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摘 要：现行农业部1063号公告-6—2008，农业部1629号公告-1—2011，NY/T 3145—2017等检测标准都是使用外标法对饲料中的β-受体激动剂进行检测，而外标法在检测饲料中β-受体激动剂时所测数值有一定的误差。基于此，课题组应用内标法对β-受体激动剂进行测试。内标法的优点是结果更准确，可以消除操作条件等变化引起的误差。对饲料中的β-受体激动剂提取液进行优化，克服了原提取液中盐酸易挥发且腐蚀性强的缺点。
关键词：饲料;β-受体激动剂;液相色谱质谱联用法;内标法;提取液优化
近年来，随着生活水平的提高，我国居民的饮食习惯转向追求饮食的健康均衡，因此脂肪含量较低的瘦肉获得更多青睐。但是国内外频发的食品污染和中毒事件，使食品安全问题成为消费者、政府等关注的焦點问题。其中β-受体激动剂的残留一直是肉制品安全的难题，它不仅影响我国的畜牧产品的出口贸易，还威胁着消费者的健康，因此该类药物逐渐被禁止用于畜禽生产[1]。
β-受体激动剂[2]是肾上腺素类、β激动剂、β兴奋剂等一类药物的统称，当以超过治疗剂量5-10倍的用量用于家畜饲养时，会干扰胰岛素的释放，加快体内糖原和脂肪的分解[3]，从而能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，带来更多经济价值。但它对人体有很危险的副作用，对于患有高血压、心脏病、甲亢和前列腺肥大等疾病的人影响和危害更大，严重者可危及生命[4]。中国农业部1997年发文禁止瘦肉精在饲料和畜牧生产中使用，2001年12月27日、2002年2月9日、4月9日，农业部分别下发文件禁止使用β-受体激动剂类药物作为饲料添加剂。尽管国家针对瘦肉精问题明令禁止，但是在利益的驱动下，β-受体激动剂仍被大量非法用于畜牧生产[5]，动物性食品中因而出现了不同程度的药物残留。β-受体激动剂残留问题导致了许多食物中毒事件，所以需要从源头抓起，做好饲料中“瘦肉精”
（β-受体激动剂）的检测，杜绝瘦肉精在养殖过程中的使用，从根本上杜绝该类添加剂的有害残留。
β-受体激动剂在食品中残留会对人体产生危害，对其准确、快速地检测非常重要，从国家到地方政府都非常重视。现行农业部1063号公告-6—2008、农业部1629号公告-1—2011、NY/T 3145—2017等检测标准都是使用外标法对饲料中的β-受体激动剂进行检测，由于在饲料中提取β-受体激动剂存在一定的缺陷，所以外标法所测数值有一定的误差。针对这个问题本课题组应用内标法对β-受体激动剂进行测试，内标法的优点是结果更准确，可以消除操作条件等变化引起的误差。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甲醇、甲酸均为色谱纯;浓盐酸、磷酸、醋酸、三氟乙酸、氨水和醋酸铅均为分析纯;MCX混合型阳离子交换柱（60 mg/3 mL）;标准物质沙丁胺醇，购自中国食品药品检定研究院;莱克多巴胺、、盐酸克伦特罗、同位素内标物莱克多巴胺-D9和沙丁胺醇-D3，均购自北京坛墨质检科技有限公司，纯度均≥98%;实验用水由纯水仪制备，德国赛多利斯Sartorius公司。
1.2 仪器与设备
液相色谱-串联质谱仪由1100液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）API 4000三重四级杆串联质谱仪（美国AB SCIEX公司）组成，其他仪器设备包括TD10002C电子天平、RE-52A旋转蒸发器、QL-901旋涡混合器、水浴恒温振荡器、超低温离心机、CM-12氮吹仪和SPE-24固相萃取装置。
1.3 标准溶液配制
1.3.1 外标法标准溶液的配制
标准物质选取了莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇，用甲醇配制成1 μg·mL-1的混标储备液，避光冷藏保存。
1.3.2 内标法标准溶液的配制
内标物选取了莱克多巴胺-D9、沙丁胺醇-D3，用甲醇配制成100 μg/mL的混标储备液，避光冷藏保存。
1.4 方法
1.4.1 提取液
配制了4种不同提取液，分别为盐酸-甲醇提取液、磷酸-甲醇提取液、醋酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液，分别取0.1 mol/L盐酸、磷酸、醋酸和三氟乙酸溶液80 mL，再分别加入甲醇20 mL混匀。
1.4.2 提取方法
分别称取2 g左右粉碎过筛好的饲料样品，于50 mL离心管中，准确加入19 mL提取液和1 mL饱和醋酸铅溶液，涡旋混合30 s，超声提取10 min，再涡旋混合30 s，超声提取10 min，然后于8 000 r/min离心10 min，取上清液备用。
1.4.3 净化
