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【摘 要】目的：观察健膝丸对膝骨关节炎模型大鼠的软骨光镜下组织形态学的影响。方法：将40只大鼠随机区组法分为正常组、模型组、实验组（健膝丸组）、对照组（抗骨增生胶囊组）。按照改良Hulth方法建立动物模型。用药8周后处死动物取材，分别经HE、Masson、Safranin-O染色，光镜观察并行Mankin's评分。结果：光镜下观察实验组、对照组及模型组均有软骨破坏，模型组更为明显。Mankin's评分，与正常组比较，其余3组积分显著增加（P<0.05），实验组、对照组与模型组相比均有显著性差异（P<0.05），实验与对照组相比无显著性差异（P>0.05）。结论：健膝丸可减少软骨Ⅱ型胶原和蛋白多糖丢失，减轻关节软骨破坏，减缓软骨下骨硬化，延缓骨关节炎的发展进程，但同时表明其不能停止或逆转关节软骨的退变。
【关键词】 骨关节炎，膝；健膝丸；中医药疗法；关节软骨；组织形态学；实验研究；动物；大鼠
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种严重影响患者生活质量和社会生产力的慢性、进行性骨关节病。该病是以关节软骨退行性改变为核心，累及骨质，并包括滑膜、关节及关节其他结构的全方位、多层次、不同程度的慢性炎症[1]。中医学将OA归属“膝痹病”“骨痹”等范畴。健膝丸是全国名老中医药专家娄多峰教授治疗OA的经验方，以中医药理论为基础，在风湿病（即“痹病”）“虚、邪、瘀”理论指导下立法遣方，具有滋补肝肾、强筋壮骨、温阳通络、祛风除湿之功效。本实验以复制骨关节炎动物模型的方法，从组织形态学的角度，研究健膝丸治疗OA的作用机制。
1 材料与仪器
1.1 实验动物 健康4月龄清洁级SD大鼠40只，雌性，空腹体重200～220 g左右，郑州大学实验动物中心提供，动物质量合格证号为0003224。
1.2 药品及试剂 健膝丸（由制首乌、淫羊藿、千年健、海桐皮、鸡血藤、川牛膝、木瓜等药物组成），河南风湿病医院提供，批准文号：豫药准字Z04010008，1 g成药相当于原生药3.017 g。
MASSON染色试剂盒由北京益利精细化学品有限公司生产。 苏木素-伊红染液、Safranin-O染液自配。
1.3 实验仪器 Olympus BX50型光学显微镜，FA104 型电子分析天平，SHH1WH-420型高效三用恒温水箱，Leica TP 1020型脱水机，Leica EG 1150c型包埋机，Leica RM 2165型石蜡切片机，Leica HI 1210型摊片机，Leica HI 1220型烘片机。
2 方 法
2.1 动物分组 动物适应性饲养7天后分别称重，随机区组法将动物分正常组、模型组、实验组（健膝丸组）、对照组（抗骨增生胶囊组），每组10只。
2.2 造模方法 除正常组外，其余3组造模法均采用改良Hulth法。术前1天用8 %硫化钠水溶液给大鼠右下肢脱毛，术前用2 %戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，常规大鼠右膝消毒、铺巾，手术取大鼠右膝关节内侧入路长约1 cm，切断内侧副韧带，摘除内侧半月板，切断前后交叉韧带，抽屉试验阳性，无菌辅料包扎，术后不固定伤肢，自由活动。术后连续3天肌肉注射青霉素20万U，1周后开始每天强迫大鼠活动0.5 h，连续8周。正常组采用假手术方法，打开关节腔，不损伤韧带和半月板，缝合皮肤，无菌敷料，同样措施抗感染治疗。
2.3 给药方法 根据人与动物体表面积等效剂量折算：健膝丸用0.9 %生理盐水加热配成1.35 g·kg-1混悬液，相当于原药15 g；抗骨增生胶囊用0.9 %生理盐水加热配成0.4725 g·kg-1混悬液；正常组和模型组给予0.9 %生理盐水，术后1周在造模的同时，按1 ml·（100g）-1灌胃，每天1次，连续8周。
