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【摘要】目的:规范血站冷沉淀凝血因子中纤维蛋白原的检测方法,简化操作步骤,提高准确性。方法:根据Von Clauss法的原理,结合冷沉淀凝血因子中纤维蛋白原的浓度较高特点,将待测或参比血浆稀释比例由原来的10倍稀释调整为20倍稀释。结果:纤维蛋白原的浓度对数与凝固时间的对数呈现良好的线性关系,相关系数r=-0.999,线性达到1.24~9.92g/L。结论:血站使用的半自动或全自动血凝仪,内置的纤维蛋白原检测方法为经典的Von Clauss法,但冷沉淀凝血因子中纤维蛋白原的浓度已超出其线性范围,检测前需手工稀释,将Von Clauss法进行改良后,样本无需稀释,其线性范围完全满足需求,既减少了试验步骤,又减少了因手工稀释带来的误差,提高了准确性。
【关键词】改良Von Clauss法 冷沉淀凝血因子 纤维蛋白原
随着输血医学的不断发展,冷沉淀凝血因子的临床应用倍受国内外医学界的重视[1]。冷沉淀凝血因子中含Ⅷ因子、纤维蛋白原、纤维结合蛋白、血管性血友病因子等,目前广泛应用于甲型血友病、血管性假性血友病、纤维蛋白缺乏症、DIC、烧伤以及其他出血性疾病的治疗。冷沉淀凝血因子中Ⅷ因子和纤维蛋白原含量是直接影响治疗效果的重要因素,以2个单位的冷沉淀凝血因子为例,GB 18469-2012《全血及成分血质量要求》中要求纤维蛋白原含量≥150mg,Ⅷ因子含量≥80IU[2]。血站质控科每月都会对按照制备量的1%或至少4袋进行抽样检测[3],离心法制备的冷沉淀凝血因子容量为20~30ml,纤维蛋白原浓度一般至少在5g/L以上。传统的检测方法为将样本进行稀释后检测,为了更好地对冷沉淀凝血因子中的纤维蛋白原进行质量控制,保证准确性,现对Von Clauss试验方法进行改良,报道如下:
1材料与方法
1.1材料
希森美康生物科技(无锡)有限公司提供的纤维蛋白原测定试剂、TC缓冲液,希森美康医用电子(上海)有限公司提供的CA CLEAN I、标准血浆。
1.2仪器
全自动血凝仪(制造商:希森美康,型号:CA-510)
1.3方法
1.3.1准备试剂:按试剂说明书要求复溶纤维蛋白原测定试剂和标准血浆。
1.3.2方法设置:在仪器主界面依次按“Setting”“Analysis Setting”“Test Protocol”“Fbg”,此时“End Point”设置为50%,“Sensitivity.”设置为High Gain,“SampleVol”设置为5μl,“Dil.Vol.”设置为95μl,“Reagent 1”设置为180sec,“Reag.Vol.”设置为50μl,“Post.Rinse”设置为“1”,其他设置不变,按“Fix”保存。
1.3.3 标准曲线的设定:将各试剂按位置放好,复溶好的标准血浆放到“1号”标本位。在仪器主界面依次按“Standard Curve”“Select Test”“Fbg”“Standard Analysis”,连续按“Select Dil.Set”选择第11种稀释模式,“Replic.”调成2次,在“Fbg”处按标准血浆说明书键入靶值浓度,按“Start”开始定标。
2结果
相关系数r=-0.999,线性范围1.24~9.92g/L,表明纤维蛋白原浓度对数与凝固时间的对数呈很好的线性关系,且线性范围适合测定冷沉淀凝血因子中的纤维蛋白原。
3讨论
几乎所有的血凝仪都是针对临床实验室设计的,Von Clauss法为经典的测定纤维蛋白原方法,依据健康人群血浆中纤维蛋白原含量设计的稀释比例,即10倍稀释,10μl样本与90μlTC缓冲液混合后37℃预热3分钟,再加入50μl的凝血酶(纤维蛋白原测定试剂),然后仪器判定凝固时间,一般都取50%凝固点时间为凝固时间,因为“S型”凝固曲线此时最为敏感,纤维蛋白原的浓度对数和凝固时间的对数呈线性关系。笔者根据血站的实际工作需要,对上述方法进行改良,改为20倍稀释,即5μl样本与95μl TC缓冲液混合,其他步骤没变,该型号的血凝仪加样灵敏度为1μl,完全满足准确度需求,减少了手工预稀释带来的误差,提高了准确性。血凝仪在定标时大多提供多个稀释模式,笔者也尝试了在未改变稀释倍数的前提下,在定标时,选择较小稀释倍数的模式,即线性范围适合较高纤维蛋白原浓度的曲线,结果纤维蛋白原的浓度对数和凝固时间的对数的线性关系很差,r值不理想。其原因为在测定浓度较高的点时,凝固时间很短,只有几秒,因此两对数之间线性很差。更改了方法学里的稀释倍数后,重新定标解决了这一问题,对Ⅷ因子的检测也用类似的思路加以改进,成分血液和正常血浆中的一部分检测项目的浓度有很大差别,而大多数的仪器设备、试剂都是针对临床的,相对于血站来说,只有我们不断的改进方法,才能找到适合成分血液检测的新思路。
参考文献:
[1]毕绍华,李永志,等.冷沉淀制剂治疗Ⅱ度烧伤的临床观察[J].中国输血杂志,2007,20(3):31.
