白癜风是一种临床常见的色素障碍性毁容性皮肤病,其病理特点是黑色素细胞功能缺陷或死亡导致的黑色素生成缺失,临床表现以局限性或泛发性色素脱失斑为特征。白癜风顽固难治,严重影响患者皮肤外观美容,给患者造成极大的精神心理痛苦。白癜风的病因和发病机制非常复杂,至今仍未完全清楚。遗传因素、神经因素、氧化应激、自身免疫、机械应力等因素均可能涉及该病的发病机理。探寻白癜风的确切发病原因和机制,寻找新的药物治疗靶点,为该病的早期诊断和有效治疗提供新线索是我们面临的紧迫任务。miRNAs通过抑制转录或降解靶mRNAs作用在各种细胞过程如细胞生长、分化、细胞凋亡、免疫反应中发挥必不可少的调控因子作用。在自身免疫性疾病中,基于miRNAs调控基因的表达起着至关重要的作用。目前miRNAs被认为是许多疾病很有前途的生物标志物和新的药物治疗靶标。然而人们对白癜风发病机理中miRNA的功能了解甚少。因此本研究中我们首先检测了白癜风患者和正常对照人群血清中miRNAs的表达谱,通过高通量测序和基因芯片杂交技术相结合,筛选白癜风患者血清中差异表达的miRNAs。使用三个不同的数据库TargetScan,PITA和microRNA.org预测miRNAs潜在的靶基因和评估差异表达miRNAs的不同的生物学功能。然后通过非监督层次聚类分析、GO富集分析和KEGG分析,推测差异表达miRNAs的功能和可能参与的信号通路,然后通过qRT-PCR对微阵列数据进行验证。使用慢病毒介导基因重组技术过表达和沉默正常人黑素细胞PIG1中差异显著的miRNA-202-3p,然后利用MTT、流式细胞术、多巴氧化法、黏附实验等方法研究差异表达的miRNA-202-3p对人黑素细胞PIG1生物学功能的影响。最后使用qRT-PCR、双荧光素酶报告基因和蛋白印迹法研究和探讨miRNA-202-3p对黑素细胞PIG1细胞生物学影响的分子机制。本课题目的在于筛选出白癜风患者血清中差异miRNAs的表达谱,利用生物信息学分析预测差异miRNAs的功能分布,然后通过建立体外细胞模型研究差异表达的miRNAs(miRNA-202-3p)对黑素细胞生物学功能的影响,并探究其在发挥作用的分子机理。本研究试图探求miRNAs在白癜风发病中的作用,进一步在基因层面深入对白癜风发病机制的了解,为该病的早期诊断提供新的可能的分子标志物,同时也为治疗白癜风的新药开发提供可能的分子靶点。本课题包括以下三部分:第一部分:白癜风患者外周血miRNAs的表达及靶基因预测和功能分析方法1.使用miRNeasy Mini Kit提取白癜风患者血清中的miRNA,然后利用NanoDrop ND-2000定量总RNA,并经Agilent Bioanalyzer 2100检测RNA完整性。2.通过高通量测序和芯片杂交技术检测白癜风患者血清中的miRNAs,然后使用Feature Extraction软件处理原始图像提取原始数据,接着利用Genespring软件进行quantile标准化和后续处理,利用T检验的P值和倍数变化值进行差异miRNAs筛选。3.分别用TargetScan,PITA,microRNAorg数据库对差异miRNA进行靶基因预测,取共同的miRNAs进行后续的非监督层次聚类分析、GO富集分析和KEGG通路分析。4.使用Cytoscap软件绘制差异表达miRNAs靶基因调控网络图。5.使用qRT-PCR法验证白癜风皮损组织和正常皮肤组织中差异miRNAs的表达。6.Fontana-Masson银染法检测白癜风皮损组织和正常皮肤组织中黑素合成情况。7.免疫组化法检测Hippo信号通路中关键分子YAP1在白癜风皮损组织组中的表达。结果1.所有样品的2100 RIN值≥7.0,并且28s/18s≥0.7,结果表明实验所提取的样品合格,完整性好,没有发生降解。2.与对照相比,白癜风患者血清差异表达miRNAs共34个,其中显著上调表达有2个,显著下调有32个。3.差异miRNAs中,共有863个靶基因共同存在TargetScan,PITA,microRNAorg数据库中,差异表达miRNAs的生物功能主要集中于轴突导向、细胞黏附和细胞连接等相关的信号通路中,其中miRNA-202-3p上调最为显著并参与了Hippo信号通路。4.miRNA调控靶基因互作网络图显示hsa-miR-202-3p和hsa-miR-630调控共同靶基因数量最多包括YAP1,CCNJ,GNG2,CPEB4,TFAP2B,B4GALT4和FBXO30。5.与对照组相比,白癜风皮损组织中miRNA-202-3p表达显著上调,与高通量测序结果一致。6.Fontana-Masson银染法检测白癜风皮损组织和正常皮肤组织中黑素合成情况,结果显示白癜风皮损组织的表皮黑色素完全脱失。7.在正常皮肤组织中,YAP1呈现高表达,而在白癜风皮损组织中,YAP1呈现弱表达,两组相比有显著性差异。