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摘 要 植物受体类激酶在植物的生长发育和抗逆等生理过程中起着重要作用。在橡胶树转录组测序的基础上，通过RACE技术和RT-PCR方法，扩增得到橡胶树的一个类受体激酶基因的全长，命名为HbFER。该片段包含1个2 679 bp的开放阅读框，可编码892个氨基酸。生物信息学分析结果表明：该氨基酸序列与拟南芥、番茄、甘蓝和杨树的FER蛋白高度同源，其同源性分别为74.5%、74.7%、73.4%、82.9%。HbFER蛋白除了含有Malectin_like和PTKc结构域外，还含有1个信号肽（含22个氨基酸）和2个跨膜结构域。半定量分析结果表明，HbFER基因在不同组织中的表达水平存在差异，叶片和花中的表达丰度最高，胶乳中的表达丰度最低，且该基因在叶片中的表达受植物激素水杨酸的诱导。
关键词 巴西橡胶树；FERONIA类受体激酶；表达分析
中图分类号 S794.1 文献标识码 A
Abstract The receptor-like kinases play important roles in the physiological processes of plant growth and stress resistances. Based on the result from the transcriptome sequencing and the data of RNA-Seq analysis in Hevea brasiliensis，the homolog of rubber FERONIA was cloned by RT-PCR and RACE named as HbFER. The sequencing result showed that the ORF of HbFER is 2 679 bp， encoding an 892 amino acids peptide with a 24 aa signal peptide， two transmembrane domains and two conserved domains， Malectin_like and PTKc， similar with FER from other plants. Bioinformatics analysis showed that the amino acid sequence of the HbFER is 74.5%， 74.7%， 73.4%and 82.9% similar with that of FER from Arabidopsis thaliana， Solanum lycopersicum， Brassica oleracea and Populus tomentosa， respectively. Semi-quantitative RT-PCR analysis showed that the expression level of HbFER is significantly higher in leaves and flowers than in other tissues. Additionally phytohormone salicylic acid can induce the expression of HbFER in the leaf.
Key words Hevea brasiliensis；FERONIA-like RLK；Expression assay
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.017
作为细胞表面受体，类受体激酶（Receptor-like kinases，RLKs）在植物生长发育、器官生成及在抵抗环境胁迫和抗病免疫反应中起着重要作用[1-5]。一个典型的RLK蛋白在结构上除了含有一个信号序列外，还包含有胞外结构域、跨膜域和一个胞内蛋白激酶域[6]，可通过其胞外域接受信号，然后通过胞内激酶域把该信号传递给细胞[7]。根据胞外结构域的特点，RLKs可分为21个亚家族[8]，其中Catharanthus roseus RLKl（CrRLKl）-like RLKs（CrRLK）是一个较小的亚家族，为植物所特有[9]。该亚家族成员广泛分布于被子植物中，如在水稻、拟南芥、葡萄、辣椒、金鱼草、小立碗藓等物种中都有发现，其中单子叶模式植物水稻中有20个，双子叶模式植物拟南芥中有17个[10-14]。该亚家族成员在结构上具有独特的特点，其胞外域均含有6个保守基序motif，分别为motif1-6，其中motif5含有非洲爪蟾蛋白Malectin的糖结合序列。此外还有一个C端保守的motif7，但该序列的功能未知[9]。