[2]GB 18469-2012,全血及成分血质量要求[S].
[3]卫医政发〔2012〕1号附件,血站技术操作规程[S].
【关键词】改良Von Clauss法 冷沉淀凝血因子 纤维蛋白原
随着输血医学的不断发展,冷沉淀凝血因子的临床应用倍受国内外医学界的重视[1]。冷沉淀凝血因子中含Ⅷ因子、纤维蛋白原、纤维结合蛋白、血管性血友病因子等,目前广泛应用于甲型血友病、血管性假性血友病、纤维蛋白缺乏症、DIC、烧伤以及其他出血性疾病的治疗。冷沉淀凝血因子中Ⅷ因子和纤维蛋白原含量是直接影响治疗效果的重要因素,以2个单位的冷沉淀凝血因子为例,GB 18469-2012《全血及成分血质量要求》中要求纤维蛋白原含量≥150mg,Ⅷ因子含量≥80IU[2]。血站质控科每月都会对按照制备量的1%或至少4袋进行抽样检测[3],离心法制备的冷沉淀凝血因子容量为20~30ml,纤维蛋白原浓度一般至少在5g/L以上。传统的检测方法为将样本进行稀释后检测,为了更好地对冷沉淀凝血因子中的纤维蛋白原进行质量控制,保证准确性,现对Von Clauss试验方法进行改良,报道如下:
1材料与方法
1.1材料
希森美康生物科技(无锡)有限公司提供的纤维蛋白原测定试剂、TC缓冲液,希森美康医用电子(上海)有限公司提供的CA CLEAN I、标准血浆。
1.2仪器
全自动血凝仪(制造商:希森美康,型号:CA-510)
1.3方法
1.3.1准备试剂:按试剂说明书要求复溶纤维蛋白原测定试剂和标准血浆。
1.3.2方法设置:在仪器主界面依次按“Setting”“Analysis Setting”“Test Protocol”“Fbg”,此时“End Point”设置为50%,“Sensitivity.”设置为High Gain,“SampleVol”设置为5μl,“Dil.Vol.”设置为95μl,“Reagent 1”设置为180sec,“Reag.Vol.”设置为50μl,“Post.Rinse”设置为“1”,其他设置不变,按“Fix”保存。
1.3.3 标准曲线的设定:将各试剂按位置放好,复溶好的标准血浆放到“1号”标本位。在仪器主界面依次按“Standard Curve”“Select Test”“Fbg”“Standard Analysis”,连续按“Select Dil.Set”选择第11种稀释模式,“Replic.”调成2次,在“Fbg”处按标准血浆说明书键入靶值浓度,按“Start”开始定标。
2结果
相关系数r=-0.999,线性范围1.24~9.92g/L,表明纤维蛋白原浓度对数与凝固时间的对数呈很好的线性关系,且线性范围适合测定冷沉淀凝血因子中的纤维蛋白原。
3讨论
几乎所有的血凝仪都是针对临床实验室设计的,Von Clauss法为经典的测定纤维蛋白原方法,依据健康人群血浆中纤维蛋白原含量设计的稀释比例,即10倍稀释,10μl样本与90μlTC缓冲液混合后37℃预热3分钟,再加入50μl的凝血酶(纤维蛋白原测定试剂),然后仪器判定凝固时间,一般都取50%凝固点时间为凝固时间,因为“S型”凝固曲线此时最为敏感,纤维蛋白原的浓度对数和凝固时间的对数呈线性关系。笔者根据血站的实际工作需要,对上述方法进行改良,改为20倍稀释,即5μl样本与95μl TC缓冲液混合,其他步骤没变,该型号的血凝仪加样灵敏度为1μl,完全满足准确度需求,减少了手工预稀释带来的误差,提高了准确性。血凝仪在定标时大多提供多个稀释模式,笔者也尝试了在未改变稀释倍数的前提下,在定标时,选择较小稀释倍数的模式,即线性范围适合较高纤维蛋白原浓度的曲线,结果纤维蛋白原的浓度对数和凝固时间的对数的线性关系很差,r值不理想。其原因为在测定浓度较高的点时,凝固时间很短,只有几秒,因此两对数之间线性很差。更改了方法学里的稀释倍数后,重新定标解决了这一问题,对Ⅷ因子的检测也用类似的思路加以改进,成分血液和正常血浆中的一部分检测项目的浓度有很大差别,而大多数的仪器设备、试剂都是针对临床的,相对于血站来说,只有我们不断的改进方法,才能找到适合成分血液检测的新思路。
参考文献:
[1]毕绍华,李永志,等.冷沉淀制剂治疗Ⅱ度烧伤的临床观察[J].中国输血杂志,2007,20(3):31.
[2]GB 18469-2012,全血及成分血质量要求[S].
[3]卫医政发〔2012〕1号附件,血站技术操作规程[S].