2.4 标本取材、切片制作 用药8周处死动物后迅速切取造模侧，于1 min内置于10 %中性甲醛固定液中固定48 h，10 %EDTA脱钙剂脱钙，2天更换1次脱钙液，脱钙完全后流水冲洗4 h，矢状面切开膝关节，取股骨内髁关节软骨及部分软骨下骨，修成0.4 cm×0.3 cm×0.2 cm大小组织块，标记后进行脱水、石蜡包埋，进行纵切片，刀片倾斜15°角，片厚6 μm，连续切片。
2.5 检测指标 切片经HE染色、Safranin-O染色、Masson三色染色后用光镜观察。HE染色观察软骨组织结构、软骨细胞、软骨下骨；Masson三色染色观察软骨基质胶原变化；Safranin-O染色观察蛋白多糖的变化。对HE、Safranin-O染色的切片（每张切片选取3个视野）参考Mankin's骨关节病组织学分级方法[2]进行评分。
2.6 统计学方法 实验数据均采用SPPS13.0软件进行分析，数值变量以表示。组间差异显著性检验用One Way ANOVA和q检验（Student-Newman-Keuls法）。
3 结 果
3.1 组织形态学观察
3.1.1 HE染色观察 正常组软骨基质染成粉红色，着色均匀，软骨细胞核呈深蓝色，胞浆呈粉红色。软骨表面光滑，表层细胞较小，呈长扁形，平行于软骨表面排列；移行层细胞较大，呈圆形或椭圆形，同源细胞群散在分布；放射层细胞较大单个或趋于柱状排列，散在分布。细胞排列整齐，四层结构清晰，潮线完整见图1（1）。模型组软骨表面粗糙不整，表层软骨纤维化变性，甚则糜烂、剥落，软骨下骨裸露，细胞可见增殖，有簇集现象，或各层肥大软骨细胞增多，出现大量空软骨陷窝。细胞排列紊乱，四层结构不清晰，可见多重潮线或潮线中断。同时，模型组出现明显软骨下骨硬化或囊状性变形成，边缘有丘状隆起的骨赘见图1（2）。实验组软骨表面欠光滑，表层细胞丢失，可见软骨层变薄，表层软骨纤维化变性，出现浅表裂隙，细胞轻度增殖，偶见细胞簇集现象，深层可见肥大软骨细胞，出现空软骨陷窝；无明显的软骨下骨硬化或囊性变。细胞排列尚整齐，四层结构尚清晰，潮线基本完整见图1（3）。对照组大体同实验组见图1（4）。 3.1.2 Masson三色染色观察 正常组软骨基质胶原染绿色，着色均匀，向潮线方向染色加深，软骨下骨板及骨小梁深染绿色，骨胶原深染红色，呈红绿相间见图2（1）。模型组软骨失染，潮线附近有大量火焰状升起的深色红染，升起较高，范围较大见图2（2）。实验组与对照组软骨表层及移行层染色浅淡，部分区域染色不均匀，潮线附近有火焰状升起的红染，升起低，范围较小，两组软骨绿色丢失程度明显低于模型组见图2（3、4）。
3.1.3 Safranin-o-fast green-iron染色观察 正常组软骨蛋白多糖红染均匀，无失染，软骨下骨及骨小梁染绿色见图3（1）。模型组全层软骨失染见图3（2）。实验组软骨蛋白多糖染色不均匀，染色变淡，部分区域有失染见图3（3）。对照组软骨蛋白多糖染色较淡，有失染见图3（4）。
3.2 关节软骨组织损伤Mankin's评分结果 如表1所示，与正常组比较，其余三组积分显著增加（P<0.05）。实验组、对照组与模型组相比均有显著性差异（P<0.05），实验与对照组相比无显著性差异（P>0.05）。
4 讨 论