FERONIA类受体激酶属于CrRLK家族的成员，在植物的生长发育和抗胁迫过程中具有重要的生物学功能[10， 15-18]。拟南芥中的FER基因是第一个被确定功能的CrRLK家族成员，在拟南芥的有性生殖、细胞伸长和植物抗病免疫反应过程中起着关键作用。在拟南芥中，该基因功能的缺失将导致雌雄配子体信息交流出现障碍，不能正常受精[10，16]。水稻中的研究也得到相似的结果[9]。FER基因还参与调控植物营养生长期的细胞伸长，如人工小RNA干涉的FER突变体表现为植株矮小，叶片和叶柄变短，进一步研究发现其作用机制不依赖于已知的激素调节细胞伸长的信号途径[11，19]。FER作为 RAC/ROP-信号途径的上游调节蛋白调控植物的根毛发育[20]。最近的研究结果还发现，FER类受体激酶可激发植物细胞活性氧的产生[21]，并且在真菌侵染过程中发挥作用。拟南芥FER基因的T-DNA插入突变体对白粉病的抗性提高[17]。
在植物抗病性中，除了R基因介导的转化抗病性外，还有一套可诱导的抗病机制，即植物诱导抗病性。其中的系统获得性抗性（System acquired resistance， SAR）是植物受病原物的局部侵染后诱导非侵染部位产生的抗病性，因为具有非专化性、系统性和长效性的特点受到人们的重视[22]。已有的研究结果表明，SA是介导SAR的重要信号分子[23]，与SA结构类似的化合物（如苯并噻二唑和二氯异烟酸）都能够诱导产生SAR反应，并常常伴随着病程相关蛋白（Pathogenesis-related protein， PRs）基因的协同表达[24]。橡胶树中也能产生SAR反应。用化学诱导剂苯并噻二唑处理橡胶叶片后，橡胶对炭疽病的抗性增强，这表明BTH 可诱导橡胶树对炭疽病产生系统获得性抗性[25]。用SA处理橡胶树叶片后，病程相关蛋白基因PR1和PR5的表达增强[26-27]，但对其相关机制的研究不多。 在橡胶树中关于HbFER基因的研究尚未见报道。本研究克隆了橡胶树中与FERONIA类受体激酶同源的基因，将其命名为HbFER，并对其基因结构和表达模式进行了初步分析，为进一步研究该基因的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用植物材料为巴西橡胶树品种热研7-33-97（Hevea brasiliensis Reyan 7-33-97）。SA购自Sigma公司，大肠杆菌菌株为DH5α，反转录试剂盒购自Thermo公司，用于PCR反应的试剂、凝胶回收试剂盒等均购自博麦德科技有限公司，限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Fermentas公司，5′RACE试剂盒购于TAKARA公司，引物合成及序列测定均由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 橡胶树不同组织总RNA的提取 橡胶树叶片总RNA的提取采用改良的LiCl沉淀法，具体步骤见Verwoerd等[28]的方法。橡胶树胶乳总RNA的提取采用Tang等[29]的提取方法；其他组织RNA的提取参照Kiefer等[30]的提取方法。
1.2.2 第一链cDNA的合成及同源片段的扩增 以橡胶树总RNA样品为模板，按照thermo反转录试剂盒操作说明进行反转录反应合成第一链cDNA。根据橡胶树转录组数据库中获得的EST片段设计PCR特异性引物，以第一链合成cDNA为模板扩增得到橡胶树FER基因的片段，经连接、转化、鉴定后进行测序。
1.2.3 5′RACE扩增获取基因全长 按照TaKaRa公司的5′Full RACE试剂盒说明对橡胶树总RNA进行去磷酸化处理，然后去掉mRNA的5′帽子结构，连接上5′RACE Adaptor，得到Ligated RNA，最后以Ligated RNA为模板反转录得到cDNA。