先将MCX固相萃取小柱，依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，取上清液5 mL过柱，用2 mL水和2 mL甲醇依次淋洗，空气抽干2 min，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发（40 ℃）至干，用1.0 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，过0.22 μm有机滤膜后，待上机测定。
1.4.4 色谱条件
色谱柱：C18柱，150 mm×2.1 mm，粒度3.5 μm（2020-SPZ-07-01），柱温：40 ℃，进样体积：5 μL，流动相A：甲醇，流动相B：0.2%甲酸水溶液，流速：0.3 mL/min，梯度洗脱程序见表1。
1.4.5 质谱条件
扫描方式：正离子扫描;监测方式：MRM多反应监测，MRM参数见表2;喷雾电压：5 500 V;气体温度：550 ℃。
2 结果与分析
2.1 内外标法的优化
称取2 g左右空白饲料样品，分为两组，一组加入10 μg/kg莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇的标准物质混合液，另一组加入等量标准物质混合液后，再加入等量的莱克多巴胺-D9、沙丁胺醇-D3混标储备液。加标后采用盐酸-甲醇提取液的方式进行前处理，设置空白对照，测定3种β-受体激动剂的回收率和精密度。从表3中可以看出，外标法测定的回收率为77.0%、77.2%、77.5%，内标法测定的回收率为102.5%、103.2%、100.2%。结果表明，内标法的回收率较外标法有显著提高，精密度良好，检测结果更接近于真值。 2.2 提取方法的优化
称取2 g左右空白饲料样品分为4组，均加入等量内标混标储备液和10 μg/kg外标混标储备液，即采用内标法，加标后分别加入4种不同的提取液，即盐酸-甲醇提取液、磷酸-甲醇提取液、醋酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液，按照上述的前处理方式进行处理，同时设置空白对照，测定4种不同提取液处理后的β-受体激动剂的回收率和精密度。从表4中可以看出，盐酸-甲醇提取液处理后的回收率为99.5%、99.4%、98.1%，磷酸-甲醇提取液回收率为82.8%、82.8%、96.2%，醋酸-甲醇提取液回收率为90.5%、87.0%、98.5%，三氟乙酸-甲醇提取液回收率为82.9%、81.0%、94.8%。浓盐酸-甲醇提取液的回收率最好，但浓盐酸易挥发，且腐蚀性强;醋酸-甲醇提取液的回收率稍逊于盐酸-甲醇提取液，但相对挥发性小，没有腐蚀性，较安全;磷酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液的回收率相对较低，因此最终选择醋酸-甲醇作为提取饲料中β-受体激动剂的提取液。
3 结论
实验结果表明，内标法的回收率较外标法有显著提高，精密度良好，检测结果更接近于真值。设计不同的提取液对饲料中的β-受体激动剂进行提取，结果表明，浓盐酸-甲醇提取液的回收率最好，但浓盐酸易挥发，且腐蚀性强;醋酸-甲醇提取液的回收率稍逊于盐酸-甲醇提取液，但相对挥发性小，没有腐蚀性，较安全;磷酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液的回收率相对较低，最终选择醋酸-甲醇作为提取饲料中β-受体激动剂的提取液。虽然我国在食品安全领域逐渐加大了监管力度，并建立了数量众多的各级食品检测中心，但β-受体激动剂作为廉价的促进动物生长剂仍有不法分子会使用，所以有必要继续开发灵敏度高、检测速度快、准确度高的检测方法。
参考文献
[1]SHAO B，JIA X F，ZHANG J，et al.Multi-residual analysis of 16 β-agonists in pig liver， kidney and muscle by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Food Chemistry ，2009，114（3）：1115-1121.
[2]LIU R，LIU L Q，SONG S S，et al.Development of an immunochromatographic strip for the rapid detection of 10 β-agonists based on an ultrasensitive monoclonal antibody[J].Food and A gricultural Immunology，2017，28（4）：1-14.
[3]王培龙.β-受体激动剂及其检测技术研究[J].农产品质量与安全，2014（1）：44-52.