西医学依据OA病因或者主要易感因素将其分为原发性和继发性，但是所有OA患者的共同点是软骨生理学改变和由此而导致的关节软骨变性、脱落，软骨下骨质改变，骨板层骨质硬化，随后出现软骨下及边缘骨赘形成，发生关节滑膜炎、关节囊挛缩、关节间隙狭窄，引起关节功能障碍等症状。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，在生理条件下，软骨成分的降解与合成之间保持动态平衡。在力学因素和生物学因素的共同作用下，软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨三者间分解和合成代谢失衡导致了OA的发生。软骨细胞是成熟软骨中惟一的细胞类型、软骨代谢反应的主要来源，软骨细胞能感受到细胞外基质成分的改变并做出反应，以维持分解和合成代谢的平衡，保持关节软骨正常生理功能，在软骨形成、代谢以及修复中起着极其重要的作用。软骨细胞外基质的主要成分是胶原和蛋白多糖。与其他多种组织不同的是，软骨基质中的胶原主要是Ⅱ型胶原[3]，是正常软骨基质的特征性胶原表型，组成软骨内纤维网架结构。蛋白多糖由不同的分支状的多糖聚合体-糖胺多糖（glycosaminoglycans，GAGs）组成，其吸引大量水分子形成凝胶，具有良好的弹性和膨胀能力，对关节起机械性保护作用。OA时，基质结构遭到破坏，其中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的破坏最为显著，出现胶原裂解、破坏、减少及到晚期胶原纤维网架的消失，蛋白多糖含量降低，进而引起软骨细胞变性，分泌功能减弱，基质中的胶原和蛋白多糖更加减少，形成恶性循环，软骨就不能维持正常的结构和功能，造成关节的持续损伤。软骨下骨包括软骨下骨板及其下方的骨小梁、血管和小梁间腔隙，对关节软骨起到机械性和代谢性的保护作用。发生OA时，在软骨下骨发生几种骨塑形重建的方式，或者直接在持重面下，或者在关节的边缘，后者形成了原发性骨关节炎非常特殊的骨赘[4]。在骨重建过程中，骨吸收与骨形成相耦联，破骨和成骨在同一部位有序进行。OA早期，软骨下骨重建以骨吸收占主导[5]，后期继之以骨形成增加[6]，最终导致软骨下骨硬化和骨体积的增加。近年来较多研究表明，在OA的发展过程中，虽然软骨下骨的变化与关节软骨损伤的因果关系尚不确定，但软骨损伤程度与软骨下骨的变化存在一定的相关性。
本研究采用改良Hulth造模方法，在造成膝内翻畸形的同时，加以一定的运动负荷，建立膝关节关节失稳、应力不均的诱发模型。模型组的组织形态学的改变同人类OA相似，说明本实验造模方法较好的复制了大鼠膝骨关节炎模型。通过染色观察，HE染色显示模型组软骨破坏最为严重，同时有明显软骨下骨硬化或囊性变形成，并出现骨赘，而对照组和实验组则无明显变化，推测早期应用健膝丸可以减缓软骨的破坏及软骨下骨硬化，也表明软骨的损伤程度与软骨下骨的变化有一定的相关性。Masson3色染色显示模型组软骨绿色丢失程度最重，除正常组外，其余3组均有不同程度的软骨正常基质胶原绿色丢失，可见红色火焰状升起，染色同软骨下骨及骨小梁胶原，说明在OA过程中，存在着Ⅱ型胶原的减少和胶原类型的转变，而健膝丸能够减少Ⅱ型胶原丢失和类型转变。Safranin-O染色结果显示，模型组失染最重，而对照组和实验组红色丢失程度明显轻于模型组，证实了健膝丸能使软骨基质中的蛋白多糖丢失明显减缓。Makin's评分结果显示，与正常组比较，其余3组积分显著增加（P<0.05），实验组、对照组与模型组相比均有显著性差异（P<0.05），实验与对照组相比无显著性差异（P>0.05）。提示健膝丸和抗骨增生胶囊在维持软骨组织形态上具有相似的治疗效果，但是均未能在根本上逆转或阻止OA的发生、发展。
