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摘要本试验利用碘化丙啶（propidium iodide）和Alexa Flour 488（AF 488）标记的麦胚凝集素（WGA）分别对小麦子房细胞和小麦矮腥黑粉菌进行染色，结合激光共聚焦显微镜成像系统获取小麦子房的三维立体图像。该技术可获得清晰的小麦子房细胞图像，并观察小麦矮腥黑粉菌在小麦子房中的侵染状况。该方法将为研究病原菌在寄主体内的分布提供可参考依据。
关键词小麦矮腥黑粉菌;碘化丙啶;麦胚凝集素;激光共聚焦显微镜
中图分类号：S 435.121
文献标识码：A
DOI：10.16688/j.zwbh.2018059
小麦矮腥黑粉菌Tilletia controversa Kühn（TCK）引起的小麦矮腥黑穗病对小麦的安全生产危害巨大[1]。被小麦矮腥黑粉菌侵染发病的小麦植株多分蘖和矮化，正常的籽粒被发育成熟的孢子团（菌癭）完全取代形成病粒，通常发病率约等于产量损失率[12]。除了导致小麦产量损失外，小麦矮腥黑粉菌冬孢子中含有的三甲胺会严重影响小麦面粉的品质和人体健康，而且该病菌在2007年被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》[3]。我国的部分冬麦区也面临小麦矮腥黑粉菌传入和定殖的风险[46]。当前大多数研究都集中在对小麦矮腥黑粉菌的风险分析和分子鉴定[79]上，并取得了长足的进展和广泛的应用，使得小麦矮腥黑粉菌的检测灵敏度可以达到0.1 fg/μL[1011]。然而，小麦矮腥黑粉菌与寄主互作方面的研究却极少见，该方面的研究将加深我们对小麦矮腥黑粉菌侵染机制的理解，并为小麦矮腥黑穗病的有效防治提供理论依据。
病原菌在寄主体内的显微观察是了解病原菌侵染过程较为直观的方式。传统的观察方法是将寄主组织整体透明染色后借助显微镜观察，操作步骤十分耗时和繁琐，制片过程中还有可能破坏幼嫩的植物组织[12]。而利用绿色荧光蛋白标记病原菌再借助荧光显微镜观察的方法是过去十几年发展比较成熟的另一种技术[1315]，在许多病原菌的侵染观察上获得应用[1618]。但绿色荧光蛋白的转化对于某些真菌难度很大，被标记病原菌的荧光表达量差异也制约着该方法的准确性[19]。当前，借助某些荧光染料对菌丝染色并在荧光显微镜下观察菌丝的方法取得了显著的效果，如Solophenyl Flavine 7GFE[12，20]和苯胺蓝[21]等，这种利用荧光染料与菌丝细胞质成分特异性结合的方法在操作上十分便捷，荧光成像质量高，有着广泛的前景。然而，小麦矮腥黑粉菌侵染小麦子房的细胞学研究一直以来都停留在组织切片技术上[2，22]。因此，有必要开发一种更直观便捷的方法来观察小麦矮腥黑粉菌对寄主的侵染状况。本文借鉴当前菌丝染色的方法结合寄主组织染色，在激光共聚焦显微镜下可实现方便、快捷、准确地观察小麦矮腥黑粉菌侵染小麦子房的显微过程。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1供试样品
本试验所需的小麦矮腥黑穗病发病样品是参照姚卓等[23]的人工培养和室内接种方法，在中国农业科学院植物保护研究所国家生物安全中心中高危病原菌实验室的超低温植物培养箱内培养获得。接种用的供试菌株由美国农业部农业研究院（United States Department of Agriculture， Agricultural Research Service）提供。
1.1.2主要试剂和仪器
本试验所需的主要试剂：无水乙醇、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline， PBS， pH=7.4）和吐温20（Tween 20）购自北京广达恒益生物科技有限公司，碘化丙啶（propidium iodide， PI）和Alexa Flour 488（AF 488）标记的麦胚凝集素（wheat germ agglutinin， WGA）由北京冰达生物科技有限公司代购。
主要仪器：镊子（DUMONT 41005AntimagneticE， China）、体视显微镜（Laica S6D， Germany）、全自动倒置荧光显微镜（Olympus IX83， Japan）、激光共聚焦显微镜（Leica SP8， Germany）。
1.2方法
1.2.1采样
在小麦生长到孕穗期后开始采样，每隔24 h进行采样，每次采样只采集小穗上的一粒并迅速置于无水乙醇中保存。
1.2.2子房和胚珠的分离
采集的小穗在体视显微镜下进行观察并使用镊子解剖。剥掉外稃、内稃和花药，将子房从小穗轴上剥离并将离体子房浸入无水乙醇中保存。利用镊子破坏膨大子房的子房壁组织获得离体胚珠。全自动倒置荧光显微成像系统测量离体子房和胚珠的直径大小。
1.2.3染色
离体子房和胚珠先后置于10 μg/mL PI和0.1%吐温20分别染色60 min，再置于20 μg/mL WGAAF 488中染色60 min;染色完成后使用10×PBS冲洗4～6次，每次冲洗时间不少于2 min。将完成染色处理的离体子房和胚珠保存在10×PBS溶液中准备观察。所有染色过程均在室温下进行。
1.2.4样品的观察
将染色处理后的离体子房和胚珠放置玻片上，并倒置于激光共聚焦显微镜成像系统的载物台上，进行观察并层扫拍照。激光发射光波的设定参数为WGAAF 488激发蓝光波长488 nm，发射光波长为510～570 nm;PI激发绿光波长561 nm，发射光波长为590～820 nm。
2结果和分析
在染色过程中，WGA作为从谷物中分离的植物源凝集素蛋白，可特异性地与真菌细胞壁中的几丁质结合并诱导寄主和病原菌之间的特异性识别[24]。Alexa Flour 488偶联蛋白优于包括Cy2在内的其他荧光素，不仅亮度更高，而且光稳定性更好，在pH为4～10的范围内均可以保持稳定状态。Alexa Flour 488与WGA共轭结合所制成的染料可以使小麦矮腥黑粉菌菌丝在激光共聚焦显微镜的特定光波下呈现绿色。PI是一种常见的荧光染料，可以与寄主细胞内的核酸结合使细胞在激光共聚焦显微镜的特定光波下呈现红色。小麦矮腥黑穗病发病样品的整个培养过程都处于无菌和消毒的环境中，所有的用具都经过灭菌，确保只接种小麦矮腥黑粉菌。因此，综合利用WGAAF 488和PI染色可以在激光共聚焦显微镜下显示小麦矮腥黑粉菌菌丝在小麦子房或胚珠中的侵染状态和分布区域（图1）。 3讨论
本试验为研究病原菌侵染植物组织提供了一种三维立体构象技术，采用本试验所述的方法，能够实现对小麦矮腥黑粉菌侵染小麦子房和胚珠的过程进行追踪和观察。结果显示，这种方法能够对离体子房和胚珠内部细胞的结构进行准确成像，并识别小麦矮腥黑粉菌的菌丝。
当前，激光共聚焦显微镜被广泛应用于分子细胞生物学的研究，并在病原菌亚细胞定位、组织细胞生理代谢观察和侵染循环研究等方面发挥着重要作用，相比于其他显微镜技术，CLSM大大提高了荧光图像的分辨率和准确率[2526]。利用激光共聚焦显微镜追踪和观察植物体内的病原菌已有先例，Kelliher等[27]利用激光共聚焦显微镜揭示了玉米花药中5种细胞的发育历程和分裂模式;Gao等[28]在此基础上利用激光共聚焦显微镜并结合数据统计分析发现玉米瘤黑粉菌Ustilago maydis能够影响并延迟玉米花药细胞的发育;蔚慧欣等[29]也利用WGAAF 488和PI染色，观察了小麦矮腥黑粉菌在小麦叶片中的初步侵染。在激光共聚焦显微镜的操作上，我们适当提高了发射光波的长度范围以更好地识别染料的荧光。在我们的研究中还发现，当离体子房直径比较大的时候，激光共聚焦显微镜对子房内部结构尤其是胚珠的成像相较于外部子房壁细胞是比较模糊的，因此我们对子房进一步解剖并分离出胚珠，获得了胚珠细胞的清晰图像（图1d～f）。
与传统的植物石蜡切片技术相比，本试验的方法避免了制片过程中对子房和胚珠内部结构的破坏，尤其是对组织细胞的变形和损伤。传统技术方法所呈现的二维平面图像无法对整个小麦子房和胚珠的立体结构进行扫描，而本试验的方法在精准获取植物组织细胞图像的基础上，还能够对病原菌进行标记和示踪。从结果上来看，本试验的方法为研究病原菌侵染寄主组织提供了一种有意义的解决方案。
参考文献
[1]HOFFMAN J A. Bunt of wheat [J]. