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摘 要：缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是目前发现的最重要的缺氧感受因子。它作为一种转录调节因子，在脑缺血缺氧状态下，可激活100多种缺氧反应性基因表达，对脑缺血缺氧后微血管的再生、神经元的能量代谢、神经干细胞的增殖、分化的调控起到重要作用。但最近又发现，HIF-1是介导脑缺血缺氧后炎症损伤的关键因子，同时参与脑缺血缺氧后神经元的迟发性死亡。对近5年来国内外HIF-1与脑缺血缺氧性损伤的相关研究成果进行综述。
关键词：缺氧诱导因子-1；脑缺氧缺血性损伤；缺氧反应性基因
中图分类号：R743文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）02-023-05
1 HIF-1的结构特征及基因定位
HIF-1于1992年由Semenza在缺氧诱导的Hep3B细胞核提取物中发现［1］。它包括120kD的 亚基和91-94kD的β亚基，主要以异源二聚体形式存在，二者均属碱性螺旋-环-螺旋-Per-ARNT-Sim(bHLH-PAS)超家族成员， β亚基为组成型表达。HIF-1 的N 端具有bHLH和PAS区域， bHLH 区和DNA 结合， PAS 区则与HIF-1 形成二聚体，共同构成HIF-1 的DNA 结合结构域(DNA-binding domain， DBD)。HIF-1 C端的2个转录激活区域， 分别称为氨基端反式激活区(trans-activation domain-N， TAD-N) 和羧基端反式激活区(trans-activation domain-C，TAD-C)。TAD-C具有募集p300 /CBP形成转录起始复合物的作用， 从而激活靶基因的转录。在常氧状态下，该区天门冬酰胺803的羟基化抑制其转录活性，2个转录激活区域之间为抑制结构域， 能降低HIF-1的转录活性［4-6］。HIF-l 基因定位于人的14号染色体q21-24区，鼠的12号染色体上，而HIF-1β基因定位于人的1号染色体q21区，鼠的3号染色体上。
2 HIF-1转录活性的调节
在生理状态下，FIH-1（factor inhibiting HIF-1）可以使 TAD-C的天门冬酰胺803羟基化，该过程可以阻止HIF-1 与转录共活化因子的结合，但并不影响HIF-1α的稳定性。FIH-1是O2依赖性羟化酶，低氧、铁螯合剂可以降低它的活性，但它的转录不受氧浓度的影响［7］。研究表明，HIF-1 相关位点氨基酸残基的磷酸化也可以调节转录活性，MAPK通路、PI3K信号通路在这一过程中起明显作用。有文献报道ERK、P38激酶在体外可以磷酸化HIF-1 /HIF-2，使用ERK、p38激酶的抑制剂可以降低HIF-1 的转录活性，这一过程可能是由于磷酸化的HIF-1 与HIF-1 具有更高的亲和性［8］；细胞因子（ platelet-derived growth factor， PDGF、tumor Necrosis Factor， TNF、insulin-like growth factor-1/2， IGF-1/2）介导的磷酸化级联反应也可以影响HIF-1 的转录活性［9］。小分子泛素样修饰物（Small Ubiquitin-like MOdifier，SUMO）可以同时作用于HIF-1 与HIF-1， 降低HIF-1的转录活性。在缺氧状态下一氧化氮（NO）可以维持PDHs（prolyl hydroxylase domains）的稳定性，加强HIF-1 的PDHs依赖性降解途径，也有研究表明，NO亚硝基化HIF-1 半胱氨酸800可以提高HIF-1 与转录共激活因子的结合能力［10］。
HIF-1转录活性的调节涉及以下几个过程:①FIH-1羟基化天门冬酰胺803，阻止HIF-1 与转录共激活因子的结合，金属离子及离子螯合剂可以调节这一过程；②HIF-1 相关蛋白位点磷酸化后可以增加与HIF-1 的亲和力，增强转录活性；③小分子泛素样修饰物可以修饰HIF-1，抑制转录活性；④NO可以加速HIF-1的降解或增强转录活性。
3 HIF-1与靶基因
缺氧对机体产生严重影响，这一过程涉及到HIFs激活细胞内多种缺氧反应性基因的表达，其中HIF-1起主要作用 ［11］。在缺氧状态下，HIF-1 降解受抑制，与靶基因的缺氧反应应答元件(hypoxia response element， HRE)结合促进转录。它的靶基因主要有：①通过扩血管效应和新的血管网的构建来调节局部组织的氧供的基因，如：诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、内皮素1（ET1）、血管内皮生成因子及其受体（Vascular endothelial growth factor，VEGF、VEGFR）等。②增强细胞对葡萄糖的摄取能力和无氧酵解能力的基因，如：葡萄糖转运体-1/3（glucose transporter-1/3， GLU1/3）、乳酸脱氢酶A（Lactate dehydrogenase-A，LDHA）、丙酮酸激酶M（Pyruvate kinase M， PKM)。③促进红细胞增殖，提高血液携氧量的基因，如：促红细胞生成素（ erythropoietin，EPO）、转铁血红蛋白及其受体等。研究发现，神经系统也存在促红细胞生成素（erythropoietin， EPO），并且EPO 通过与受体结合引起的一系列信号转导，对脑发育［12］、缺血、缺氧性脑病及帕金森病等疾病起到保护作用［13-15］，其作用机制主要涉及降低氧化损伤、缓解血管痉挛、及调节神经递质等过程［16-17］。
4 HIF-1与脑缺血
4.1 HIF-1与血管再生
脑组织内微血管再生对缺血缺氧脑组织的存活有重要作用。血管再生是一个复杂的过程，涉及到多种细胞产生的生物活性因子。Sun等［18］发现，通过大鼠脑室内预先注射VEGF，可以促进齿状回和室管区（SVZ）神经元再生，以及纹状体半暗带区域的血管再生，VEGF的表达受到HIF-1的特异性调控。Chavez等［19］将大鼠暴露在低氧环境中，发现缺氧后4h~14d， HIF-1 持续高表达，同时VEGF、GLU-3的mRNA水平也升高，到21d时恢复到原来水平，但将缺氧后21d的大鼠暴露在更低的氧环境中时，HIF-1 的水平又升高，可见在HIF-1的作用下，血管的重塑和能量代谢的改变对脑组织适应长时间的缺氧有重要意义。EPO在缺氧缺血状态下可以与内皮细胞表面的受体结合，通过JAK2信号通路促进血管内皮细胞的增殖，它也可以通过VEGF/VEGFR途径间接促进血管再生［20］。Konstantin等［21］发现，暴露于低氧环境中180min和300min的大鼠与对照组相比，MCAo(middle cerebral artery occlusion)后脑梗死体积分别降低了75%和54%，HIF-1与DNA的结合能力明显增强，EPO的mRNA水平上升了7倍，表明HIF-1 /EPO途径可以影响大鼠的脑缺血耐受能力。
4.2 HIF-1与神经元再生
脑缺血缺氧状态下，神经干细胞可以通过增生分化来部分修复受损组织的功能，Arvidsson等［22］对大鼠实施MCAo后发现，室管区有大量干细胞增生，并移行到受损的纹状体区分化为成熟的神经元，许多因素如脑源性EPO、VEGF、IGF-1、干细胞生长因子等氧依赖性基因影响这一过程，而它们受到HIF-1的调控［18、23］。Nakatomi等［24］发现，干细胞生长因子可以促进短暂性缺血状态下的大鼠海马区锥体细胞的再生。Bernaudin 等［25］通过向MCAo大鼠脑室内注射EPO，发现神经干细胞的增殖和分化明显，梗死体积明显减少。除Tomita等［26］发现，神经元内HIF-1 基因特异性敲除的成年大鼠出现明显的神经元变性、脑水肿和空间感知障碍，HIF-1 基因敲除的大鼠胚胎出现明显的脉管发育障碍，且端脑有大量神经元凋亡。Javorina等［27］发现，HIF-1 基因敲除的成年大鼠脑组织内VEGF mRNA水平明显下降，在黑质区多巴胺标记分子酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH)、醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase）分别降低了41%和61%，BCL2降低了58%，而caspase-3被激活。由此可见，HIF-1可能通过靶基因促进神经元再生和分化。
4.3 HIF-1与神经元凋亡
脑缺血缺氧时，神经元线粒体源性ATP减少，细胞色素C被释放到胞浆中，Bax与Bak活化，激活Apaf-1， 使Caspase9激活Caspase3/7，诱导凋亡，这一过程可以被抗凋亡蛋白2（IAP-2）抑制。由于线粒体膜受损，产生大量活性氧，可以直接使Caspase 9激活Caspase 3/7，诱导凋亡［28］。HIF-1可以通过两条途径诱导神经元凋亡：HIF-1可以与p53泛素连接酶（mdm2）结合，增强P53的稳定性，而p53可以通过调节Bax与p21，诱导凋亡；在缺氧状态下，HIF-1的稳定性和转录活性增强，使Bcl-2结合蛋白BNIP3和NIX表达增多，抑制Bcl-2的抗凋亡作用［29］。但是HIF-1除了具有诱导凋亡的作用外，还有通过提高抗凋亡蛋白IAP-2表达起到抗凋亡的作用［30］。Helton［31］等将 HIF-1α基因敲除的成年大鼠暴露在低氧的环境中4.5h后，发现其海马区和皮质区细胞凋亡数量明显少于野生型，诱导凋亡的蛋白Tial1(cytotoxic granule-associated RNA binding protein-like 1)、 Tia1(cytotoxic granule-associated RNA binding protein-1) 、Sfrs7（ splicing factor， arginine/ serine-rich 7 ）明显减少，可见在急性脑缺血早期HIF-1诱导了缺氧神经元的凋亡。Althaus［32］等发现大鼠MCAO24h后，皮质和纹状体神经元细胞核内有大量的BNIP3表达，直接参与了神经元的迟发性死亡。但Ueno［33］等发现，在HIF-1基因敲除的大鼠胚胎中，ROS-TNF-caspase-2和Glucose deprivation-C-Myc-caspase-3途径可以诱导皮质神经元凋亡。Baranova［34］ 对HIF-1基因敲除大鼠实施MCAo后， 发现诱导凋亡蛋白BNIP3在缺血24h内升高，后降低，与基因敲除组对比凋亡神经元明显减少。可见，在缺血缺氧脑损伤的发生发展过程中，HIF-1发挥了诱导神经元凋亡和抗凋亡的双重作用。
4.4 HIF-1与脑缺血后的炎症反应
脑缺血后的炎症反应是以脑微血管内白细胞聚集并穿过血管壁、浸润脑组织，同时伴有微血管功能紊乱及局部脑组织中液体及蛋白质积聚为标志的炎症过程， 其与脑缺血后的继发性脑损伤密切相关。活化的白细胞可释放多种毒性物质，损伤局部血管， 造成组织水肿。释放的毒性物质还可激活脑内的胶质细胞，激活的胶质细胞通过释放神经毒物质又会吸引更多的白细胞进入脑组织。Cramer等［35］发现，HIF-1是白细胞介导炎症反应的必需因子。Ockaili等［36］对HIF-1介导炎症反应的机制研究时，发现HIF-1在缺氧状态下可以通过血红素氧化酶-1（Heme Oxygenase-1）促进血管内皮细胞内趋化因子IL-8的表达。Mojsilovic-Petrovic等［37］研究结果表明，在脑缺血状态下，HIF-1可以提高星形胶质细胞炎症活化因子MCP-1/-5的表达，参与启动脑缺血缺氧后的炎症反应。Makino等［38］发现，HIF-1-肾上腺髓质素（AM）通路对激活T淋巴细胞的长期存活起到重要的调控作用，直接加重了脑缺血缺氧后的炎症损伤。Zhang等［39］发现，HIF-1可以提高培养的星形胶质细胞中IL-1的表达，而IL-1 又可以通过PI3-kinase-Akt-mTOR-NF-κB信号转导途径作用于COX-2基因，增强HIF-1的表达。Frede等［40］研究发现，在常氧状态下，细菌脂多糖LPS可以通过ERK和NF-κB来提高分化和未分化的单核细胞中HIF-1 mRNA的水平和蛋白含量。Nakamura等［41］研究表明，外周T淋巴细胞在低氧环境中可以通过TCR-PI3K通路提高HIF-1基因的表达。可见HIF-1作为炎症反应重要的始动因子，参与了脑缺血缺氧后炎症损伤的发生、发展过程，同时大量炎症介质的释放又增加了HIF-1基因的表达和转录活性，从而形成一个恶性循环的过程， 加重了脑损伤。
5 益气活血中药与HIF-1
季秋虹等［42］利用刺五加皂甙研究氯化钴诱导化学缺氧的PC12细胞活性的影响，实验表明刺五加皂甙诱导了缺氧损伤的PC12细胞表达HIF-1，发挥了抗神经元缺氧损伤的作用。朱永林等［43］利用复方丹参片灌喂永久性双侧颈总动脉（2VO）结扎的慢性脑缺血大鼠的研究表明， 脑缺血8w后，海马CA1 区、皮质锥体细胞均有大量HIF-1免疫阳性神经元分布，其中以海马锥体为主要核表达， 胞浆也有部分表达。部分小血管和毛细血管管壁也可看到免疫阳性细胞， 提示内皮细胞也有部分HIF-1表达。可见，复方丹参片可显著增加2VO 大鼠脑内HIF-1 表达， 促进慢性脑缺血的代偿修复。朱俐等［44］用银杏内酯(Gin)处理原代培养神经元的结果显示，在培养的皮层神经元中，HIF-1mRNA 有一定的基础表达， Gin 处理24 h 可明显提高HIF-1mRNA水平，表明Gin对缺氧神经元的保护作用可能与HIF-1之间存在密切关系。近年来，临床研究表明黄芪、当归对缺血、缺氧性脑血管疾病有显著疗效［45-48］，动物实验也表明黄芪、当归在脑缺氧缺血状态下，可以影响VEGF以及血清型EPO的表达［49］，但是否对脑源性EPO、HIF-1有影响还不清楚。
6 展望
缺血缺氧性脑血管疾病是人类致死、致残的重要原因，其发病率逐年升高，严重威胁着人类的健康。目前认为，HIF-1作为最关键的缺氧感受因子，对维持细胞内氧平衡起着至关重要的作用。HIF-1在脑组织内广泛分布，参与脑缺血缺氧过程，在构建新的微血管、促进神经干细胞分化的同时也介导了炎症损伤和迟发性神经元死亡。它也有可能是一些对缺血缺氧性脑损伤具有保护作用的中药的重要靶点。
参考文献：
［1］ Semenza GL， Wang GL. A nuclear factor induced by hypoxia via denovo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation［Ｊ］. Mol Cell Biol， 1992， 12(12): 5447-5454.
［2］ Wang GL， Jiang BH， Rue EA. Hypoxia-inducible factor 1 is basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular 02 tension［Ｊ］. Proc Natl Acad Sci， 1995（92）: 5510-5514.
［3］ Ke QD， Costa M. Hypoxia-Inducible Factor-1(HIF-1) ［Ｊ］. Mol Pharmacol， 2006（70）: 1469-1480.
［4］ Maxwell P H. Hypoxia-inducible factor as a physiological regulator［Ｊ］. Exp Physiol， 2005（90）: 791-797.
［5］ Tan C， Rita G. de Noronha， Roecker AJ. Identification of a novel small-molecule inhibitor of the hypoxia-inducible factor 1 pathway［Ｊ］. Cancer Res， 2005， 65(2): 605-612.
［6］ Manalo DJ， Rowan A， Tera L. Transcriptional regulation of vascular endothelial cell responses to hypoxia by HIF-1. Blood， 2005， 105(2): 659-669.
［7］ Metzen E， Berchner-Pfannschmidt U， Stengel P. Intracellular localisation of human HIF-1 alpha hydroxylases: implications for oxygen sensing［Ｊ］. J Cell Sci， 2003（116）: 1319-1326.
［8］ Suzuki H， Tomida A， Tsuruo T. Dephosphorylated hypoxia-inducible factor 1 alpha as a mediator of p53-dependent apoptosis during hypoxia［Ｊ］. Oncogene， 2001（20）: 5779-5788.
［9］ Li J， Davidson G， Huang Y. Nickel compounds act through phosphatidylinositol-3-kinase/Akt-dependent， p70(S6k)-independent pathway to induce hypoxia inducible factor transactivation and Cap43 expression in mouse epidermal Cl41 cells［Ｊ］. Cancer Res， 2004（64）:94-101.
［10］ Brahimi-Horn C， Mazure N， Pouyssegur J. Signalling via the hypoxia inducible factor-1 alpha requires multiple posttranslational modifications［Ｊ］. Cell Signal， 2005（17）: 1-9.
［11］ Till A， Helmut A. Cellular oxygen sensing need in CNS function: physiological and pathological implications［Ｊ］. J Exp Biolo， 2004（207）: 3171-3188.
［12］ Iwai M， Cao G， Yin W. Erythropoietin promotes neuronal replacement through revascularization and neurogenesis after neonatal hypoxia/ischemia in rats［Ｊ］. Stroke， 2007(16):1412-1420.
［13］ Kumral A， Baskin H， Yesilirmak DC. Erythropoietin attenuates lipopolysaccharide-induced white matter injury in the neonatal rat brain［Ｊ］. Neonatology， 2007（92）:269-278.
［14］ Yang J， Huang Y， Yu X. Erythropoietin preconditioning suppresses neuronal death following status epilepticus in rats［Ｊ］. Acta Neurobiol EXP， 2007， 67(2):141-148.
［15］ Viviani B， Baartesaghi S， Corsini E. Erythropoietin protects primary hippocampal neurons increasing the expression of brain-derived neurotrophic factor［Ｊ］. J Neuroche， 2005， 93(2):412-421.
［16］ Costanza S， Rosetta P， Fulvio B. Delayed administration of erythropoietin and its non-erythropoietic derivatives ameliorates chronic murine autoimmune encephalomyelitis［Ｊ］. J Neuroimmunol， 2006（172）: 27-37.
［17］ Mitsionis GI， Sakellariou E， Beris AE. The role of erythropoietin in central and peripheral nerve injury［Ｊ］. Clin Neurol Neurosurg， 2007， 109(8):639-644.
［18］ Sun YJ， Jin K， Xie L.VEGF-induced neuroprotection， neurogenesis， andAngiogenesis afterfocal cerebral ischema［Ｊ］. J Clin Invest， 2003（111）: 1843-1851.
［19］ Chavez JC， Agani F， Pichiule P. Expression of hypoxia-inducible factor-1 in the brain of rats during chronic hypoxia［Ｊ］. J Appl Physiol， 2000（89）: 1937-1942.
［20］ Marti HH， Myriam B， Petit E. Neuroprotection and Angiogenesis: Dual role of erythropoietin in brain ischemia［Ｊ］. News Physicol Sci， 2000， 15(5):225-229.
［21］ Konstantin P， Scharff A， Karsten R. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin［Ｊ］. Stroke， 2003（34）: 1981-1986.
［22］ Arvidsson A， Collin T， Kirik D. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke［Ｊ］. Nat Med， 2002（8）: 963-970.
［23］ Doetsch F. The glial identity of neural stem cells［Ｊ］. Nat Neurosci， 2003（6）:1127-1134.
［24］ Nakatomi H， Kuriu T， Okabe S. Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injury by recruitment of endogenous neural progenitors［Ｊ］. Cell， 2002（110）:429-441.
［25］ Bernaudin M， Marti HH， Roussel S A potential role for erythropoietin in focal permanent cerebral ischemia in mice［Ｊ］. J Cereb Blood Flow Meta， 1999（19）:643-651.
［26］ Tomita S， Ueno M， Sakamoto M. Defective brain development in mice lacking the HIF-1aiapha gene in neural cells［Ｊ］.Mol Cell Biol， 2003（23）:6739-6749.
［27］ Javorina M， Maisel M， Wegner F. Lack of HIF-1 alpha impairs midbrain neural precursor cells involving vascular endothelial growth factor signaling［Ｊ］. J Neurosci， 2007， 27(2): 412-421.
［28］ Greijer A E， E van der Wall.The role of hypoxia inducible factor 1(HIF-1) in hypoxia induced apoptosis［Ｊ］. J Clin Pathol， 2004（57）:1009-1014.
［29］ Kothari S， Cizeau J， McMillan-Ward E.BNIP3 plays a role in hypoxic cell death in human epithelial cells that is inhibited by growth factors EGF and IGF［Ｊ］. Oncogene， 2003（22）: 47 34-44.
［30］ Piret JP， Mottet D， Raes M. Is HIF-1 alpha a pro-or an anti-apoptotic［Ｊ］.ProteinBiochem Pharmacol， 2002， 64(8): 89-92.
［31］ Helton R，Cui JK， R.Scheel J. Brain-specific knock-out of hypoxia-inducible factor-1 reduces rather than increases hypoxic-ischemic damage［Ｊ］. J Neurosci， 2005， 25(16):4099-4107.
［32］ Althaus J， Bernaudin M， Petit E. Expression of the gene encoding the pro-apoptotic BNIP3 protein and stimulation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) protein following focal cerebral ischemia in rats［Ｊ］. Neurochem Int， 2006， 48(8): 687-695.
［33］ Ueno M， Tomita S， Masaaki U. Two pathways of apoptosis are simultaneously induced in the embryonal brains of neural cell-specific HIF-1-deficient mice［Ｊ］. Histochem Cell Biol， 2006（125）: 535-544.
［34］ Baranova O， F.Miranda L， Pichiule P. Neuron-specific inactivation of the hypoxia inducible factor 1α increases brain injury in a mouse model of transient focal cerebral ischemia［Ｊ］. J Neurosci， 2007， 27(23): 6320-6332.
［35］ Cramer T， Yamanishi Y， Clausen B. HIF-1is essential for myeloid cell-mediated inflammation［Ｊ］. Cell， 2003（112）: 645-657.
［36］ Ockaili R， Natarajan R， Salloum F. HIF-1 activation attenuates post-ischemic myocardial injury: Role for heme oxygenase-1 in modulatingmicrovascular chemokine generation［Ｊ］. J Appl Physiol， 2007（102）: 1927-1935.
［37］ Mojsilovic-Petrovic J， Callaghan D， Cui H. Hypoxia-Inducible-Factor-1(HIF-1) is involved in the regulation of hypoxia-stimulated expression of monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1/CCL2) and MCP-5(Ccl12) in astrocytes［Ｊ］. J Neuroimmunol， 2007（4）:12.
［38］ Makino YC， Nakamura H， Ikeda E. Hypoxia-Inducible Factor regulates survival of antigen receptor-driven T Cells［Ｊ］. J Immunol， 2003（171）: 6534-6540.
［39］ Zhang WD， Petrovic JM， Callaghan D. Evidence that hypoxia-inducible factor-1(HIF-1) mediates transcriptional activation of interleukin-1(IL-1β) in astrocyte cultures［Ｊ］. J Neuroimmunol， 2006（174）: 63-73.
［40］ Frede S， Stockmann C， Freitag P. Bacterial lipopolysaccharide induces HIF-1 activation in human monocytes via p44/42 MAPK and NF-κB［Ｊ］. Biochem J， 2006（396）: 517-527.
［41］ Nakamura H， Makino Y， Okamoto K. TCR engagement increases Hypoxia-inducible-factor-1α protein synthesis via rapamycin-sensitive pathway under hypoxic conditions in human peripheral T Cells［Ｊ］. J Immunol， 2005（174）: 7592-7599.
［42］ 季秋虹， 顾永健， 朱俐. 刺五加皂甙保护PC12 细胞活性与缺氧诱导因子1 的表达［J］. 中国临床康复， 2006， 10(43): 92-95.
［43］ 朱永林， 刘其强， 杨伟琴. 复方丹参片对慢性脑缺血大鼠脑内HIF-1 表达的影响［J］. 实用神经病， 2005， 118(15): 18-19.
［44］ 朱俐， 吴小梅， 李建成. 银杏内酯对原代培养神经元缺氧诱导因子-1 基因表达的影响［Ｊ］. 中国应用生理学， 2004， 20(4): 354-357.
［45］ 张京. 大剂量黄芪注射液治疗缺血性脑卒中临床分析［Ｊ］. 中西医结合心脑血管病， 2004， 2(4): 205-207.
［46］ 窦常胜，周名雄，张士发. 黄芪注治疗新生儿缺氧缺血性脑病的临床与机理研究 ［J］.皖南医学院学报， 2004， 23(4): 258-260.
［47］ 周萍. 葛根素黄芪注射液治疗椎－基底动脉供血不足［J］. 医药论坛， 2004， 25(22):17-18.
［48］ 刘景峰， 曲雅文. 当归注射液刺激神经干治疗脑梗塞后遗症的临床观察［J］. 中医药学刊， 2006（24）:1495-1496.
［49］ 苗明三， 方晓艳. 当归补血汤多糖对大鼠血虚模型血清IL22， IL26，EPO水平的影响［J］. 中国现代应用药学， 2004， 21(3): 179-181.
(责任编辑：杜 靖)
关键词：缺氧诱导因子-1；脑缺氧缺血性损伤；缺氧反应性基因
中图分类号：R743文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）02-023-05
1 HIF-1的结构特征及基因定位
HIF-1于1992年由Semenza在缺氧诱导的Hep3B细胞核提取物中发现［1］。它包括120kD的 亚基和91-94kD的β亚基，主要以异源二聚体形式存在，二者均属碱性螺旋-环-螺旋-Per-ARNT-Sim(bHLH-PAS)超家族成员， β亚基为组成型表达。HIF-1 的N 端具有bHLH和PAS区域， bHLH 区和DNA 结合， PAS 区则与HIF-1 形成二聚体，共同构成HIF-1 的DNA 结合结构域(DNA-binding domain， DBD)。HIF-1 C端的2个转录激活区域， 分别称为氨基端反式激活区(trans-activation domain-N， TAD-N) 和羧基端反式激活区(trans-activation domain-C，TAD-C)。TAD-C具有募集p300 /CBP形成转录起始复合物的作用， 从而激活靶基因的转录。在常氧状态下，该区天门冬酰胺803的羟基化抑制其转录活性，2个转录激活区域之间为抑制结构域， 能降低HIF-1的转录活性［4-6］。HIF-l 基因定位于人的14号染色体q21-24区，鼠的12号染色体上，而HIF-1β基因定位于人的1号染色体q21区，鼠的3号染色体上。
2 HIF-1转录活性的调节
在生理状态下，FIH-1（factor inhibiting HIF-1）可以使 TAD-C的天门冬酰胺803羟基化，该过程可以阻止HIF-1 与转录共活化因子的结合，但并不影响HIF-1α的稳定性。FIH-1是O2依赖性羟化酶，低氧、铁螯合剂可以降低它的活性，但它的转录不受氧浓度的影响［7］。研究表明，HIF-1 相关位点氨基酸残基的磷酸化也可以调节转录活性，MAPK通路、PI3K信号通路在这一过程中起明显作用。有文献报道ERK、P38激酶在体外可以磷酸化HIF-1 /HIF-2，使用ERK、p38激酶的抑制剂可以降低HIF-1 的转录活性，这一过程可能是由于磷酸化的HIF-1 与HIF-1 具有更高的亲和性［8］；细胞因子（ platelet-derived growth factor， PDGF、tumor Necrosis Factor， TNF、insulin-like growth factor-1/2， IGF-1/2）介导的磷酸化级联反应也可以影响HIF-1 的转录活性［9］。小分子泛素样修饰物（Small Ubiquitin-like MOdifier，SUMO）可以同时作用于HIF-1 与HIF-1， 降低HIF-1的转录活性。在缺氧状态下一氧化氮（NO）可以维持PDHs（prolyl hydroxylase domains）的稳定性，加强HIF-1 的PDHs依赖性降解途径，也有研究表明，NO亚硝基化HIF-1 半胱氨酸800可以提高HIF-1 与转录共激活因子的结合能力［10］。
HIF-1转录活性的调节涉及以下几个过程:①FIH-1羟基化天门冬酰胺803，阻止HIF-1 与转录共激活因子的结合，金属离子及离子螯合剂可以调节这一过程；②HIF-1 相关蛋白位点磷酸化后可以增加与HIF-1 的亲和力，增强转录活性；③小分子泛素样修饰物可以修饰HIF-1，抑制转录活性；④NO可以加速HIF-1的降解或增强转录活性。
3 HIF-1与靶基因
缺氧对机体产生严重影响，这一过程涉及到HIFs激活细胞内多种缺氧反应性基因的表达，其中HIF-1起主要作用 ［11］。在缺氧状态下，HIF-1 降解受抑制，与靶基因的缺氧反应应答元件(hypoxia response element， HRE)结合促进转录。它的靶基因主要有：①通过扩血管效应和新的血管网的构建来调节局部组织的氧供的基因，如：诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、内皮素1（ET1）、血管内皮生成因子及其受体（Vascular endothelial growth factor，VEGF、VEGFR）等。②增强细胞对葡萄糖的摄取能力和无氧酵解能力的基因，如：葡萄糖转运体-1/3（glucose transporter-1/3， GLU1/3）、乳酸脱氢酶A（Lactate dehydrogenase-A，LDHA）、丙酮酸激酶M（Pyruvate kinase M， PKM)。③促进红细胞增殖，提高血液携氧量的基因，如：促红细胞生成素（ erythropoietin，EPO）、转铁血红蛋白及其受体等。研究发现，神经系统也存在促红细胞生成素（erythropoietin， EPO），并且EPO 通过与受体结合引起的一系列信号转导，对脑发育［12］、缺血、缺氧性脑病及帕金森病等疾病起到保护作用［13-15］，其作用机制主要涉及降低氧化损伤、缓解血管痉挛、及调节神经递质等过程［16-17］。
4 HIF-1与脑缺血
4.1 HIF-1与血管再生
脑组织内微血管再生对缺血缺氧脑组织的存活有重要作用。血管再生是一个复杂的过程，涉及到多种细胞产生的生物活性因子。Sun等［18］发现，通过大鼠脑室内预先注射VEGF，可以促进齿状回和室管区（SVZ）神经元再生，以及纹状体半暗带区域的血管再生，VEGF的表达受到HIF-1的特异性调控。Chavez等［19］将大鼠暴露在低氧环境中，发现缺氧后4h~14d， HIF-1 持续高表达，同时VEGF、GLU-3的mRNA水平也升高，到21d时恢复到原来水平，但将缺氧后21d的大鼠暴露在更低的氧环境中时，HIF-1 的水平又升高，可见在HIF-1的作用下，血管的重塑和能量代谢的改变对脑组织适应长时间的缺氧有重要意义。EPO在缺氧缺血状态下可以与内皮细胞表面的受体结合，通过JAK2信号通路促进血管内皮细胞的增殖，它也可以通过VEGF/VEGFR途径间接促进血管再生［20］。Konstantin等［21］发现，暴露于低氧环境中180min和300min的大鼠与对照组相比，MCAo(middle cerebral artery occlusion)后脑梗死体积分别降低了75%和54%，HIF-1与DNA的结合能力明显增强，EPO的mRNA水平上升了7倍，表明HIF-1 /EPO途径可以影响大鼠的脑缺血耐受能力。
4.2 HIF-1与神经元再生
脑缺血缺氧状态下，神经干细胞可以通过增生分化来部分修复受损组织的功能，Arvidsson等［22］对大鼠实施MCAo后发现，室管区有大量干细胞增生，并移行到受损的纹状体区分化为成熟的神经元，许多因素如脑源性EPO、VEGF、IGF-1、干细胞生长因子等氧依赖性基因影响这一过程，而它们受到HIF-1的调控［18、23］。Nakatomi等［24］发现，干细胞生长因子可以促进短暂性缺血状态下的大鼠海马区锥体细胞的再生。Bernaudin 等［25］通过向MCAo大鼠脑室内注射EPO，发现神经干细胞的增殖和分化明显，梗死体积明显减少。除Tomita等［26］发现，神经元内HIF-1 基因特异性敲除的成年大鼠出现明显的神经元变性、脑水肿和空间感知障碍，HIF-1 基因敲除的大鼠胚胎出现明显的脉管发育障碍，且端脑有大量神经元凋亡。Javorina等［27］发现，HIF-1 基因敲除的成年大鼠脑组织内VEGF mRNA水平明显下降，在黑质区多巴胺标记分子酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH)、醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase）分别降低了41%和61%，BCL2降低了58%，而caspase-3被激活。由此可见，HIF-1可能通过靶基因促进神经元再生和分化。
4.3 HIF-1与神经元凋亡
脑缺血缺氧时，神经元线粒体源性ATP减少，细胞色素C被释放到胞浆中，Bax与Bak活化，激活Apaf-1， 使Caspase9激活Caspase3/7，诱导凋亡，这一过程可以被抗凋亡蛋白2（IAP-2）抑制。由于线粒体膜受损，产生大量活性氧，可以直接使Caspase 9激活Caspase 3/7，诱导凋亡［28］。HIF-1可以通过两条途径诱导神经元凋亡：HIF-1可以与p53泛素连接酶（mdm2）结合，增强P53的稳定性，而p53可以通过调节Bax与p21，诱导凋亡；在缺氧状态下，HIF-1的稳定性和转录活性增强，使Bcl-2结合蛋白BNIP3和NIX表达增多，抑制Bcl-2的抗凋亡作用［29］。但是HIF-1除了具有诱导凋亡的作用外，还有通过提高抗凋亡蛋白IAP-2表达起到抗凋亡的作用［30］。Helton［31］等将 HIF-1α基因敲除的成年大鼠暴露在低氧的环境中4.5h后，发现其海马区和皮质区细胞凋亡数量明显少于野生型，诱导凋亡的蛋白Tial1(cytotoxic granule-associated RNA binding protein-like 1)、 Tia1(cytotoxic granule-associated RNA binding protein-1) 、Sfrs7（ splicing factor， arginine/ serine-rich 7 ）明显减少，可见在急性脑缺血早期HIF-1诱导了缺氧神经元的凋亡。Althaus［32］等发现大鼠MCAO24h后，皮质和纹状体神经元细胞核内有大量的BNIP3表达，直接参与了神经元的迟发性死亡。但Ueno［33］等发现，在HIF-1基因敲除的大鼠胚胎中，ROS-TNF-caspase-2和Glucose deprivation-C-Myc-caspase-3途径可以诱导皮质神经元凋亡。Baranova［34］ 对HIF-1基因敲除大鼠实施MCAo后， 发现诱导凋亡蛋白BNIP3在缺血24h内升高，后降低，与基因敲除组对比凋亡神经元明显减少。可见，在缺血缺氧脑损伤的发生发展过程中，HIF-1发挥了诱导神经元凋亡和抗凋亡的双重作用。
4.4 HIF-1与脑缺血后的炎症反应
脑缺血后的炎症反应是以脑微血管内白细胞聚集并穿过血管壁、浸润脑组织，同时伴有微血管功能紊乱及局部脑组织中液体及蛋白质积聚为标志的炎症过程， 其与脑缺血后的继发性脑损伤密切相关。活化的白细胞可释放多种毒性物质，损伤局部血管， 造成组织水肿。释放的毒性物质还可激活脑内的胶质细胞，激活的胶质细胞通过释放神经毒物质又会吸引更多的白细胞进入脑组织。Cramer等［35］发现，HIF-1是白细胞介导炎症反应的必需因子。Ockaili等［36］对HIF-1介导炎症反应的机制研究时，发现HIF-1在缺氧状态下可以通过血红素氧化酶-1（Heme Oxygenase-1）促进血管内皮细胞内趋化因子IL-8的表达。Mojsilovic-Petrovic等［37］研究结果表明，在脑缺血状态下，HIF-1可以提高星形胶质细胞炎症活化因子MCP-1/-5的表达，参与启动脑缺血缺氧后的炎症反应。Makino等［38］发现，HIF-1-肾上腺髓质素（AM）通路对激活T淋巴细胞的长期存活起到重要的调控作用，直接加重了脑缺血缺氧后的炎症损伤。Zhang等［39］发现，HIF-1可以提高培养的星形胶质细胞中IL-1的表达，而IL-1 又可以通过PI3-kinase-Akt-mTOR-NF-κB信号转导途径作用于COX-2基因，增强HIF-1的表达。Frede等［40］研究发现，在常氧状态下，细菌脂多糖LPS可以通过ERK和NF-κB来提高分化和未分化的单核细胞中HIF-1 mRNA的水平和蛋白含量。Nakamura等［41］研究表明，外周T淋巴细胞在低氧环境中可以通过TCR-PI3K通路提高HIF-1基因的表达。可见HIF-1作为炎症反应重要的始动因子，参与了脑缺血缺氧后炎症损伤的发生、发展过程，同时大量炎症介质的释放又增加了HIF-1基因的表达和转录活性，从而形成一个恶性循环的过程， 加重了脑损伤。
5 益气活血中药与HIF-1
季秋虹等［42］利用刺五加皂甙研究氯化钴诱导化学缺氧的PC12细胞活性的影响，实验表明刺五加皂甙诱导了缺氧损伤的PC12细胞表达HIF-1，发挥了抗神经元缺氧损伤的作用。朱永林等［43］利用复方丹参片灌喂永久性双侧颈总动脉（2VO）结扎的慢性脑缺血大鼠的研究表明， 脑缺血8w后，海马CA1 区、皮质锥体细胞均有大量HIF-1免疫阳性神经元分布，其中以海马锥体为主要核表达， 胞浆也有部分表达。部分小血管和毛细血管管壁也可看到免疫阳性细胞， 提示内皮细胞也有部分HIF-1表达。可见，复方丹参片可显著增加2VO 大鼠脑内HIF-1 表达， 促进慢性脑缺血的代偿修复。朱俐等［44］用银杏内酯(Gin)处理原代培养神经元的结果显示，在培养的皮层神经元中，HIF-1mRNA 有一定的基础表达， Gin 处理24 h 可明显提高HIF-1mRNA水平，表明Gin对缺氧神经元的保护作用可能与HIF-1之间存在密切关系。近年来，临床研究表明黄芪、当归对缺血、缺氧性脑血管疾病有显著疗效［45-48］，动物实验也表明黄芪、当归在脑缺氧缺血状态下，可以影响VEGF以及血清型EPO的表达［49］，但是否对脑源性EPO、HIF-1有影响还不清楚。
6 展望
缺血缺氧性脑血管疾病是人类致死、致残的重要原因，其发病率逐年升高，严重威胁着人类的健康。目前认为，HIF-1作为最关键的缺氧感受因子，对维持细胞内氧平衡起着至关重要的作用。HIF-1在脑组织内广泛分布，参与脑缺血缺氧过程，在构建新的微血管、促进神经干细胞分化的同时也介导了炎症损伤和迟发性神经元死亡。它也有可能是一些对缺血缺氧性脑损伤具有保护作用的中药的重要靶点。
参考文献：
［1］ Semenza GL， Wang GL. A nuclear factor induced by hypoxia via denovo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation［Ｊ］. Mol Cell Biol， 1992， 12(12): 5447-5454.
［2］ Wang GL， Jiang BH， Rue EA. Hypoxia-inducible factor 1 is basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular 02 tension［Ｊ］. Proc Natl Acad Sci， 1995（92）: 5510-5514.
［3］ Ke QD， Costa M. Hypoxia-Inducible Factor-1(HIF-1) ［Ｊ］. Mol Pharmacol， 2006（70）: 1469-1480.
［4］ Maxwell P H. Hypoxia-inducible factor as a physiological regulator［Ｊ］. Exp Physiol， 2005（90）: 791-797.
［5］ Tan C， Rita G. de Noronha， Roecker AJ. Identification of a novel small-molecule inhibitor of the hypoxia-inducible factor 1 pathway［Ｊ］. Cancer Res， 2005， 65(2): 605-612.
［6］ Manalo DJ， Rowan A， Tera L. Transcriptional regulation of vascular endothelial cell responses to hypoxia by HIF-1. Blood， 2005， 105(2): 659-669.
［7］ Metzen E， Berchner-Pfannschmidt U， Stengel P. Intracellular localisation of human HIF-1 alpha hydroxylases: implications for oxygen sensing［Ｊ］. J Cell Sci， 2003（116）: 1319-1326.
［8］ Suzuki H， Tomida A， Tsuruo T. Dephosphorylated hypoxia-inducible factor 1 alpha as a mediator of p53-dependent apoptosis during hypoxia［Ｊ］. Oncogene， 2001（20）: 5779-5788.
［9］ Li J， Davidson G， Huang Y. Nickel compounds act through phosphatidylinositol-3-kinase/Akt-dependent， p70(S6k)-independent pathway to induce hypoxia inducible factor transactivation and Cap43 expression in mouse epidermal Cl41 cells［Ｊ］. Cancer Res， 2004（64）:94-101.
［10］ Brahimi-Horn C， Mazure N， Pouyssegur J. Signalling via the hypoxia inducible factor-1 alpha requires multiple posttranslational modifications［Ｊ］. Cell Signal， 2005（17）: 1-9.
［11］ Till A， Helmut A. Cellular oxygen sensing need in CNS function: physiological and pathological implications［Ｊ］. J Exp Biolo， 2004（207）: 3171-3188.
［12］ Iwai M， Cao G， Yin W. Erythropoietin promotes neuronal replacement through revascularization and neurogenesis after neonatal hypoxia/ischemia in rats［Ｊ］. Stroke， 2007(16):1412-1420.
［13］ Kumral A， Baskin H， Yesilirmak DC. Erythropoietin attenuates lipopolysaccharide-induced white matter injury in the neonatal rat brain［Ｊ］. Neonatology， 2007（92）:269-278.
［14］ Yang J， Huang Y， Yu X. Erythropoietin preconditioning suppresses neuronal death following status epilepticus in rats［Ｊ］. Acta Neurobiol EXP， 2007， 67(2):141-148.
［15］ Viviani B， Baartesaghi S， Corsini E. Erythropoietin protects primary hippocampal neurons increasing the expression of brain-derived neurotrophic factor［Ｊ］. J Neuroche， 2005， 93(2):412-421.
［16］ Costanza S， Rosetta P， Fulvio B. Delayed administration of erythropoietin and its non-erythropoietic derivatives ameliorates chronic murine autoimmune encephalomyelitis［Ｊ］. J Neuroimmunol， 2006（172）: 27-37.
［17］ Mitsionis GI， Sakellariou E， Beris AE. The role of erythropoietin in central and peripheral nerve injury［Ｊ］. Clin Neurol Neurosurg， 2007， 109(8):639-644.
［18］ Sun YJ， Jin K， Xie L.VEGF-induced neuroprotection， neurogenesis， andAngiogenesis afterfocal cerebral ischema［Ｊ］. J Clin Invest， 2003（111）: 1843-1851.
［19］ Chavez JC， Agani F， Pichiule P. Expression of hypoxia-inducible factor-1 in the brain of rats during chronic hypoxia［Ｊ］. J Appl Physiol， 2000（89）: 1937-1942.
［20］ Marti HH， Myriam B， Petit E. Neuroprotection and Angiogenesis: Dual role of erythropoietin in brain ischemia［Ｊ］. News Physicol Sci， 2000， 15(5):225-229.
［21］ Konstantin P， Scharff A， Karsten R. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin［Ｊ］. Stroke， 2003（34）: 1981-1986.
［22］ Arvidsson A， Collin T， Kirik D. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke［Ｊ］. Nat Med， 2002（8）: 963-970.
［23］ Doetsch F. The glial identity of neural stem cells［Ｊ］. Nat Neurosci， 2003（6）:1127-1134.
［24］ Nakatomi H， Kuriu T， Okabe S. Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injury by recruitment of endogenous neural progenitors［Ｊ］. Cell， 2002（110）:429-441.
［25］ Bernaudin M， Marti HH， Roussel S A potential role for erythropoietin in focal permanent cerebral ischemia in mice［Ｊ］. J Cereb Blood Flow Meta， 1999（19）:643-651.
［26］ Tomita S， Ueno M， Sakamoto M. Defective brain development in mice lacking the HIF-1aiapha gene in neural cells［Ｊ］.Mol Cell Biol， 2003（23）:6739-6749.
［27］ Javorina M， Maisel M， Wegner F. Lack of HIF-1 alpha impairs midbrain neural precursor cells involving vascular endothelial growth factor signaling［Ｊ］. J Neurosci， 2007， 27(2): 412-421.
［28］ Greijer A E， E van der Wall.The role of hypoxia inducible factor 1(HIF-1) in hypoxia induced apoptosis［Ｊ］. J Clin Pathol， 2004（57）:1009-1014.
［29］ Kothari S， Cizeau J， McMillan-Ward E.BNIP3 plays a role in hypoxic cell death in human epithelial cells that is inhibited by growth factors EGF and IGF［Ｊ］. Oncogene， 2003（22）: 47 34-44.
［30］ Piret JP， Mottet D， Raes M. Is HIF-1 alpha a pro-or an anti-apoptotic［Ｊ］.ProteinBiochem Pharmacol， 2002， 64(8): 89-92.
［31］ Helton R，Cui JK， R.Scheel J. Brain-specific knock-out of hypoxia-inducible factor-1 reduces rather than increases hypoxic-ischemic damage［Ｊ］. J Neurosci， 2005， 25(16):4099-4107.
［32］ Althaus J， Bernaudin M， Petit E. Expression of the gene encoding the pro-apoptotic BNIP3 protein and stimulation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) protein following focal cerebral ischemia in rats［Ｊ］. Neurochem Int， 2006， 48(8): 687-695.
［33］ Ueno M， Tomita S， Masaaki U. Two pathways of apoptosis are simultaneously induced in the embryonal brains of neural cell-specific HIF-1-deficient mice［Ｊ］. Histochem Cell Biol， 2006（125）: 535-544.
［34］ Baranova O， F.Miranda L， Pichiule P. Neuron-specific inactivation of the hypoxia inducible factor 1α increases brain injury in a mouse model of transient focal cerebral ischemia［Ｊ］. J Neurosci， 2007， 27(23): 6320-6332.
［35］ Cramer T， Yamanishi Y， Clausen B. HIF-1is essential for myeloid cell-mediated inflammation［Ｊ］. Cell， 2003（112）: 645-657.
［36］ Ockaili R， Natarajan R， Salloum F. HIF-1 activation attenuates post-ischemic myocardial injury: Role for heme oxygenase-1 in modulatingmicrovascular chemokine generation［Ｊ］. J Appl Physiol， 2007（102）: 1927-1935.
［37］ Mojsilovic-Petrovic J， Callaghan D， Cui H. Hypoxia-Inducible-Factor-1(HIF-1) is involved in the regulation of hypoxia-stimulated expression of monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1/CCL2) and MCP-5(Ccl12) in astrocytes［Ｊ］. J Neuroimmunol， 2007（4）:12.
［38］ Makino YC， Nakamura H， Ikeda E. Hypoxia-Inducible Factor regulates survival of antigen receptor-driven T Cells［Ｊ］. J Immunol， 2003（171）: 6534-6540.
［39］ Zhang WD， Petrovic JM， Callaghan D. Evidence that hypoxia-inducible factor-1(HIF-1) mediates transcriptional activation of interleukin-1(IL-1β) in astrocyte cultures［Ｊ］. J Neuroimmunol， 2006（174）: 63-73.
［40］ Frede S， Stockmann C， Freitag P. Bacterial lipopolysaccharide induces HIF-1 activation in human monocytes via p44/42 MAPK and NF-κB［Ｊ］. Biochem J， 2006（396）: 517-527.
［41］ Nakamura H， Makino Y， Okamoto K. TCR engagement increases Hypoxia-inducible-factor-1α protein synthesis via rapamycin-sensitive pathway under hypoxic conditions in human peripheral T Cells［Ｊ］. J Immunol， 2005（174）: 7592-7599.
［42］ 季秋虹， 顾永健， 朱俐. 刺五加皂甙保护PC12 细胞活性与缺氧诱导因子1 的表达［J］. 中国临床康复， 2006， 10(43): 92-95.
［43］ 朱永林， 刘其强， 杨伟琴. 复方丹参片对慢性脑缺血大鼠脑内HIF-1 表达的影响［J］. 实用神经病， 2005， 118(15): 18-19.
［44］ 朱俐， 吴小梅， 李建成. 银杏内酯对原代培养神经元缺氧诱导因子-1 基因表达的影响［Ｊ］. 中国应用生理学， 2004， 20(4): 354-357.
［45］ 张京. 大剂量黄芪注射液治疗缺血性脑卒中临床分析［Ｊ］. 中西医结合心脑血管病， 2004， 2(4): 205-207.
［46］ 窦常胜，周名雄，张士发. 黄芪注治疗新生儿缺氧缺血性脑病的临床与机理研究 ［J］.皖南医学院学报， 2004， 23(4): 258-260.
［47］ 周萍. 葛根素黄芪注射液治疗椎－基底动脉供血不足［J］. 医药论坛， 2004， 25(22):17-18.
［48］ 刘景峰， 曲雅文. 当归注射液刺激神经干治疗脑梗塞后遗症的临床观察［J］. 中医药学刊， 2006（24）:1495-1496.
［49］ 苗明三， 方晓艳. 当归补血汤多糖对大鼠血虚模型血清IL22， IL26，EPO水平的影响［J］. 中国现代应用药学， 2004， 21(3): 179-181.
(责任编辑：杜 靖)