健膝丸是以中医药理论为基础，在风湿病 “虚邪瘀”理论指导下立法遣方。该理论认为OA的发病是以肝肾亏虚为内因，风寒湿热等邪侵袭及劳损为外因，瘀血及痰湿为病理产物，由于肝肾亏虚或气血不足，抵御无力，风寒湿热等邪乘虚而入，留于关节，痹而不通；或劳力伤损，气滞血瘀，络脉痹阻，关节失于濡养而发病。其基本病机为本虚标实，以肝肾亏虚为本，感受风、寒、湿、热等邪，瘀血痰浊留滞，经脉痹阻为标。同时强调本病病因病机“虚、邪、瘀（痰浊）”三者之间常相互为患、互为因果形成双向恶性循环，也即“痹必有虚、痹必有邪、痹必有瘀，或曰无虚不为痹、无邪不为痹、无瘀不为痹”[7]。治疗时，应根据三者不同的内容和程度，从肝肾亏虚、外邪痹阻、瘀血和（或）痰浊痹阻等辨证论治，分别运用扶正、祛邪、通络等方法遣方用药，以打破三者之间的双向恶性循环。
健膝丸以此立法遣方改变了传统方药或“扶正”或“祛邪”或“化瘀”的单一性，虚邪瘀三者兼顾。方中制首乌、淫羊藿滋补肝肾，温阳通络，强筋壮骨，共为君药；千年健除风湿，强筋骨，为臣药；海桐皮、木瓜祛风除湿通络，鸡血藤养血活血通络，为佐药；川牛膝活血通经，并可引药下行，使药物直达病所，兼有佐使之用。全方无配伍禁忌，组方严谨，具有滋补肝肾、强筋壮骨、温阳通络、祛风除湿之功，主治肾阳亏虚型OA。组方以滋补肝肾、强筋壮骨为主不仅体现中医治病求本的精髓，也扣合中医“肝主筋”“肾主骨”“乙癸同源”等理论，同时有研究表明运用补肝肾、强筋骨的中药复方，可以改善局部营养供应，提高代谢机能，促进大鼠膝关节软骨缺损修复[8]；兼以活血通络、祛风除湿，改善局部循环代谢，有利于消肿止痛，达到标本同治的目的，延缓OA的发生与发展。 综上所述，健膝丸能够通过维持软骨正常的胶原类型，减少基质胶原的降解和蛋白多糖的丢失，减轻软骨破坏，阻止或延缓软骨下骨硬化，达到治疗OA的目的。
5 参考文献
[1] 娄玉钤.风湿病诊断治疗学[M].郑州：郑州大学出版社，2003：336.
[2] Mankin HJ，Dorfman H，Lippiello L， et al. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteoarthritic human hips：Ⅱ.Correlation of morphology with biochemical and metabolic data[J]. J Bone Joint Surg Am，1971，53（3）：523-537.
[3] Miosge N，Hartmann M，Maelicke C，et al.Expression of collagen typeⅠand typeⅡ in consecutive stages of human osteoarthritis[J]. Histochem Cell Biol，2004， 122（3）：229-236.
[4] Moskowitz，et al.骨关节炎-诊断与治疗[M].王学谦，等译.天津：天津科技翻译出版公司，2005：65.
[5] Hayami T， Pickarski M， Zhuo Y， et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis[J].Bone，2006，38（2）：234-243.
[6] Matsui H， Shimizu M， Tsuji H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthritis of human knee joint： a histological and histomorphometric study[J].Microsc ResTech，1997，37（4）：333-342.
[7] 娄玉钤，娄高峰，娄多峰，等.基于“虚邪瘀”理论的风湿病学科体系建立及相关研究[J].风湿病与关节炎，2012，1（1）：10-15.
[8] 胡毓诗，张挥武，王传恩，等.复方中药对大鼠膝关节软骨缺损修复作用的实验研究[J].成都体育学院学报，2005，31（5）：100-103.
