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[摘 要]采用高效液相色譜法测定天麻头风灵胶囊中天麻素的含量。
[关键词]天麻头风灵胶囊；质量标准
中图分类号：S012 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2014）13-0351-01
天麻头风灵胶囊由天麻、川芎、玄参、当归、地黄、槲寄生、野菊花等10味中药组成，具有平肝潜阳、清眩止痛、补益肝肾、息风止痉、镇静、镇痛和抗炎作用。为了有效控制本品质量， 我们对天麻等4味中药进行了薄层鉴别，并采用高效液相色谱法对方中君药天麻的有效成分天麻素进行了含量测定。对天麻素的测定， 文献报道的方法有二阶导数光谱法、三阶导数分光光度法、双波长薄层扫描法、高效液相色谱法等。我们选择天麻素为指标性成分，建立了测定天麻头风灵胶囊中天麻素含量的高效液相色谱法，取得了较好的结果[1][2]。
一、 仪器与试药
Waters 高效液相色谱仪系统515泵；717自动进样器；2487紫外检测器；Millennium 32色谱管理系统。Sartorius BP211D型 电子 天平；瑞士CAMAG Ⅲ型薄层色谱系统。天麻素对照品（ 中国 药品生物制品检定所，批号110807- 200205）；天麻头风灵胶囊（自制，批号040613，040614， 040615）。甲醇（色谱纯），磷酸（分析纯），重蒸馏水（自制）。
二、方法与结果
1、薄层色谱鉴别
1）天麻
取本品10片，研细，加水饱和的正丁醇50 mL，浸泡一夜，超声处理30 min，滤过，滤液用水30 mL分3次振摇提取，合并水层，浓缩至5 mL。通过D-101大孔树脂柱（内径1.5 cm，长12 cm），以水15 mL洗脱，弃去水液，再用10%乙醇40 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取天麻素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取天麻对照药材0.5 g，加甲醇5 mL，超声处理30 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。阴性制剂溶液的制备方法同供试品溶液的制备方法。
照薄层色谱法[2010年版《中国药典》（一部）附录ⅥB][5]试验，分别吸取阴性制剂溶液、对照品溶液、对照药材溶液及供试品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-冰醋酸（12∶4∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸-乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的棕褐色斑点。阴性制剂无此斑点[3]。
2）当归、川芎
取本品25片，研细，加乙醚20 mL浸泡1 h，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣加氯仿1 mL使溶解，作为供试品溶液。取当归、川芎对照药材各0.5 g，同法制成对照药材溶液。阴性制剂（缺当归、川芎）溶液的制备方法同供试品溶液制备方法。
照薄层色谱法[2010年版《中国药典》（一部）附录ⅥB] 试验，吸取缺当归、川芎的阴性制剂、供试品溶液20 μL、当归、川芎对照药材溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。同缺当归川芎的阴性制剂无此斑点。
3）野菊花
取本品制剂10片，研细，加甲醇15 mL，超声处理30 min，取上清液，作为供试品溶液。取野菊花对照药材0.3 g，同法制成对照药材溶液。阴性制剂溶液的制备方法同供试品溶液的制备方法。
照薄层色谱法[2010年版《中国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取阴性制剂溶液、供试品溶液2 μL及对照药材溶液1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-氯仿-甲醇-水（15∶15∶6∶4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性制剂无此斑点。
2、天麻素的含量测定
1）色谱条件和系统适应性试验
色谱柱：Kromasil C18反相柱（250 mm×4.6 mm，ID）；流动相：甲醇-0.05%磷酸水（2.5∶97.5）；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；测定波长：220 nm；进样量：20 μL。在上述色谱条件下测定，天麻素达到基线分离，理论塔板数按天麻素峰 计算 大于5 000[4]。
2）对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液的制备
精密称取在80 ℃减压干燥1 h的天麻素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得对照品溶液。取本品20片，研细，取粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取缺天麻的阴性制剂，同供试品溶液的方法制备，即得阴性制剂溶液。
3） 空白干扰试验
照上述色谱条件，取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL，分别注入色谱仪。供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，有一相同的色谱峰，而阴性对照溶液在此保留时间无色谱峰出现，故对供试品溶液含量测定无干扰，见图1。
4） 标准曲线及线性范围
取天麻素适量，精密称定，加50%甲醇制成300.8 μg/mL的标准贮备液，从中精密吸取0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL分别稀释至10 mL，摇匀，分别吸取20 μL对照品溶液注入液相色谱仪测定。经回归分析，得回归方程： A=38 236C-3 498.9，相关系数r=0.999 9，线性范围6.016～96.256 μg/mL。 5） 进样精密度试验
取对照品溶液20 μL（24.064 μg/mL）注入液相色谱仪测定，连续6次，结果平均值A=914 106， RSD=0.09%。表明精密度较好。
6） 稳定性试验
取供试品溶液（批号040613），每隔2 h精密吸取20 μL注入液相色谱仪，测定样品12 h的稳定性。结果表明，供试品溶液在12 h内稳定，结果RSD=0.63%，表明被测物稳定。
7） 重复性试验
配制供试品溶液（批號040613）共5份，分别吸取20 μL溶液注入液相色谱仪测定，结果平均值为0.469 mg/g，RSD=0.84%，表明本法的重复性较好。
8） 加样回收率试验
取批号040613天麻头风灵分散片，研碎的粉末约0.25 g，精密称定，共6份，分别精密加入300.8 μg/mL天麻素对照品溶液0.32、0.32、0.4、0.4、0.48、0.48 mL，混匀后，分别加入50%甲醇9.68、9.68、9.6、9.6、9.52、9.52 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷再称重，用50%甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。分别吸取20 μL溶液注入液相色谱仪测定。
9） 样品含量测定
分别精密吸取供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪中进行测定。根据3批样品检验结果，标准中暂定为每片含天麻以天麻素（C13H18O7）计，不得少于0.20 mg[5]。
三、讨论
1、检测波长的选择
经对天麻素对照品进行紫外扫描，发现天麻素在270 nm和220 nm处有较大吸收，其中220 nm为最大吸收波长。当检测波长为270 nm时，杂质干扰较小；当检测波长为220 nm时，杂质干扰较大。但综合各种因素考虑决定选用220 nm为检测波长。
2、流动相的选择
实验曾分别比较了不同比例的甲醇-水-磷酸流动相的色谱行为，考虑到色谱峰的对称性以及分析时间的合理性，选择甲醇-0.05%磷酸水（2.5∶97.5）为流动相，样品分离较佳。
3、样品预处理方法的选择
实验考察了超声提取和加热回流提取两种提取方法，结果表明，超声提取效果更好；进一步对超声提取时间进行考察，发现超声处理30 min（工作频率40 kHz，超声功率250 W），样品天麻素已基本溶出。实验还比较了不同提取溶剂（甲醇、50%甲醇、流动相和亚沸蒸馏水）和不同提取次数对结果的影响，结果表明水和50%甲醇提取效果相当，结合色谱行为，选用甲醇提取；且超声一次就能达到含量测定要求。
参考文献
[1] 何丹鸿，陈曦.二阶导数光谱法测定复方天麻制剂中天麻素含量[J].辽宁药物与临床，1998，1（4）：160-161.
[2] 袁曦，洪清.三阶导数分光光度法测定复方天麻口服液中天麻素含量[J].中国医院药学杂志，1995，15（8）：339-340.
[3] 申玉华，董文慧.双波长薄层扫描法测定天芎头痛宁胶囊中天麻素的含量[J].中药新药与临床药理，1995，6（3）：33-35.
[4] 梁纪军，田大丰.HPLC法测定不同产地天麻中天麻素的含量[J].沈阳药科大学学报，2006，23（1）：26-28.
