论文部分内容阅读
【摘要】肿瘤因其发病机理不明确，患病致死率高，治疗极其困难。传统治疗方法均存在毒副作用大，药物作用靶点不清晰，肿瘤复发率高等问题。随着肿瘤生物學和免疫学的不断发展，免疫治疗成为肿瘤治疗新方向。本文对肿瘤免疫治疗方案进行探讨，重点分析嵌合抗原受体在肿瘤治疗中的应用，归纳总结嵌合抗原受体的研究进展和前景。
【关键词】肿瘤;免疫治疗;嵌合抗原受体
【中图分类号】R730.51 【文献标识码】A
Progress of the application and challenge of Chimeric Antigen receptor in tumor immunotherapy
XU Shenglong
（Nan Jing Medical University， Jiang Su， Nan Jing 210000）
【Abstract】Because of the Ambiguity of the pathogenesis of Tumor and the high mortality rate， the treatment is extremely difficult.There are many problems in traditional therapy could not avoid problems like toxic and side effects， unclear target of drug action and high recurrence rate of tumor.With the development of tumor biology and immunology， immunotherapy has become a new direction of tumor therapy.This review focus on the application of Chimeric Antigen receptor in the treatment of cancer， and summarize the progress and prospect of Chimeric Antigen receptor.
【Key words】Cancer; Immunotherapy; Chimeric Antigen receptor
1 CAR细胞免疫疗法原理
1.1 CAR的结构
CAR分子的结构包括胞外抗原识别、跨膜和包内信号转导结构域。胞外结构域来自单克隆抗体的可变区，称为单链可变片段（ single chain variable fragment，scFv）。scFv不经过主要组织相容性复合体，而是直接特异性识别肿瘤相关抗原，从而不受自身抗原呈递[1]。跨膜（铰链）结构域可含有IgG4、CD3、CD4、CD7、CD8和CD28等蛋白分子，将胞内、外结构域进行连接[2]。胞内结构域为T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链，具有ITAM，能够接受抗原信号并发出活化信号，发挥信号转导功能[3]，引起T细胞的增殖和活化。
1.2 CAR-T细胞免疫治疗原理
T细胞主要执行细胞免疫和免疫应答，是人体中重要的免疫细胞。在T细胞发育的过程中，只有在胸腺中经过阳性选择，才能获得识别抗原信号的能力，但同时也受到自身MHC分子提呈能力的限制，即具有MHC限制性。在肿瘤等微环境中，抗原提呈细胞和共刺激分子无法正常表达，从而肿瘤细胞的抗原信号无法被T细胞识别。因此，不能正常活化的T细胞会对肿瘤组织产生免疫耐受，最终导致肿瘤的扩散[4]。通过基因工程可将胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和胞内信号转导结构域进行重组，形成CAR的基本骨架，并在体外通过逆转录病毒、慢病毒等将CAR基因导入患者的T细胞内。经过进一步筛选和体外增殖，形成CAR-T细胞。CAR-T细胞具备靶向识别功能，能够绕开抗原提呈细胞，激活自身并分泌细胞因子杀伤靶细胞，因此克服了MHC限制性，可以在肿瘤微环境中正常活化，从而达到治疗肿瘤的目的。
2 嵌合抗原受体治疗研发面临的挑战
2.1 细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）
CRS是指使用CAR-T细胞治疗可能使患者血清炎症因子水平急剧升高，导致患者出现发热、低血压、低氧血症和器官功能障碍等病症的现象。其发生机制为：CAR-T细胞在胞内信号域的作用下的CAR-T细胞短时间内急剧增殖、活化，分泌大量的炎症因子，如白细胞介素-6、白细胞介素-10和α-肿瘤坏死因子等，产生炎症因子毒性反应[5]。CAR-T细胞治疗的中枢神经毒性多与炎症因子风暴同时出现，推测是高水平的炎症因子进入并损害脑内环境所致。
2.2 移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）
目前认为移植物中所含有的成熟T细胞是导致GVHD的免疫活性细胞。临床研究证明GVHD的严重度与植入骨髓中T细胞数目密切相关，移植物中T细胞识别的抗原主要为HLA-I及n类抗原，移植物与宿主两者之间抗原的差别包括：（1）HLA配型不符时，主要组织相容性抗原的差别;（2）当HLA-A，B，C，D/DR配型相符时，次要组织相容性抗原的差别。这种差别造成输入的移植物T淋巴细胞识别宿主所表达的非己抗原而激活，产生CTL细胞造成组织、器官损伤，这种损伤可经预处理如全身放疗、化疗和T细胞激活过程所产生的过量炎症细胞因子而加重。
2.3 免疫逃逸机制
在临床应用上，CAR-T细胞对血液系统肿瘤，难治性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤疗效显著，但对实体瘤疗效欠佳。同时，脱靶效应、中枢神经毒性等问题导致CAR-T治疗失败以及治疗后复发的比例偏高。正常B细胞的发育伴随着CD19的表达，且CD19在B细胞恶性肿瘤上高表达，但在B细胞谱系外无表达。因此，特异性地靶向CD19的CAR-T细胞能有效治疗B细胞恶性肿瘤，包括复发或难治性B-ALL、慢性淋巴细胞白血病和淋巴瘤。但由于大多数B-ALL也高表达CD22，临床上仍有部分患者在经过CAR-T细胞治疗后仍有复发的情况出现，这与CD22的表达减少有关，该抗原逃逸成为B-ALL的获得性耐药的机制之一[6]。同样地，CAR-T细胞治疗实体瘤易发生抗原逃逸造成的脱靶效应以靶向B细胞成熟抗原的CAR-T细胞为例，这类CAR-T细胞对多发性骨髓瘤的疗效显著，但仍有部分患者在治疗后复发，原因可能是肿瘤细胞表达BCMA减少造成的脱靶效应[7]。 2.4 CAR-NK面临与CAR-T类似的转染困境
CAR-NK面临与CAR-T类似的转染困境基因的稳定转染是实现效应细胞稳定表达CAR的前提。和T细胞相比，NK细胞的转染同样存在着障碍，传统的电穿孔法和脂质体转染在NK细胞上效率低下，因此多数使用逆转录病毒和慢病毒载体[8]。研究报道，用电穿孔的方法转导CD19/20-CAR的效率不足10%，而用慢病毒转染外周血和脐带血来源NK细胞的效率分别为8%～16%和12%～73%。在另一项研究中，以逆转录病毒为载体，CD19-CAR在原代NK细胞中的转染效率能够达到43%～93%。研发新的载体，特别是针对NK细胞的特点研制出具有更高转染效率和安全性的载体是CAR-NK未来能在临床推广的关键。近年来，微环DNA、裸DNA、多聚物及分子偶连体等非病毒载体发展迅速，有望有所突破。另一主流的研究方向选择使用NK细胞系代替原代NK细胞，以弥补原代细胞扩增和转染方面的局限性[9]。
3 最新进展与展望
3.1 多靶点CAR-T治疗
针对抗原逃逸问题，研究者们也在尝试开发靶向多种肿瘤抗原，如CD19/CD22的CAR-T细胞，以同时识别CD19和CD22，针对B-ALL有较好的疗效。多靶点治疗在克服抗原免疫逃逸和提升CAR-T细胞的活性及存活时间两方面均体现出显著成效[10]。目前已开展的针对淋巴瘤的多靶点CAR-T临床试验如表1。
4 总结
近年来，免疫治疗技术成为应用研究和临床实践的前沿研究领域，CAR-T治疗的出现为难治淋巴瘤患者带来新的选择，然而CAR-T细胞治疗在疗效高的同时也存在并发症多、制备时间长、价格昂贵的不足。CAR-NK细胞疗法相较于CAR-T细胞疗法显示出很多优势，并且很多临床前研究已经证明CAR-NK细胞不仅在血液学肿瘤的治疗中极具潜力，而且在实体瘤的治疗上疗效也十分可观。但是，目前CAR-NK细胞疗法的研究还十分局限于临床前研究.因此我们尚不明确CAR-NK细胞疗法的疗效及可能的不良反应。但通过对CAR-NK细胞疗法的不懈研究，相信目前存在的问题得到解决，嵌合抗原受体会成为肿瘤免疫治疗的一个有力的策略。
参考文献：
[1]刘沙，梁皓，肖向茜.CAR-NK的构建及其在抗腫瘤联合治疗中的研究进展[J].癌症进展，2018，16：1199-1203.
[2]克晓燕.嵌合抗原受体-T细胞免疫治疗在血液系统恶性肿瘤中的应用进展.[J].中国全科医学，2016，19（12）：1361-1366
[3]ZHAO Z， CONDOMINES M， VAN DER STEGENS J C， et al.Structural design of engineered costimulation determines tumor rejection kinetics and persistence of CAR-T cells[J]. Cancer Cell，2015， 28（4）： 415-428. DOI：10.1016/j.ccell.2015.09.004.
[4]Maude SL，Frey N，Shaw PA，et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.[J].N Engl J Med，2014，371（16）：1507-1517.
[5]Kuwana Y， Asakura Y， Utsunomiya N， et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V regions and T-cell receptor-derived C regions.Biochem Biophys Res Commun， 1987，149（3）：960.
[6]Gross G， Waks T， Eshhar Z. Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibodytype specificity. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86（24）： 10024-8.
[7]Kochenderfer J N， Wilson W H， Janik J E， et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood， 2010（116）：4099.
[8]Porter DL，Levine BL， Kalos M， Bagg A， June CH. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med 2011;365（8）：725-33.
[9]王立群.CAR-T和免疫细胞肿瘤治疗.中国细胞生物学学报，2019，41（4）：540–548
[10] DOTTI G， GOTTSCHALK S， SAVOLDO B， et al. Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells [J]. Immunol Rev， 2014， 257（1）： 107-126. DOI： 10.1111 /imr.12131.
【关键词】肿瘤;免疫治疗;嵌合抗原受体
【中图分类号】R730.51 【文献标识码】A
Progress of the application and challenge of Chimeric Antigen receptor in tumor immunotherapy
XU Shenglong
（Nan Jing Medical University， Jiang Su， Nan Jing 210000）
【Abstract】Because of the Ambiguity of the pathogenesis of Tumor and the high mortality rate， the treatment is extremely difficult.There are many problems in traditional therapy could not avoid problems like toxic and side effects， unclear target of drug action and high recurrence rate of tumor.With the development of tumor biology and immunology， immunotherapy has become a new direction of tumor therapy.This review focus on the application of Chimeric Antigen receptor in the treatment of cancer， and summarize the progress and prospect of Chimeric Antigen receptor.
【Key words】Cancer; Immunotherapy; Chimeric Antigen receptor
1 CAR细胞免疫疗法原理
1.1 CAR的结构
CAR分子的结构包括胞外抗原识别、跨膜和包内信号转导结构域。胞外结构域来自单克隆抗体的可变区，称为单链可变片段（ single chain variable fragment，scFv）。scFv不经过主要组织相容性复合体，而是直接特异性识别肿瘤相关抗原，从而不受自身抗原呈递[1]。跨膜（铰链）结构域可含有IgG4、CD3、CD4、CD7、CD8和CD28等蛋白分子，将胞内、外结构域进行连接[2]。胞内结构域为T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链，具有ITAM，能够接受抗原信号并发出活化信号，发挥信号转导功能[3]，引起T细胞的增殖和活化。
1.2 CAR-T细胞免疫治疗原理
T细胞主要执行细胞免疫和免疫应答，是人体中重要的免疫细胞。在T细胞发育的过程中，只有在胸腺中经过阳性选择，才能获得识别抗原信号的能力，但同时也受到自身MHC分子提呈能力的限制，即具有MHC限制性。在肿瘤等微环境中，抗原提呈细胞和共刺激分子无法正常表达，从而肿瘤细胞的抗原信号无法被T细胞识别。因此，不能正常活化的T细胞会对肿瘤组织产生免疫耐受，最终导致肿瘤的扩散[4]。通过基因工程可将胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和胞内信号转导结构域进行重组，形成CAR的基本骨架，并在体外通过逆转录病毒、慢病毒等将CAR基因导入患者的T细胞内。经过进一步筛选和体外增殖，形成CAR-T细胞。CAR-T细胞具备靶向识别功能，能够绕开抗原提呈细胞，激活自身并分泌细胞因子杀伤靶细胞，因此克服了MHC限制性，可以在肿瘤微环境中正常活化，从而达到治疗肿瘤的目的。
2 嵌合抗原受体治疗研发面临的挑战
2.1 细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）
CRS是指使用CAR-T细胞治疗可能使患者血清炎症因子水平急剧升高，导致患者出现发热、低血压、低氧血症和器官功能障碍等病症的现象。其发生机制为：CAR-T细胞在胞内信号域的作用下的CAR-T细胞短时间内急剧增殖、活化，分泌大量的炎症因子，如白细胞介素-6、白细胞介素-10和α-肿瘤坏死因子等，产生炎症因子毒性反应[5]。CAR-T细胞治疗的中枢神经毒性多与炎症因子风暴同时出现，推测是高水平的炎症因子进入并损害脑内环境所致。
2.2 移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）
目前认为移植物中所含有的成熟T细胞是导致GVHD的免疫活性细胞。临床研究证明GVHD的严重度与植入骨髓中T细胞数目密切相关，移植物中T细胞识别的抗原主要为HLA-I及n类抗原，移植物与宿主两者之间抗原的差别包括：（1）HLA配型不符时，主要组织相容性抗原的差别;（2）当HLA-A，B，C，D/DR配型相符时，次要组织相容性抗原的差别。这种差别造成输入的移植物T淋巴细胞识别宿主所表达的非己抗原而激活，产生CTL细胞造成组织、器官损伤，这种损伤可经预处理如全身放疗、化疗和T细胞激活过程所产生的过量炎症细胞因子而加重。
2.3 免疫逃逸机制
在临床应用上，CAR-T细胞对血液系统肿瘤，难治性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤疗效显著，但对实体瘤疗效欠佳。同时，脱靶效应、中枢神经毒性等问题导致CAR-T治疗失败以及治疗后复发的比例偏高。正常B细胞的发育伴随着CD19的表达，且CD19在B细胞恶性肿瘤上高表达，但在B细胞谱系外无表达。因此，特异性地靶向CD19的CAR-T细胞能有效治疗B细胞恶性肿瘤，包括复发或难治性B-ALL、慢性淋巴细胞白血病和淋巴瘤。但由于大多数B-ALL也高表达CD22，临床上仍有部分患者在经过CAR-T细胞治疗后仍有复发的情况出现，这与CD22的表达减少有关，该抗原逃逸成为B-ALL的获得性耐药的机制之一[6]。同样地，CAR-T细胞治疗实体瘤易发生抗原逃逸造成的脱靶效应以靶向B细胞成熟抗原的CAR-T细胞为例，这类CAR-T细胞对多发性骨髓瘤的疗效显著，但仍有部分患者在治疗后复发，原因可能是肿瘤细胞表达BCMA减少造成的脱靶效应[7]。 2.4 CAR-NK面临与CAR-T类似的转染困境
CAR-NK面临与CAR-T类似的转染困境基因的稳定转染是实现效应细胞稳定表达CAR的前提。和T细胞相比，NK细胞的转染同样存在着障碍，传统的电穿孔法和脂质体转染在NK细胞上效率低下，因此多数使用逆转录病毒和慢病毒载体[8]。研究报道，用电穿孔的方法转导CD19/20-CAR的效率不足10%，而用慢病毒转染外周血和脐带血来源NK细胞的效率分别为8%～16%和12%～73%。在另一项研究中，以逆转录病毒为载体，CD19-CAR在原代NK细胞中的转染效率能够达到43%～93%。研发新的载体，特别是针对NK细胞的特点研制出具有更高转染效率和安全性的载体是CAR-NK未来能在临床推广的关键。近年来，微环DNA、裸DNA、多聚物及分子偶连体等非病毒载体发展迅速，有望有所突破。另一主流的研究方向选择使用NK细胞系代替原代NK细胞，以弥补原代细胞扩增和转染方面的局限性[9]。
3 最新进展与展望
3.1 多靶点CAR-T治疗
针对抗原逃逸问题，研究者们也在尝试开发靶向多种肿瘤抗原，如CD19/CD22的CAR-T细胞，以同时识别CD19和CD22，针对B-ALL有较好的疗效。多靶点治疗在克服抗原免疫逃逸和提升CAR-T细胞的活性及存活时间两方面均体现出显著成效[10]。目前已开展的针对淋巴瘤的多靶点CAR-T临床试验如表1。
4 总结
近年来，免疫治疗技术成为应用研究和临床实践的前沿研究领域，CAR-T治疗的出现为难治淋巴瘤患者带来新的选择，然而CAR-T细胞治疗在疗效高的同时也存在并发症多、制备时间长、价格昂贵的不足。CAR-NK细胞疗法相较于CAR-T细胞疗法显示出很多优势，并且很多临床前研究已经证明CAR-NK细胞不仅在血液学肿瘤的治疗中极具潜力，而且在实体瘤的治疗上疗效也十分可观。但是，目前CAR-NK细胞疗法的研究还十分局限于临床前研究.因此我们尚不明确CAR-NK细胞疗法的疗效及可能的不良反应。但通过对CAR-NK细胞疗法的不懈研究，相信目前存在的问题得到解决，嵌合抗原受体会成为肿瘤免疫治疗的一个有力的策略。
参考文献：
[1]刘沙，梁皓，肖向茜.CAR-NK的构建及其在抗腫瘤联合治疗中的研究进展[J].癌症进展，2018，16：1199-1203.
[2]克晓燕.嵌合抗原受体-T细胞免疫治疗在血液系统恶性肿瘤中的应用进展.[J].中国全科医学，2016，19（12）：1361-1366
[3]ZHAO Z， CONDOMINES M， VAN DER STEGENS J C， et al.Structural design of engineered costimulation determines tumor rejection kinetics and persistence of CAR-T cells[J]. Cancer Cell，2015， 28（4）： 415-428. DOI：10.1016/j.ccell.2015.09.004.
[4]Maude SL，Frey N，Shaw PA，et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.[J].N Engl J Med，2014，371（16）：1507-1517.
[5]Kuwana Y， Asakura Y， Utsunomiya N， et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V regions and T-cell receptor-derived C regions.Biochem Biophys Res Commun， 1987，149（3）：960.
[6]Gross G， Waks T， Eshhar Z. Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibodytype specificity. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86（24）： 10024-8.
[7]Kochenderfer J N， Wilson W H， Janik J E， et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood， 2010（116）：4099.
[8]Porter DL，Levine BL， Kalos M， Bagg A， June CH. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med 2011;365（8）：725-33.
[9]王立群.CAR-T和免疫细胞肿瘤治疗.中国细胞生物学学报，2019，41（4）：540–548
[10] DOTTI G， GOTTSCHALK S， SAVOLDO B， et al. Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells [J]. Immunol Rev， 2014， 257（1）： 107-126. DOI： 10.1111 /imr.12131.