【关键词】 骨关节炎，膝；健膝丸；中医药疗法；关节软骨；组织形态学；实验研究；动物；大鼠
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种严重影响患者生活质量和社会生产力的慢性、进行性骨关节病。该病是以关节软骨退行性改变为核心，累及骨质，并包括滑膜、关节及关节其他结构的全方位、多层次、不同程度的慢性炎症[1]。中医学将OA归属“膝痹病”“骨痹”等范畴。健膝丸是全国名老中医药专家娄多峰教授治疗OA的经验方，以中医药理论为基础，在风湿病（即“痹病”）“虚、邪、瘀”理论指导下立法遣方，具有滋补肝肾、强筋壮骨、温阳通络、祛风除湿之功效。本实验以复制骨关节炎动物模型的方法，从组织形态学的角度，研究健膝丸治疗OA的作用机制。
1 材料与仪器
1.1 实验动物 健康4月龄清洁级SD大鼠40只，雌性，空腹体重200～220 g左右，郑州大学实验动物中心提供，动物质量合格证号为0003224。
1.2 药品及试剂 健膝丸（由制首乌、淫羊藿、千年健、海桐皮、鸡血藤、川牛膝、木瓜等药物组成），河南风湿病医院提供，批准文号：豫药准字Z04010008，1 g成药相当于原生药3.017 g。
MASSON染色试剂盒由北京益利精细化学品有限公司生产。 苏木素-伊红染液、Safranin-O染液自配。
1.3 实验仪器 Olympus BX50型光学显微镜，FA104 型电子分析天平，SHH1WH-420型高效三用恒温水箱，Leica TP 1020型脱水机，Leica EG 1150c型包埋机，Leica RM 2165型石蜡切片机，Leica HI 1210型摊片机，Leica HI 1220型烘片机。
2 方 法
2.1 动物分组 动物适应性饲养7天后分别称重，随机区组法将动物分正常组、模型组、实验组（健膝丸组）、对照组（抗骨增生胶囊组），每组10只。
2.2 造模方法 除正常组外，其余3组造模法均采用改良Hulth法。术前1天用8 %硫化钠水溶液给大鼠右下肢脱毛，术前用2 %戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，常规大鼠右膝消毒、铺巾，手术取大鼠右膝关节内侧入路长约1 cm，切断内侧副韧带，摘除内侧半月板，切断前后交叉韧带，抽屉试验阳性，无菌辅料包扎，术后不固定伤肢，自由活动。术后连续3天肌肉注射青霉素20万U，1周后开始每天强迫大鼠活动0.5 h，连续8周。正常组采用假手术方法，打开关节腔，不损伤韧带和半月板，缝合皮肤，无菌敷料，同样措施抗感染治疗。
2.3 给药方法 根据人与动物体表面积等效剂量折算：健膝丸用0.9 %生理盐水加热配成1.35 g·kg-1混悬液，相当于原药15 g；抗骨增生胶囊用0.9 %生理盐水加热配成0.4725 g·kg-1混悬液；正常组和模型组给予0.9 %生理盐水，术后1周在造模的同时，按1 ml·（100g）-1灌胃，每天1次，连续8周。
2.4 标本取材、切片制作 用药8周处死动物后迅速切取造模侧，于1 min内置于10 %中性甲醛固定液中固定48 h，10 %EDTA脱钙剂脱钙，2天更换1次脱钙液，脱钙完全后流水冲洗4 h，矢状面切开膝关节，取股骨内髁关节软骨及部分软骨下骨，修成0.4 cm×0.3 cm×0.2 cm大小组织块，标记后进行脱水、石蜡包埋，进行纵切片，刀片倾斜15°角，片厚6 μm，连续切片。
2.5 检测指标 切片经HE染色、Safranin-O染色、Masson三色染色后用光镜观察。HE染色观察软骨组织结构、软骨细胞、软骨下骨；Masson三色染色观察软骨基质胶原变化；Safranin-O染色观察蛋白多糖的变化。对HE、Safranin-O染色的切片（每张切片选取3个视野）参考Mankin's骨关节病组织学分级方法[2]进行评分。
2.6 统计学方法 实验数据均采用SPPS13.0软件进行分析，数值变量以表示。组间差异显著性检验用One Way ANOVA和q检验（Student-Newman-Keuls法）。
3 结 果
3.1 组织形态学观察
3.1.1 HE染色观察 正常组软骨基质染成粉红色，着色均匀，软骨细胞核呈深蓝色，胞浆呈粉红色。软骨表面光滑，表层细胞较小，呈长扁形，平行于软骨表面排列；移行层细胞较大，呈圆形或椭圆形，同源细胞群散在分布；放射层细胞较大单个或趋于柱状排列，散在分布。细胞排列整齐，四层结构清晰，潮线完整见图1（1）。模型组软骨表面粗糙不整，表层软骨纤维化变性，甚则糜烂、剥落，软骨下骨裸露，细胞可见增殖，有簇集现象，或各层肥大软骨细胞增多，出现大量空软骨陷窝。细胞排列紊乱，四层结构不清晰，可见多重潮线或潮线中断。同时，模型组出现明显软骨下骨硬化或囊状性变形成，边缘有丘状隆起的骨赘见图1（2）。实验组软骨表面欠光滑，表层细胞丢失，可见软骨层变薄，表层软骨纤维化变性，出现浅表裂隙，细胞轻度增殖，偶见细胞簇集现象，深层可见肥大软骨细胞，出现空软骨陷窝；无明显的软骨下骨硬化或囊性变。细胞排列尚整齐，四层结构尚清晰，潮线基本完整见图1（3）。对照组大体同实验组见图1（4）。 3.1.2 Masson三色染色观察 正常组软骨基质胶原染绿色，着色均匀，向潮线方向染色加深，软骨下骨板及骨小梁深染绿色，骨胶原深染红色，呈红绿相间见图2（1）。模型组软骨失染，潮线附近有大量火焰状升起的深色红染，升起较高，范围较大见图2（2）。实验组与对照组软骨表层及移行层染色浅淡，部分区域染色不均匀，潮线附近有火焰状升起的红染，升起低，范围较小，两组软骨绿色丢失程度明显低于模型组见图2（3、4）。
3.1.3 Safranin-o-fast green-iron染色观察 正常组软骨蛋白多糖红染均匀，无失染，软骨下骨及骨小梁染绿色见图3（1）。模型组全层软骨失染见图3（2）。实验组软骨蛋白多糖染色不均匀，染色变淡，部分区域有失染见图3（3）。对照组软骨蛋白多糖染色较淡，有失染见图3（4）。
3.2 关节软骨组织损伤Mankin's评分结果 如表1所示，与正常组比较，其余三组积分显著增加（P<0.05）。实验组、对照组与模型组相比均有显著性差异（P<0.05），实验与对照组相比无显著性差异（P>0.05）。
4 讨 论
西医学依据OA病因或者主要易感因素将其分为原发性和继发性，但是所有OA患者的共同点是软骨生理学改变和由此而导致的关节软骨变性、脱落，软骨下骨质改变，骨板层骨质硬化，随后出现软骨下及边缘骨赘形成，发生关节滑膜炎、关节囊挛缩、关节间隙狭窄，引起关节功能障碍等症状。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，在生理条件下，软骨成分的降解与合成之间保持动态平衡。在力学因素和生物学因素的共同作用下，软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨三者间分解和合成代谢失衡导致了OA的发生。软骨细胞是成熟软骨中惟一的细胞类型、软骨代谢反应的主要来源，软骨细胞能感受到细胞外基质成分的改变并做出反应，以维持分解和合成代谢的平衡，保持关节软骨正常生理功能，在软骨形成、代谢以及修复中起着极其重要的作用。软骨细胞外基质的主要成分是胶原和蛋白多糖。与其他多种组织不同的是，软骨基质中的胶原主要是Ⅱ型胶原[3]，是正常软骨基质的特征性胶原表型，组成软骨内纤维网架结构。蛋白多糖由不同的分支状的多糖聚合体-糖胺多糖（glycosaminoglycans，GAGs）组成，其吸引大量水分子形成凝胶，具有良好的弹性和膨胀能力，对关节起机械性保护作用。OA时，基质结构遭到破坏，其中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的破坏最为显著，出现胶原裂解、破坏、减少及到晚期胶原纤维网架的消失，蛋白多糖含量降低，进而引起软骨细胞变性，分泌功能减弱，基质中的胶原和蛋白多糖更加减少，形成恶性循环，软骨就不能维持正常的结构和功能，造成关节的持续损伤。