根据同源片端的测序结果设计特异性引物，分别命名为GSP1（ACTGGATGGTGGGAAGATGG）和GSP2（CAGTGGATAGACCGATGGGGG）。以上述得到的cDNA为模板，试剂盒提供的接头引物outer primer和inner primer为上游引物，GSP1、GSP2为下游引物，进行巢式PCR扩增。扩增得到的PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的片段割胶回收并连接到T载体进行序列测定。
1.2.4 生物信息学分析 基因的cDNA全长核苷酸序列和推测的氨基酸序列用DNASTAR软件进行分析。利用HbFER的氨基酸序列与GenBank中已经发表的一些其它植物FER的氨基酸序列进行BLAST比对，然后利用DNAMAN软件对其进行同源性比较分析。应用ExPasy在线工具ProParam和ProtScale（http：//www.expasy.org/tools）分析HbFER的理论分子量和等电点等理化参数，利用NCBI CDD数据库预测蛋白的功能结构域，利用TMHMM Server v. 2.0程序进行蛋白序列跨膜区分析，使用NetPhos2.0 Server程序对其磷酸化位点进行预测，使用软件SignalP-V4.1进行蛋白质序列的信号肽预测。
1.2.5 SA处理橡胶树叶片 配制浓度为5 mmol/L、pH5.7的SA溶液，然后喷雾处理长势良好且处于嫩绿期的橡胶树植株叶片，分别于处理0、6、12、24 h等不同时间点收集橡胶树叶片样品，置于液氮中速冻后，保存在-80 ℃备用。
1.2.6 RT-PCR半定量分析 按1.2.1方法提取不同组织和SA处理的橡胶树叶片总RNA，用DNA酶消化后进行反转录反应。以橡胶树Actin基因为内参，通过RT-PCR技术检测HbFER基因在不同处理条件下的表达情况。橡胶树内参基因Actin的引物为Actin-F（5′CAGTGGTCGTACAACTGGTAT3′）和Actin-R（5′ATCCTCCAATCCAGACACTGT3′）。反应总体系为25 μL，其中2.5 μL 10×PCR Buffer（含 Mg2+），1 μL 10 mmol/L dNTPs，引物（10 μmol/L）各加1 μL，cDNA模板稀释10倍后加1 μL，0.5 μL Taq DNA Polymerase，加ddH2O补足25 μL。HbFER扩增的PCR反应条件为：94 ℃ 5 min：94 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环后，72 ℃ 10 min。Actin扩增的PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ l min，25个循环；72 ℃ 10 min。
2 结果与分析
2.1 橡胶树HbFER基因5′RACE的扩增及cDNA全长的克隆
根据对橡胶树转录组数据库中Unigene进行生物信息学分析，结果发现该片段已含有HbFER基因的部分3′UTR序列。为了获得该基因的全长编码区，作者相继进行了2次5′RACE扩增（图1-A、B），经测序得知其长度分别为1 208 bp（含接头引物序列）和1 200 bp（含接头引物序列）。
根据2次5′RACE获得的序列结果设计引物，扩增HbFER的编码区全长序列（图1-C）。结果表明，该片段长度2 679 bp，是一个完整的开放阅读框，可编码一个含892个氨基酸的多肽。利用ExPasy在线工具ProParam（http：//web.expasy.org/protparam/）进行分析，结果表明，该基因编码的蛋白分子量为96.5 ku，等电点为6.05，为弱酸性蛋白；利用TMHMM Server v. 2.0程序进行蛋白序列跨膜区分析，发现该基因编码的蛋白含有2个跨膜结构域；利用软件SignalPV4.1预测，结果发现该蛋白的N端含有1个信号肽（含22个氨基酸）；在NCBI的CCD数据库中进行搜索，发现HbFER中含有2个保守结构域Malectin_like和PTKc，其中Malectin_like结构域位于35～405号氨基酸残基之间，PTKc位于540～802号氨基酸残基之间（图2）。 2.2 橡胶树HbFER编码的蛋白与其他植物FER蛋白的同源性比较及保守结构域分析