[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：化学工业出版社，2000.78.
[关键词]天麻头风灵胶囊；质量标准
中图分类号：S012 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2014）13-0351-01
天麻头风灵胶囊由天麻、川芎、玄参、当归、地黄、槲寄生、野菊花等10味中药组成，具有平肝潜阳、清眩止痛、补益肝肾、息风止痉、镇静、镇痛和抗炎作用。为了有效控制本品质量， 我们对天麻等4味中药进行了薄层鉴别，并采用高效液相色谱法对方中君药天麻的有效成分天麻素进行了含量测定。对天麻素的测定， 文献报道的方法有二阶导数光谱法、三阶导数分光光度法、双波长薄层扫描法、高效液相色谱法等。我们选择天麻素为指标性成分，建立了测定天麻头风灵胶囊中天麻素含量的高效液相色谱法，取得了较好的结果[1][2]。
一、 仪器与试药
Waters 高效液相色谱仪系统515泵；717自动进样器；2487紫外检测器；Millennium 32色谱管理系统。Sartorius BP211D型 电子 天平；瑞士CAMAG Ⅲ型薄层色谱系统。天麻素对照品（ 中国 药品生物制品检定所，批号110807- 200205）；天麻头风灵胶囊（自制，批号040613，040614， 040615）。甲醇（色谱纯），磷酸（分析纯），重蒸馏水（自制）。
二、方法与结果
1、薄层色谱鉴别
1）天麻
取本品10片，研细，加水饱和的正丁醇50 mL，浸泡一夜，超声处理30 min，滤过，滤液用水30 mL分3次振摇提取，合并水层，浓缩至5 mL。通过D-101大孔树脂柱（内径1.5 cm，长12 cm），以水15 mL洗脱，弃去水液，再用10%乙醇40 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取天麻素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取天麻对照药材0.5 g，加甲醇5 mL，超声处理30 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。阴性制剂溶液的制备方法同供试品溶液的制备方法。
照薄层色谱法[2010年版《中国药典》（一部）附录ⅥB][5]试验，分别吸取阴性制剂溶液、对照品溶液、对照药材溶液及供试品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-冰醋酸（12∶4∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸-乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的棕褐色斑点。阴性制剂无此斑点[3]。
2）当归、川芎
取本品25片，研细，加乙醚20 mL浸泡1 h，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣加氯仿1 mL使溶解，作为供试品溶液。取当归、川芎对照药材各0.5 g，同法制成对照药材溶液。阴性制剂（缺当归、川芎）溶液的制备方法同供试品溶液制备方法。
照薄层色谱法[2010年版《中国药典》（一部）附录ⅥB] 试验，吸取缺当归、川芎的阴性制剂、供试品溶液20 μL、当归、川芎对照药材溶液各1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。同缺当归川芎的阴性制剂无此斑点。
3）野菊花
取本品制剂10片，研细，加甲醇15 mL，超声处理30 min，取上清液，作为供试品溶液。取野菊花对照药材0.3 g，同法制成对照药材溶液。阴性制剂溶液的制备方法同供试品溶液的制备方法。
照薄层色谱法[2010年版《中国药典》（一部）附录ⅥB]试验，吸取阴性制剂溶液、供试品溶液2 μL及对照药材溶液1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-氯仿-甲醇-水（15∶15∶6∶4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性制剂无此斑点。
2、天麻素的含量测定
1）色谱条件和系统适应性试验
色谱柱：Kromasil C18反相柱（250 mm×4.6 mm，ID）；流动相：甲醇-0.05%磷酸水（2.5∶97.5）；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；测定波长：220 nm；进样量：20 μL。在上述色谱条件下测定，天麻素达到基线分离，理论塔板数按天麻素峰 计算 大于5 000[4]。
2）对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液的制备