软骨下骨包括软骨下骨板及其下方的骨小梁、血管和小梁间腔隙，对关节软骨起到机械性和代谢性的保护作用。发生OA时，在软骨下骨发生几种骨塑形重建的方式，或者直接在持重面下，或者在关节的边缘，后者形成了原发性骨关节炎非常特殊的骨赘[4]。在骨重建过程中，骨吸收与骨形成相耦联，破骨和成骨在同一部位有序进行。OA早期，软骨下骨重建以骨吸收占主导[5]，后期继之以骨形成增加[6]，最终导致软骨下骨硬化和骨体积的增加。近年来较多研究表明，在OA的发展过程中，虽然软骨下骨的变化与关节软骨损伤的因果关系尚不确定，但软骨损伤程度与软骨下骨的变化存在一定的相关性。
本研究采用改良Hulth造模方法，在造成膝内翻畸形的同时，加以一定的运动负荷，建立膝关节关节失稳、应力不均的诱发模型。模型组的组织形态学的改变同人类OA相似，说明本实验造模方法较好的复制了大鼠膝骨关节炎模型。通过染色观察，HE染色显示模型组软骨破坏最为严重，同时有明显软骨下骨硬化或囊性变形成，并出现骨赘，而对照组和实验组则无明显变化，推测早期应用健膝丸可以减缓软骨的破坏及软骨下骨硬化，也表明软骨的损伤程度与软骨下骨的变化有一定的相关性。Masson3色染色显示模型组软骨绿色丢失程度最重，除正常组外，其余3组均有不同程度的软骨正常基质胶原绿色丢失，可见红色火焰状升起，染色同软骨下骨及骨小梁胶原，说明在OA过程中，存在着Ⅱ型胶原的减少和胶原类型的转变，而健膝丸能够减少Ⅱ型胶原丢失和类型转变。Safranin-O染色结果显示，模型组失染最重，而对照组和实验组红色丢失程度明显轻于模型组，证实了健膝丸能使软骨基质中的蛋白多糖丢失明显减缓。Makin's评分结果显示，与正常组比较，其余3组积分显著增加（P<0.05），实验组、对照组与模型组相比均有显著性差异（P<0.05），实验与对照组相比无显著性差异（P>0.05）。提示健膝丸和抗骨增生胶囊在维持软骨组织形态上具有相似的治疗效果，但是均未能在根本上逆转或阻止OA的发生、发展。
健膝丸是以中医药理论为基础，在风湿病 “虚邪瘀”理论指导下立法遣方。该理论认为OA的发病是以肝肾亏虚为内因，风寒湿热等邪侵袭及劳损为外因，瘀血及痰湿为病理产物，由于肝肾亏虚或气血不足，抵御无力，风寒湿热等邪乘虚而入，留于关节，痹而不通；或劳力伤损，气滞血瘀，络脉痹阻，关节失于濡养而发病。其基本病机为本虚标实，以肝肾亏虚为本，感受风、寒、湿、热等邪，瘀血痰浊留滞，经脉痹阻为标。同时强调本病病因病机“虚、邪、瘀（痰浊）”三者之间常相互为患、互为因果形成双向恶性循环，也即“痹必有虚、痹必有邪、痹必有瘀，或曰无虚不为痹、无邪不为痹、无瘀不为痹”[7]。治疗时，应根据三者不同的内容和程度，从肝肾亏虚、外邪痹阻、瘀血和（或）痰浊痹阻等辨证论治，分别运用扶正、祛邪、通络等方法遣方用药，以打破三者之间的双向恶性循环。
健膝丸以此立法遣方改变了传统方药或“扶正”或“祛邪”或“化瘀”的单一性，虚邪瘀三者兼顾。方中制首乌、淫羊藿滋补肝肾，温阳通络，强筋壮骨，共为君药；千年健除风湿，强筋骨，为臣药；海桐皮、木瓜祛风除湿通络，鸡血藤养血活血通络，为佐药；川牛膝活血通经，并可引药下行，使药物直达病所，兼有佐使之用。全方无配伍禁忌，组方严谨，具有滋补肝肾、强筋壮骨、温阳通络、祛风除湿之功，主治肾阳亏虚型OA。组方以滋补肝肾、强筋壮骨为主不仅体现中医治病求本的精髓，也扣合中医“肝主筋”“肾主骨”“乙癸同源”等理论，同时有研究表明运用补肝肾、强筋骨的中药复方，可以改善局部营养供应，提高代谢机能，促进大鼠膝关节软骨缺损修复[8]；兼以活血通络、祛风除湿，改善局部循环代谢，有利于消肿止痛，达到标本同治的目的，延缓OA的发生与发展。 综上所述，健膝丸能够通过维持软骨正常的胶原类型，减少基质胶原的降解和蛋白多糖的丢失，减轻软骨破坏，阻止或延缓软骨下骨硬化，达到治疗OA的目的。
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