利用HbFER的氨基酸序列在GenBank蛋白数据库中进行BLAST比对，结果发现HbFER编码的蛋白与拟南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）和杨树（Populus tomentosa）的FER蛋白高度相似，其相似性分别为74.5%、74.7%和82.9%，其中Malectin_like和PTKc保守结构域与拟南芥、番茄和杨树中的这2个结构域高度同源。此外，分析结果还发现HbFER含有CrRLK1-L家族成员中的6个保守胞外基序（motif）（图3），其中motif5中含有类似于Malectin的糖结合序列，如LHFCE、IYLN等（图3方框标注）。胞内域除激酶域以外，C端也有一个相对保守的基序（FSQGR）。以上结果暗示，克隆的HbFER基因属于CrRLK1-L家族成员，可能具有其他植物CrRLK1类激酶相似的功能。
2.3 HbFER基因的组织表达特异性分析
通过RT-PCR半定量分析技术对HbFER基因的组织特异性表达情况进行检测，结果表明，HbFER基因在花、叶、芽、树皮和胶乳中均有表达，但其表达量有明显差异，其中在叶中的表达丰度最高，花中次之，在胶乳中的表达丰度最低，结果见图4。
2.4 SA对橡胶树叶片中HbFER基因表达的影响
SA对HbFER在叶片中表达的影响结果见图5。结果表明，叶片中的HbFER基因在6 h内被SA快速激活表达，在24 h后表达量有所降低，表明该基因能够对SA产生应答，暗示该基因可能与SA抗病信号途径相关。
3 讨论与结论
本研究克隆了巴西橡胶树HbFER基因并进行了初步的表达分析，结果表明该基因在氨基酸水平上与其他植物的FER蛋白具有高度同源性，除了包含Malectin_like和PTKc两个保守功能结构域外，还含有植物类受体激酶CrRLK1-L亚家族成员所具有的7个特有基序（包括6个保守的胞外域基序和1个C端保守基序）的特点。生物信息学研究结果发现，大多数CrRLK1-L亚家族成员的胞外域中都含有2个与Malectin蛋白的糖结合域相似[31]的区域。在HbFER蛋白的第5个胞外基序中也存在2个Malectin-like糖结合序列。这些数据说明HbFER是类受体激酶的同源基因，属于CrRLK1-L亚家族成员。
已有的研究结果表明，拟南芥FER类受体激酶除了参与花粉管和助细胞的识别、调控花粉管伸长外[10， 15-16]，还在促进营养组织细胞伸长[11]、调节气孔开度[17]等方面发挥作用。HbEFR在橡胶树不同组织中的表达分析结果显示，该基因虽然在花、叶、芽、树皮和胶乳中均能检测到表达，但在花和叶中的表达丰度明显高于其它组织，推测可能与该基因在调控花粉管伸长和气孔开度方面的生物学功能相关，而HbEFR对橡胶树花粉发育和气孔开度是否具体调控作用还需进一步的实验证实。
SA是SAR反应的重要信号分子，能够促使活性氧（Reactive oxygen species，ROS）在细胞中积累[32]，而ROS作为第二信使在SAR信号转导途径的建立中发挥重要作用[33]。据Kessler等[17]的研究结果表明，当用白粉病菌接种拟南芥fer突变体时表现抗性增强，说明FER基因参与植物的抗病反应。此外FER能够在细胞表面调节RAC/ROP GTP酶的活性并激发ROS的产生。以上研究结果暗示FER可能通过SA介导的依赖于ROS的抗病信号途径参与植物抗病反应，但在橡胶树中所依赖的信号途径还不清楚。本研究结果表明，当橡胶树用SA处理后HbFER基因上调表达，暗示HbFER基因可能通过SA信号途径参与植物的抗病反应，具体的调控机理还需进一步的研究。
参考文献
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Key words Hevea brasiliensis；FERONIA-like RLK；Expression assay
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.017