[4]刘敏，刘戎，王立琦，等.猪肝中β-受体激动剂多残留的样品前处理方法比较及同时检测[J].分析测试学报，2012，31（3）：290-295.
[5]顾亮，丁磊.液相色谱串联质谱法测定饲料中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A[J].化學分析计量，2012，21（1）：37-39.
关键词：饲料;β-受体激动剂;液相色谱质谱联用法;内标法;提取液优化
近年来，随着生活水平的提高，我国居民的饮食习惯转向追求饮食的健康均衡，因此脂肪含量较低的瘦肉获得更多青睐。但是国内外频发的食品污染和中毒事件，使食品安全问题成为消费者、政府等关注的焦點问题。其中β-受体激动剂的残留一直是肉制品安全的难题，它不仅影响我国的畜牧产品的出口贸易，还威胁着消费者的健康，因此该类药物逐渐被禁止用于畜禽生产[1]。
β-受体激动剂[2]是肾上腺素类、β激动剂、β兴奋剂等一类药物的统称，当以超过治疗剂量5-10倍的用量用于家畜饲养时，会干扰胰岛素的释放，加快体内糖原和脂肪的分解[3]，从而能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，带来更多经济价值。但它对人体有很危险的副作用，对于患有高血压、心脏病、甲亢和前列腺肥大等疾病的人影响和危害更大，严重者可危及生命[4]。中国农业部1997年发文禁止瘦肉精在饲料和畜牧生产中使用，2001年12月27日、2002年2月9日、4月9日，农业部分别下发文件禁止使用β-受体激动剂类药物作为饲料添加剂。尽管国家针对瘦肉精问题明令禁止，但是在利益的驱动下，β-受体激动剂仍被大量非法用于畜牧生产[5]，动物性食品中因而出现了不同程度的药物残留。β-受体激动剂残留问题导致了许多食物中毒事件，所以需要从源头抓起，做好饲料中“瘦肉精”
（β-受体激动剂）的检测，杜绝瘦肉精在养殖过程中的使用，从根本上杜绝该类添加剂的有害残留。
β-受体激动剂在食品中残留会对人体产生危害，对其准确、快速地检测非常重要，从国家到地方政府都非常重视。现行农业部1063号公告-6—2008、农业部1629号公告-1—2011、NY/T 3145—2017等检测标准都是使用外标法对饲料中的β-受体激动剂进行检测，由于在饲料中提取β-受体激动剂存在一定的缺陷，所以外标法所测数值有一定的误差。针对这个问题本课题组应用内标法对β-受体激动剂进行测试，内标法的优点是结果更准确，可以消除操作条件等变化引起的误差。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甲醇、甲酸均为色谱纯;浓盐酸、磷酸、醋酸、三氟乙酸、氨水和醋酸铅均为分析纯;MCX混合型阳离子交换柱（60 mg/3 mL）;标准物质沙丁胺醇，购自中国食品药品检定研究院;莱克多巴胺、、盐酸克伦特罗、同位素内标物莱克多巴胺-D9和沙丁胺醇-D3，均购自北京坛墨质检科技有限公司，纯度均≥98%;实验用水由纯水仪制备，德国赛多利斯Sartorius公司。
1.2 仪器与设备
液相色谱-串联质谱仪由1100液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）API 4000三重四级杆串联质谱仪（美国AB SCIEX公司）组成，其他仪器设备包括TD10002C电子天平、RE-52A旋转蒸发器、QL-901旋涡混合器、水浴恒温振荡器、超低温离心机、CM-12氮吹仪和SPE-24固相萃取装置。
1.3 标准溶液配制
1.3.1 外标法标准溶液的配制
标准物质选取了莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇，用甲醇配制成1 μg·mL-1的混标储备液，避光冷藏保存。
1.3.2 内标法标准溶液的配制
内标物选取了莱克多巴胺-D9、沙丁胺醇-D3，用甲醇配制成100 μg/mL的混标储备液，避光冷藏保存。
1.4 方法
1.4.1 提取液
配制了4种不同提取液，分别为盐酸-甲醇提取液、磷酸-甲醇提取液、醋酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液，分别取0.1 mol/L盐酸、磷酸、醋酸和三氟乙酸溶液80 mL，再分别加入甲醇20 mL混匀。
1.4.2 提取方法
分别称取2 g左右粉碎过筛好的饲料样品，于50 mL离心管中，准确加入19 mL提取液和1 mL饱和醋酸铅溶液，涡旋混合30 s，超声提取10 min，再涡旋混合30 s，超声提取10 min，然后于8 000 r/min离心10 min，取上清液备用。
1.4.3 净化
先将MCX固相萃取小柱，依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，取上清液5 mL过柱，用2 mL水和2 mL甲醇依次淋洗，空气抽干2 min，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发（40 ℃）至干，用1.0 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，过0.22 μm有机滤膜后，待上机测定。
