表明，黑龙江省对甲霜灵药剂具有抗药性的菌株出现频率自北向南呈逐步增加的趋势，加格达奇的菌株均为敏感型，海伦市的抗药菌株下降到了25 %以下，这与以前的研究结果明显不同，可能是当地改用其它种类的杀菌剂有关，有待于进一步的深入研究。根据本试验结果可知，在加格达奇和海伦市可以继续使用甲霜灵类药剂进行晚疫病的防治。另外，在牡丹江和哈尔滨市的晚疫病菌均为高抗菌株，今后在这两个地区不能使用甲霜灵类药剂防治晚疫病，需要改用其它类型杀菌剂。
4 结论
4.12012年来自黑龙江省的四个地区的44个晚疫病菌株中，敏感菌株有20个，出现的频率为45.45 %；中抗菌株有2个，出现频率为4.54 %，高抗菌株为22个，出现的频率为50 %，黑龙江省马铃薯晚疫病菌中对甲霜灵药剂具有抗药性的菌株占很大比重。
4.2区域间抗药菌株的出现频率具有很大差异，其中牡丹江、哈尔滨地区抗药菌株达到了100 %，海伦的抗药菌株为16.6 %，加格达奇没有出现抗药菌株。
关键词：马铃薯；晚疫病菌；甲霜灵；敏感性
马铃薯晚疫病是当前黑龙江省危害马铃薯生产较为严重的病害之一，一般造成减产20 %～50 %，严重达50 %以上，甚至绝产。进入2000年以来，黑龙江省晚疫病呈现出逐年加重的趋势，而且发生地时间大幅度提前，经济损失更加严重。晚疫病的发生和流行，已经严重地阻碍了黑龙江省马铃薯生产发展和实现产业化的进程。目前生产上对晚疫病的防治主要有培育抗病品种和药剂防治两种方法。以甲霜灵为代表的苯基酰胺类杀菌剂是防治晚疫病的有效药剂之一，1977年在生产上推广应用，该类药剂对马铃薯晚疫病有很好防效，具有保护兼治疗的作用，但在推广3年之后就出现了抗药菌株，Davidse等和Dowley等首先报道在荷兰和爱尔兰分别出现了抗甲霜灵的菌株，随后在欧洲、中东、亚洲、墨西哥、加拿大和美国等地相继出现抗性菌株，当前世界各国凡是使用以甲霜灵为代表的苯基酰胺类杀菌剂的地区，都不同程度地出现了晚疫病菌的抗药性问题。在国内李炜等最先报道了1994年采自河北、黑龙江、内蒙、甘肃等地的马铃薯晚疫病菌对甲霜灵的抗性情况，随后朱杰华、杨志辉等、袁善奎等、金光辉先后进行了我国及黑龙江省马铃薯晚疫病菌甲霜灵类药剂敏感性的研究，所有研究结果均表明在我国黑龙江省不仅普遍存在对甲霜灵具有抗药性的晚疫病菌株，而且抗药菌株的出现频率很高。
晚疫病菌对甲霜灵药剂的敏感性是研究晚疫病菌表型结构的重要内容。在前人研究的基础上继续进行黑龙江省马铃薯晚疫病菌对甲霜灵药剂敏感性的监测研究，这对在黑龙江省科学、合理、有效的使用甲霜灵药剂防治马铃薯晚疫病，以及化学药剂防治策略的制定，具有重要的指导意义。
1 材料与方法
1.1晚疫病菌标本的分离和纯化
1.1.1病样的采集 2012年7～9月份晚疫病发生和流行的时候，在黑龙江省加格达奇市、海伦市、哈尔滨市和牡丹江市未施用过甲霜灵的马铃薯田块中采集晚疫病病叶，采集病样时用消毒小刀在健康的马铃薯块茎上切一小口，然后在田间将病叶的单个病斑剪下并夹入薯块中，最后用吸水纸和线绳包扎好后放入保鲜袋中带回实验室。采集的寄主品种有东农303、早大白、鲁引1号、大西洋、克新13号、龙引薯1号、春薯4号共7个寄主品种。
1.1.2病菌的分离纯化保存 将病叶用自来水冲洗干净，取其病健交界处的部分，剪成小块儿，放在薯片上，每一薯片上放一小块病叶。把接有病叶的薯片放在培养皿中保湿培养。在18℃培养箱中黑暗保湿培养。3～5 d后，待薯片上长出白色的菌丝，即可把薯片上的菌丝转入纯化培养基上。把纯化好的晚疫病菌从纯化培养基上转入试管中，放入18 ℃黑麦培养基中，黑暗培养至菌丝铺满试管培养基斜面后，转入14 ℃低温黑暗保存，备用。
黑麦培养基制作方法：黑麦60 g浸泡在800 mL蒸馏水中36 h，之后用粉碎机粉碎，过滤获得的滤液中加蒸馏水定容至1000 mL，再加入琼脂16 g，蔗糖15 g，121 ℃灭菌30 min，在无菌条件下倒入平板或试管中备用。
1.2晚疫病菌对甲霜灵药剂的敏感性测定
1.2.1供试药剂 98 %甲霜灵原药由中华人民共和国农业部农药检定所袁善奎博士提供。以甲醇为溶剂，将原药配制成浓度为5000 μg·mL-1母液，于4 ℃冰箱中保存备用。