作为细胞表面受体，类受体激酶（Receptor-like kinases，RLKs）在植物生长发育、器官生成及在抵抗环境胁迫和抗病免疫反应中起着重要作用[1-5]。一个典型的RLK蛋白在结构上除了含有一个信号序列外，还包含有胞外结构域、跨膜域和一个胞内蛋白激酶域[6]，可通过其胞外域接受信号，然后通过胞内激酶域把该信号传递给细胞[7]。根据胞外结构域的特点，RLKs可分为21个亚家族[8]，其中Catharanthus roseus RLKl（CrRLKl）-like RLKs（CrRLK）是一个较小的亚家族，为植物所特有[9]。该亚家族成员广泛分布于被子植物中，如在水稻、拟南芥、葡萄、辣椒、金鱼草、小立碗藓等物种中都有发现，其中单子叶模式植物水稻中有20个，双子叶模式植物拟南芥中有17个[10-14]。该亚家族成员在结构上具有独特的特点，其胞外域均含有6个保守基序motif，分别为motif1-6，其中motif5含有非洲爪蟾蛋白Malectin的糖结合序列。此外还有一个C端保守的motif7，但该序列的功能未知[9]。
FERONIA类受体激酶属于CrRLK家族的成员，在植物的生长发育和抗胁迫过程中具有重要的生物学功能[10， 15-18]。拟南芥中的FER基因是第一个被确定功能的CrRLK家族成员，在拟南芥的有性生殖、细胞伸长和植物抗病免疫反应过程中起着关键作用。在拟南芥中，该基因功能的缺失将导致雌雄配子体信息交流出现障碍，不能正常受精[10，16]。水稻中的研究也得到相似的结果[9]。FER基因还参与调控植物营养生长期的细胞伸长，如人工小RNA干涉的FER突变体表现为植株矮小，叶片和叶柄变短，进一步研究发现其作用机制不依赖于已知的激素调节细胞伸长的信号途径[11，19]。FER作为 RAC/ROP-信号途径的上游调节蛋白调控植物的根毛发育[20]。最近的研究结果还发现，FER类受体激酶可激发植物细胞活性氧的产生[21]，并且在真菌侵染过程中发挥作用。拟南芥FER基因的T-DNA插入突变体对白粉病的抗性提高[17]。
在植物抗病性中，除了R基因介导的转化抗病性外，还有一套可诱导的抗病机制，即植物诱导抗病性。其中的系统获得性抗性（System acquired resistance， SAR）是植物受病原物的局部侵染后诱导非侵染部位产生的抗病性，因为具有非专化性、系统性和长效性的特点受到人们的重视[22]。已有的研究结果表明，SA是介导SAR的重要信号分子[23]，与SA结构类似的化合物（如苯并噻二唑和二氯异烟酸）都能够诱导产生SAR反应，并常常伴随着病程相关蛋白（Pathogenesis-related protein， PRs）基因的协同表达[24]。橡胶树中也能产生SAR反应。用化学诱导剂苯并噻二唑处理橡胶叶片后，橡胶对炭疽病的抗性增强，这表明BTH 可诱导橡胶树对炭疽病产生系统获得性抗性[25]。用SA处理橡胶树叶片后，病程相关蛋白基因PR1和PR5的表达增强[26-27]，但对其相关机制的研究不多。 在橡胶树中关于HbFER基因的研究尚未见报道。本研究克隆了橡胶树中与FERONIA类受体激酶同源的基因，将其命名为HbFER，并对其基因结构和表达模式进行了初步分析，为进一步研究该基因的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用植物材料为巴西橡胶树品种热研7-33-97（Hevea brasiliensis Reyan 7-33-97）。SA购自Sigma公司，大肠杆菌菌株为DH5α，反转录试剂盒购自Thermo公司，用于PCR反应的试剂、凝胶回收试剂盒等均购自博麦德科技有限公司，限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Fermentas公司，5′RACE试剂盒购于TAKARA公司，引物合成及序列测定均由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 橡胶树不同组织总RNA的提取 橡胶树叶片总RNA的提取采用改良的LiCl沉淀法，具体步骤见Verwoerd等[28]的方法。橡胶树胶乳总RNA的提取采用Tang等[29]的提取方法；其他组织RNA的提取参照Kiefer等[30]的提取方法。