1.4.4 色谱条件
色谱柱：C18柱，150 mm×2.1 mm，粒度3.5 μm（2020-SPZ-07-01），柱温：40 ℃，进样体积：5 μL，流动相A：甲醇，流动相B：0.2%甲酸水溶液，流速：0.3 mL/min，梯度洗脱程序见表1。
1.4.5 质谱条件
扫描方式：正离子扫描;监测方式：MRM多反应监测，MRM参数见表2;喷雾电压：5 500 V;气体温度：550 ℃。
2 结果与分析
2.1 内外标法的优化
称取2 g左右空白饲料样品，分为两组，一组加入10 μg/kg莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇的标准物质混合液，另一组加入等量标准物质混合液后，再加入等量的莱克多巴胺-D9、沙丁胺醇-D3混标储备液。加标后采用盐酸-甲醇提取液的方式进行前处理，设置空白对照，测定3种β-受体激动剂的回收率和精密度。从表3中可以看出，外标法测定的回收率为77.0%、77.2%、77.5%，内标法测定的回收率为102.5%、103.2%、100.2%。结果表明，内标法的回收率较外标法有显著提高，精密度良好，检测结果更接近于真值。 2.2 提取方法的优化
称取2 g左右空白饲料样品分为4组，均加入等量内标混标储备液和10 μg/kg外标混标储备液，即采用内标法，加标后分别加入4种不同的提取液，即盐酸-甲醇提取液、磷酸-甲醇提取液、醋酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液，按照上述的前处理方式进行处理，同时设置空白对照，测定4种不同提取液处理后的β-受体激动剂的回收率和精密度。从表4中可以看出，盐酸-甲醇提取液处理后的回收率为99.5%、99.4%、98.1%，磷酸-甲醇提取液回收率为82.8%、82.8%、96.2%，醋酸-甲醇提取液回收率为90.5%、87.0%、98.5%，三氟乙酸-甲醇提取液回收率为82.9%、81.0%、94.8%。浓盐酸-甲醇提取液的回收率最好，但浓盐酸易挥发，且腐蚀性强;醋酸-甲醇提取液的回收率稍逊于盐酸-甲醇提取液，但相对挥发性小，没有腐蚀性，较安全;磷酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液的回收率相对较低，因此最终选择醋酸-甲醇作为提取饲料中β-受体激动剂的提取液。
3 结论
实验结果表明，内标法的回收率较外标法有显著提高，精密度良好，检测结果更接近于真值。设计不同的提取液对饲料中的β-受体激动剂进行提取，结果表明，浓盐酸-甲醇提取液的回收率最好，但浓盐酸易挥发，且腐蚀性强;醋酸-甲醇提取液的回收率稍逊于盐酸-甲醇提取液，但相对挥发性小，没有腐蚀性，较安全;磷酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液的回收率相对较低，最终选择醋酸-甲醇作为提取饲料中β-受体激动剂的提取液。虽然我国在食品安全领域逐渐加大了监管力度，并建立了数量众多的各级食品检测中心，但β-受体激动剂作为廉价的促进动物生长剂仍有不法分子会使用，所以有必要继续开发灵敏度高、检测速度快、准确度高的检测方法。
参考文献
[1]SHAO B，JIA X F，ZHANG J，et al.Multi-residual analysis of 16 β-agonists in pig liver， kidney and muscle by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Food Chemistry ，2009，114（3）：1115-1121.
[2]LIU R，LIU L Q，SONG S S，et al.Development of an immunochromatographic strip for the rapid detection of 10 β-agonists based on an ultrasensitive monoclonal antibody[J].Food and A gricultural Immunology，2017，28（4）：1-14.
[3]王培龙.β-受体激动剂及其检测技术研究[J].农产品质量与安全，2014（1）：44-52.
[4]刘敏，刘戎，王立琦，等.猪肝中β-受体激动剂多残留的样品前处理方法比较及同时检测[J].分析测试学报，2012，31（3）：290-295.
[5]顾亮，丁磊.液相色谱串联质谱法测定饲料中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A[J].化學分析计量，2012，21（1）：37-39.