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背景:跟腱是人体最强壮、最粗的肌腱,也是最容易断裂的,所以跟腱断裂是临床上常见的一种肌腱损伤。肌腱损伤后愈合的过程发生在三个不同的阶段:炎症、增殖和重塑。在愈合期,跟腱的成纤维细胞大量增殖,细胞外基质的成分(主要是III型胶原蛋白)随之合成而增加,并沉积在损伤部位。在重塑期,细胞结构变小,合成速度变慢。肌腱损伤后的愈合过程包括内在愈合和外在愈合。外在愈合的特征在于明显的炎症反应,然后是特化的成纤维细胞募集和增殖。急性跟腱断裂的修复通常效果良好,但肌腱纤维化粘连却是肌腱损伤术后最常见的并发症之一。因此,抑制肌腱粘连的形成将有助于改善肌腱修复的愈合质量。目前,已有多项研究证实受损腱旁组织内的成纤维细胞增殖在粘连形成中起重要作用,抑制炎症反应和成纤维细胞增殖可明显抑制损伤部位周围粘连形成。众所周知,转化生长因子(TGF-β1)是各种损伤后组织发生病理性纤维化的因素之一,而TGF-β1/Smad信号是创伤修复过程中的重要信号通路。肌腱损伤时,TGF-β1/Smad信号可刺激腱细胞DNA合成,促使成纤维细胞和巨噬细胞的募集,并通过参与血管生成、刺激胶原产生从而促进腱细胞增殖和肌腱的修复。TGF-β1还能调控基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达,通过促进二者裂解胶原碎片或明胶进而介导细胞外基质(ECM)和胶原的合成、降解。还有研究表明,TGF-β1既可以通过标准的Smad2/3转录因子通路,又可以通过非标准的p38 MAPK信号通路来诱导成纤维细胞中的胶原蛋白表达。近年来,钙离子通道阻滞剂的抗炎、抗纤维化作用逐渐受到关注。钙通道阻滞剂维拉帕米可以抑制炎性细胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6的生产,增加血浆IL-10等炎性细胞因子的水平,通过抑制成纤维细胞粘附和增殖来减少瘢痕形成,参与细胞外基质降解和减少疤痕形成。已有研究表明,外用维拉帕米可减少损伤部位坐骨神经I型和III型胶原的形成,减少周围神经修复后瘢痕组织的形成,促进轴突的生长,但是关于维拉帕米是否对跟腱损伤也有治疗效果目前尚未见报道。因此,阐明维拉帕米是否可应用于跟腱损伤后治疗,并明确其可能的作用机制将对我们改进或开发更有效的跟腱损伤修复方案提供理论基础。目的:本研究在建立大鼠跟腱横行贯通切断的急性损伤模型的基础上,考察外用维拉帕米的疗效,旨在评估维拉帕米对跟腱损伤的修复效果及其在预防粘连方面的作用效果,并探讨其潜在的作用机制是否与TGF-β1/smad3及ERK1/2/p38 MAPK信号通路相关,这为我们更有效的治疗跟腱损伤并恢复跟腱功能提供新的方向。方法:建立大鼠跟腱横行贯通切断的急性损伤模型,跟腱横断后,采用改良的“Kessler”法,使用5-0无损伤缝合线将跟腱断端缝合,模型对照组的用蘸有100ul生理盐水的明胶海绵(面积0.5cm×0.5cm)包裹损伤跟腱断端周围,缝合皮肤;干预组用蘸有维拉帕米药物(浓度2.5mg/ml)100ul的明胶海绵包裹损伤跟腱断端周围,间断缝合皮肤,假手术组划开大鼠跟腱表面皮肤,游离跟腱周边软组织,而后间断缝合皮肤伤口。通过组织形态学观察(HE、Masson染色)进行粘连评分和炎症分级,通过生物力学测定和步态分析评估钙通道阻滞剂维拉帕米对跟腱粘连形成的影响。采用免疫组化方法考察维拉帕米干预对损伤缝合后跟腱组织中基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)蛋白水平表达的影响,免疫荧光考察肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(Vimnentin)分布,利用Western blot考察维拉帕米对细胞外基质蛋白col I和col III的表达及相关通路TGF-β1/smad3的影响及其对纤维化粘连有关的ERK1/2和p38MAPK信号通路的影响。结果:建立大鼠跟腱急性损伤模型,设置假手术组(A-sham)、模型对照组(B-control)、药物干预组(C-VP),于术后1周、2周、4周进行跟腱损伤修复后炎症指标、纤维化指标及跟腱功能的测定:(1)与对照组相比,VP干预组肌腱更饱满,更平滑,凹陷和腱束分离程度低于对照组,愈合优于对照组,最大拉断力多于对照组,并且VP干预组粘连分级低于对照组。(2)对照组和干预组炎症分级具有明显的组间差异(P<0.05),并且干预组与对照组比较跟腱功能(AFI)明显提高。(3)干预组与对照组比较,术后第1周、第2周MMP-2和MMP-9表达明显下降(P<0.05),第1周、2周、4周Vimentin和α-SMA的表达水平均明显下降(P<0.05)。(4)与对照组相比,VP干预能够显著抑制col I和col III的表达,并且TGF-β1、p-smad3、p-p38和p-ERK1/2蛋白表达水平表达量均明显降低(P<0.05)。结论:(1)维拉帕米具有抗肌腱损伤术后粘连的作用,它可减少肌腱周围组织内的细胞外基质(ECM)的沉积,有效平衡胶原蛋白的合成与降解,减少炎症细胞的分布;(2)维拉帕米可能通过抑制smad3磷酸化阻止TGF-β1信号激活,进而抑制MMP-2、MMP-9合成,减少胶原蛋白col I和col III的表达,减缓纤维细胞过度增殖,抑制纤维化进程;(3)维拉帕米通过降低细胞内钙离子浓度进而抑制p38和ERK1/2通路激活,抑制纤维细胞过度增殖。