1.2.2 第一链cDNA的合成及同源片段的扩增 以橡胶树总RNA样品为模板，按照thermo反转录试剂盒操作说明进行反转录反应合成第一链cDNA。根据橡胶树转录组数据库中获得的EST片段设计PCR特异性引物，以第一链合成cDNA为模板扩增得到橡胶树FER基因的片段，经连接、转化、鉴定后进行测序。
1.2.3 5′RACE扩增获取基因全长 按照TaKaRa公司的5′Full RACE试剂盒说明对橡胶树总RNA进行去磷酸化处理，然后去掉mRNA的5′帽子结构，连接上5′RACE Adaptor，得到Ligated RNA，最后以Ligated RNA为模板反转录得到cDNA。
根据同源片端的测序结果设计特异性引物，分别命名为GSP1（ACTGGATGGTGGGAAGATGG）和GSP2（CAGTGGATAGACCGATGGGGG）。以上述得到的cDNA为模板，试剂盒提供的接头引物outer primer和inner primer为上游引物，GSP1、GSP2为下游引物，进行巢式PCR扩增。扩增得到的PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的片段割胶回收并连接到T载体进行序列测定。
1.2.4 生物信息学分析 基因的cDNA全长核苷酸序列和推测的氨基酸序列用DNASTAR软件进行分析。利用HbFER的氨基酸序列与GenBank中已经发表的一些其它植物FER的氨基酸序列进行BLAST比对，然后利用DNAMAN软件对其进行同源性比较分析。应用ExPasy在线工具ProParam和ProtScale（http：//www.expasy.org/tools）分析HbFER的理论分子量和等电点等理化参数，利用NCBI CDD数据库预测蛋白的功能结构域，利用TMHMM Server v. 2.0程序进行蛋白序列跨膜区分析，使用NetPhos2.0 Server程序对其磷酸化位点进行预测，使用软件SignalP-V4.1进行蛋白质序列的信号肽预测。
1.2.5 SA处理橡胶树叶片 配制浓度为5 mmol/L、pH5.7的SA溶液，然后喷雾处理长势良好且处于嫩绿期的橡胶树植株叶片，分别于处理0、6、12、24 h等不同时间点收集橡胶树叶片样品，置于液氮中速冻后，保存在-80 ℃备用。
1.2.6 RT-PCR半定量分析 按1.2.1方法提取不同组织和SA处理的橡胶树叶片总RNA，用DNA酶消化后进行反转录反应。以橡胶树Actin基因为内参，通过RT-PCR技术检测HbFER基因在不同处理条件下的表达情况。橡胶树内参基因Actin的引物为Actin-F（5′CAGTGGTCGTACAACTGGTAT3′）和Actin-R（5′ATCCTCCAATCCAGACACTGT3′）。反应总体系为25 μL，其中2.5 μL 10×PCR Buffer（含 Mg2+），1 μL 10 mmol/L dNTPs，引物（10 μmol/L）各加1 μL，cDNA模板稀释10倍后加1 μL，0.5 μL Taq DNA Polymerase，加ddH2O补足25 μL。HbFER扩增的PCR反应条件为：94 ℃ 5 min：94 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环后，72 ℃ 10 min。Actin扩增的PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ l min，25个循环；72 ℃ 10 min。
2 结果与分析
2.1 橡胶树HbFER基因5′RACE的扩增及cDNA全长的克隆
根据对橡胶树转录组数据库中Unigene进行生物信息学分析，结果发现该片段已含有HbFER基因的部分3′UTR序列。为了获得该基因的全长编码区，作者相继进行了2次5′RACE扩增（图1-A、B），经测序得知其长度分别为1 208 bp（含接头引物序列）和1 200 bp（含接头引物序列）。