1.2.2晚疫病菌对甲霜灵的敏感性测定 参照Shattock的方法，用打孔器在培养好的病菌菌落中随机取直径为5 mm的菌饼，分别接种到含甲霜灵10 μg·mL-1及无药的黑麦培养基平板上，每个处理重复3次，18 ℃下黑暗培养，7 d后测定菌落直径（mm），并计算各菌株的相对生长量。
各菌株对甲霜灵的敏感性划分标准为：PG≤10 %为敏感菌株；10 %
2.1黑龙江省马铃薯晚疫病菌对甲霜灵药剂的敏感性
表1 黑龙江省马铃薯晚疫病菌对甲霜灵药剂的敏感性测定结果
从黑龙江省4个地区（牡丹江，加格达奇，哈尔滨，海伦）共分离获得44株晚疫病菌，其中来自牡丹江和海伦市有12个菌株，哈尔滨9个菌株，加格达奇11个菌株，这44个菌株中敏感菌株有20个，出现的频率为45.45 %；中抗菌株有2个，出现频率为4.54 %，高抗菌株为22个，出现的频率为50 %（表2）。从总体来看，黑龙江省的马铃薯晚疫病菌中对甲霜灵药剂具有抗药性菌株的出现频率高于敏感菌株。而且该地区的马铃薯晚疫病菌的群体结构中，高抗菌株不仅占优势，而且抗性程度很高。
表2 黑龙江省马铃薯晚疫病菌对甲霜灵药剂的敏感性情况
2.2黑龙江省不同地区晚疫病菌对甲霜灵药剂的敏感性
无论是马铃薯主产区还是非主产区，都存在着对甲霜灵产生抗药性的菌株。但是不同地区对甲霜灵产生的抗药性的菌株出现的频率不同。各地区的菌株数及其对甲霜灵药剂的敏感性的测定情况见表3，从表中可以看出，各地区之间抗药菌株的频率存在着较大的差异，除了加格达奇地区之外，其他三个地区都存在着抗甲霜灵药剂的晚疫病菌，其中牡丹江抗药菌株为12株，哈尔滨地区抗药菌株为9株，两地区的抗药菌株达到了100 %，而海伦地区抗药菌株为3株，海伦的抗药菌株占被测菌株的16.6 %，加格达奇没有出现抗药菌株，11株菌株全为敏感菌株。
表3 黑龙江省不同地区晚疫病菌对甲霜灵药剂敏感性的测定
3 讨论
3.1黑龙江省马铃薯晚疫病菌对甲霜灵药剂敏感性年度间的动态变化。黑龙江省自1988年开始在生产中大面积使用甲霜灵药剂来防治马铃薯晚疫病，在国内相对于其它省区，对黑龙江省马铃薯晚疫病菌敏感性的研究报道较早，李炜等[4]利用薯盘测定法对采自1994年黑龙江省克山县的8个马铃薯晚疫病菌株进行了甲霜灵药剂的敏感性测定，抗药菌株的频率为87.5 %。朱杰华采自2001～2002年黑龙江省的哈尔滨、克山、望奎和大兴安岭31个菌株进行了甲霜灵药剂的敏感性研究，结果31个菌株均为高抗，抗性频率为100 %。杨志辉等利用菌落直径法对1998～2003年采自黑龙江省23个马铃薯晚疫病菌菌株对甲霜灵的抗性测定，结果被检测的所有菌株均为高抗菌株，其抗性频率为100 %。袁善奎等对采自黑龙江省2003年的29个菌株和2004年的69个菌株进行了甲霜灵敏感性检测，结果表明，抗性菌株的频率分别达到86.2 %和82.6 %。金光辉对2004～2006年来自黑龙江省10个县市的70个马铃薯晚疫病菌进行了甲霜灵药剂敏感性测定，结果具有抗药性的菌株有52个，占菌株总数的74.29 %。其中2004年测试的菌株中抗药菌株的频率为81.82 %；2005年抗药菌株的频率为70.00 %；2006年抗药菌株的频率为73.46 %。本实验的抗药菌株出现频率为50 %。从近些年来年度间抗药菌株的频率变化情况来看，在黑龙江省对甲霜灵药剂具有抗药性菌株的出现频率整体上呈现下降的趋势。
3.2黑龙江省不同地区晚疫病菌对甲霜灵药剂敏感性的差异。本研究表明，黑龙江省对甲霜灵药剂具有抗药性的菌株出现频率自北向南呈逐步增加的趋势，加格达奇的菌株均为敏感型，海伦市的抗药菌株下降到了25 %以下，这与以前的研究结果明显不同，可能是当地改用其它种类的杀菌剂有关，有待于进一步的深入研究。根据本试验结果可知，在加格达奇和海伦市可以继续使用甲霜灵类药剂进行晚疫病的防治。另外，在牡丹江和哈尔滨市的晚疫病菌均为高抗菌株，今后在这两个地区不能使用甲霜灵类药剂防治晚疫病，需要改用其它类型杀菌剂。
4 结论
4.12012年来自黑龙江省的四个地区的44个晚疫病菌株中，敏感菌株有20个，出现的频率为45.45 %；中抗菌株有2个，出现频率为4.54 %，高抗菌株为22个，出现的频率为50 %，黑龙江省马铃薯晚疫病菌中对甲霜灵药剂具有抗药性的菌株占很大比重。
4.2区域间抗药菌株的出现频率具有很大差异，其中牡丹江、哈尔滨地区抗药菌株达到了100 %，海伦的抗药菌株为16.6 %，加格达奇没有出现抗药菌株。