精密称取在80 ℃减压干燥1 h的天麻素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得对照品溶液。取本品20片，研细，取粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取缺天麻的阴性制剂，同供试品溶液的方法制备，即得阴性制剂溶液。
3） 空白干扰试验
照上述色谱条件，取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL，分别注入色谱仪。供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，有一相同的色谱峰，而阴性对照溶液在此保留时间无色谱峰出现，故对供试品溶液含量测定无干扰，见图1。
4） 标准曲线及线性范围
取天麻素适量，精密称定，加50%甲醇制成300.8 μg/mL的标准贮备液，从中精密吸取0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL分别稀释至10 mL，摇匀，分别吸取20 μL对照品溶液注入液相色谱仪测定。经回归分析，得回归方程： A=38 236C-3 498.9，相关系数r=0.999 9，线性范围6.016～96.256 μg/mL。 5） 进样精密度试验
取对照品溶液20 μL（24.064 μg/mL）注入液相色谱仪测定，连续6次，结果平均值A=914 106， RSD=0.09%。表明精密度较好。
6） 稳定性试验
取供试品溶液（批号040613），每隔2 h精密吸取20 μL注入液相色谱仪，测定样品12 h的稳定性。结果表明，供试品溶液在12 h内稳定，结果RSD=0.63%，表明被测物稳定。
7） 重复性试验
配制供试品溶液（批號040613）共5份，分别吸取20 μL溶液注入液相色谱仪测定，结果平均值为0.469 mg/g，RSD=0.84%，表明本法的重复性较好。
8） 加样回收率试验
取批号040613天麻头风灵分散片，研碎的粉末约0.25 g，精密称定，共6份，分别精密加入300.8 μg/mL天麻素对照品溶液0.32、0.32、0.4、0.4、0.48、0.48 mL，混匀后，分别加入50%甲醇9.68、9.68、9.6、9.6、9.52、9.52 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷再称重，用50%甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。分别吸取20 μL溶液注入液相色谱仪测定。
9） 样品含量测定
分别精密吸取供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪中进行测定。根据3批样品检验结果，标准中暂定为每片含天麻以天麻素（C13H18O7）计，不得少于0.20 mg[5]。
三、讨论
1、检测波长的选择
经对天麻素对照品进行紫外扫描，发现天麻素在270 nm和220 nm处有较大吸收，其中220 nm为最大吸收波长。当检测波长为270 nm时，杂质干扰较小；当检测波长为220 nm时，杂质干扰较大。但综合各种因素考虑决定选用220 nm为检测波长。
2、流动相的选择
实验曾分别比较了不同比例的甲醇-水-磷酸流动相的色谱行为，考虑到色谱峰的对称性以及分析时间的合理性，选择甲醇-0.05%磷酸水（2.5∶97.5）为流动相，样品分离较佳。
3、样品预处理方法的选择
实验考察了超声提取和加热回流提取两种提取方法，结果表明，超声提取效果更好；进一步对超声提取时间进行考察，发现超声处理30 min（工作频率40 kHz，超声功率250 W），样品天麻素已基本溶出。实验还比较了不同提取溶剂（甲醇、50%甲醇、流动相和亚沸蒸馏水）和不同提取次数对结果的影响，结果表明水和50%甲醇提取效果相当，结合色谱行为，选用甲醇提取；且超声一次就能达到含量测定要求。
参考文献
[1] 何丹鸿，陈曦.二阶导数光谱法测定复方天麻制剂中天麻素含量[J].辽宁药物与临床，1998，1（4）：160-161.
[2] 袁曦，洪清.三阶导数分光光度法测定复方天麻口服液中天麻素含量[J].中国医院药学杂志，1995，15（8）：339-340.
[3] 申玉华，董文慧.双波长薄层扫描法测定天芎头痛宁胶囊中天麻素的含量[J].中药新药与临床药理，1995，6（3）：33-35.
[4] 梁纪军，田大丰.HPLC法测定不同产地天麻中天麻素的含量[J].沈阳药科大学学报，2006，23（1）：26-28.
[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：化学工业出版社，2000.78.