第二部分:过表达或沉默miR-202-3p对黑素细胞生物学功能的影响方法1.miRNA-202-3p过表达慢病毒载体构建:将pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro载体和以HEK293细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增的miRNA-202-3p用EcoR1和NotI进行双酶切,连接miRNA-202和过表达载体,构建miRNA-202-3p过表达慢病毒载体质粒Lenti-miR-202-3p,并进行转化和菌落PCR鉴定,送上海生工生物工程有限公司进行基因测序。2.miRNA-202-3p干扰慢病毒载体构建:设计和合成miR-202-3p干扰序列,将退火片段连接入pLenti-hU6-GFP-Puro慢病毒载体中,构建miRNA-202-3p干扰慢病毒载体质粒pLenti-si-miRNA-202-3p重组质粒,并进行转化和菌落PCR鉴定,送上海生工生物工程有限公司进行基因测序。3.慢病毒颗粒包装:将慢病毒表达载体质粒、pCMV-Δ8.2和pCMV-VSV-G质粒共转染至293T细胞中,48 h后进行荧光观察,72 h后收获携带目的基因的病毒,然后使用高速离心法纯化和浓缩慢病毒颗粒。4.目的慢病毒颗粒对人黑素细胞PIG1细胞感染效率的检测:通过荧光显微镜观察慢病毒感染PIG1细胞48 h后GFP表达和qRT-PCR法检测细胞中miRNA-202-3p的表达。5.MTT法和流式细胞术分别检测miR-202-3p对人黑素细胞株PIG1细胞增殖和凋亡的影响。6.多巴氧化反应法和氢氧化钠裂解法分别检测人黑素细胞株PIG1细胞酪氨酸酶活性和细胞内黑素含量。7.使用纤维连接蛋白包被的培养板测定黑素细胞黏附率变化情况。结果1.pLenti-miRNA-202-3p和pLenti-si-miRNA-202-3p慢病毒表达载体菌落PCR和基因测序结果显示,其分子大小及序列与NCBI中的参考序列一致,结果表明miRNA-202-3p过表达和干扰慢病毒载体质粒pLenti-miRNA-202-3p和pLenti-si-miRNA-202-3p构建成功。2.荧光观察发现,慢病毒载体质粒、pCMV-Δ8.2和pCMV-VSV-G质粒共转染至293T细胞的效率达到90%以上,可用于下一步实验。3.观察和测定PIG1细胞的感染效率,结果发现慢病毒感染目的细胞的效率达90%以上,qRT-PCR检测结果显示,pLent-miR-202-3p细胞中miR-202-3p表达显著增加,而pLent-si-miR-202-3p细胞中miR-202-3p表达显著减少,可以进行后续的实验。4.MTT实验结果显示与对照组相比,miR-202-3p过表达显著抑制黑素细胞的生长,而降低miR-202-3p表达对人黑素细胞的增殖能力无显著影响,流式细胞术检测结果发现与对照组相比,miR-202-3p表达上调后细胞早期凋亡比例明显上升,而miR-202-3p表达下调对细胞凋亡无明显影响。5.过表达miR-202-3p能够显著抑制细胞内酪氨酸酶活性和黑素合成,miR-202-3p表达下调显著增加细胞内酪氨酸酶的活性和黑素的合成。6.miR-202-3p表达上调显著抑制了黑素细胞黏附作用,而miR-202-3p表达下调对黑素细胞与纤维连接蛋白的黏附作用无明显影响。第三部分:miR-202-3p对黑素细胞生物学影响的分子机制研究方法1.使用在线软件预测miR-202-3p的靶基因为YAP1,双荧光素酶报告实验验证YAP1是否是miR-202-3p的靶基因。2.qRT-PCR检测miR-202-3p对黑素细胞PIG1中YAP1,P73,PUMA mRNA水平表达的影响。3.Western blot检测miR-202-3p对黑素细胞PIG1中YAP1,P73,PUMA蛋白表达的影响。结果1.双荧光素酶报告实验结果表明miR-202-3p直接靶向负调控YAP1基因的表达。2.在miR-202-3p过表达的PIG1细胞中YAP1和p73基因的表达显著减少,PUMA表达显著增加。而miR-202-3p表达下调的细胞中,YAP1和p73基因的表达显著增加,PUMA表达显著减少。3.PIG1细胞中miR-202-3p表达上调后,YAP1和p73蛋白表达明显下调,而PUMA蛋白表达显著增加;PIG1细胞中miR-202-3p表达下调后,YAP1和p73蛋白表达明显增加,而PUMA蛋白表达显著减少。结论1.白癜风外周血清中有差异表达的miRNAs,包含2个显著上调表达miRNAs,32个显著下调miRNAs。差异表达miRNAs的生物功能主要集中于轴突导向、细胞黏附和细胞连接等相关信号通路中。差异表达最显著的miRNA-202-3p可能在白癜风的发生和发展中发挥重要作用。2.过表达miR-202-3p可显著抑制人黑素细胞的增殖和细胞黏附作用,抑制黑素合成,促进细胞凋亡。沉默miR-202-3p可促进黑素合成,但对细胞增殖、黏附和细胞凋亡作用无明显影响。3.YAP1是miR-202-3p直接靶向基因,miR-202-3p可能通过靶向调控YAP1的表达,影响细胞中增殖和凋亡相关蛋白p73和PUMA的表达,进而影响了正常人黑素细胞的生物学功能。