根据2次5′RACE获得的序列结果设计引物，扩增HbFER的编码区全长序列（图1-C）。结果表明，该片段长度2 679 bp，是一个完整的开放阅读框，可编码一个含892个氨基酸的多肽。利用ExPasy在线工具ProParam（http：//web.expasy.org/protparam/）进行分析，结果表明，该基因编码的蛋白分子量为96.5 ku，等电点为6.05，为弱酸性蛋白；利用TMHMM Server v. 2.0程序进行蛋白序列跨膜区分析，发现该基因编码的蛋白含有2个跨膜结构域；利用软件SignalPV4.1预测，结果发现该蛋白的N端含有1个信号肽（含22个氨基酸）；在NCBI的CCD数据库中进行搜索，发现HbFER中含有2个保守结构域Malectin_like和PTKc，其中Malectin_like结构域位于35～405号氨基酸残基之间，PTKc位于540～802号氨基酸残基之间（图2）。 2.2 橡胶树HbFER编码的蛋白与其他植物FER蛋白的同源性比较及保守结构域分析
利用HbFER的氨基酸序列在GenBank蛋白数据库中进行BLAST比对，结果发现HbFER编码的蛋白与拟南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）和杨树（Populus tomentosa）的FER蛋白高度相似，其相似性分别为74.5%、74.7%和82.9%，其中Malectin_like和PTKc保守结构域与拟南芥、番茄和杨树中的这2个结构域高度同源。此外，分析结果还发现HbFER含有CrRLK1-L家族成员中的6个保守胞外基序（motif）（图3），其中motif5中含有类似于Malectin的糖结合序列，如LHFCE、IYLN等（图3方框标注）。胞内域除激酶域以外，C端也有一个相对保守的基序（FSQGR）。以上结果暗示，克隆的HbFER基因属于CrRLK1-L家族成员，可能具有其他植物CrRLK1类激酶相似的功能。
2.3 HbFER基因的组织表达特异性分析
通过RT-PCR半定量分析技术对HbFER基因的组织特异性表达情况进行检测，结果表明，HbFER基因在花、叶、芽、树皮和胶乳中均有表达，但其表达量有明显差异，其中在叶中的表达丰度最高，花中次之，在胶乳中的表达丰度最低，结果见图4。
2.4 SA对橡胶树叶片中HbFER基因表达的影响
SA对HbFER在叶片中表达的影响结果见图5。结果表明，叶片中的HbFER基因在6 h内被SA快速激活表达，在24 h后表达量有所降低，表明该基因能够对SA产生应答，暗示该基因可能与SA抗病信号途径相关。
3 讨论与结论
本研究克隆了巴西橡胶树HbFER基因并进行了初步的表达分析，结果表明该基因在氨基酸水平上与其他植物的FER蛋白具有高度同源性，除了包含Malectin_like和PTKc两个保守功能结构域外，还含有植物类受体激酶CrRLK1-L亚家族成员所具有的7个特有基序（包括6个保守的胞外域基序和1个C端保守基序）的特点。生物信息学研究结果发现，大多数CrRLK1-L亚家族成员的胞外域中都含有2个与Malectin蛋白的糖结合域相似[31]的区域。在HbFER蛋白的第5个胞外基序中也存在2个Malectin-like糖结合序列。这些数据说明HbFER是类受体激酶的同源基因，属于CrRLK1-L亚家族成员。
已有的研究结果表明，拟南芥FER类受体激酶除了参与花粉管和助细胞的识别、调控花粉管伸长外[10， 15-16]，还在促进营养组织细胞伸长[11]、调节气孔开度[17]等方面发挥作用。HbEFR在橡胶树不同组织中的表达分析结果显示，该基因虽然在花、叶、芽、树皮和胶乳中均能检测到表达，但在花和叶中的表达丰度明显高于其它组织，推测可能与该基因在调控花粉管伸长和气孔开度方面的生物学功能相关，而HbEFR对橡胶树花粉发育和气孔开度是否具体调控作用还需进一步的实验证实。
SA是SAR反应的重要信号分子，能够促使活性氧（Reactive oxygen species，ROS）在细胞中积累[32]，而ROS作为第二信使在SAR信号转导途径的建立中发挥重要作用[33]。据Kessler等[17]的研究结果表明，当用白粉病菌接种拟南芥fer突变体时表现抗性增强，说明FER基因参与植物的抗病反应。此外FER能够在细胞表面调节RAC/ROP GTP酶的活性并激发ROS的产生。以上研究结果暗示FER可能通过SA介导的依赖于ROS的抗病信号途径参与植物抗病反应，但在橡胶树中所依赖的信号途径还不清楚。本研究结果表明，当橡胶树用SA处理后HbFER基因上调表达，暗示HbFER基因可能通过SA信号途径参与植物的抗病反应，具体的调控机理还需进一步的研究。
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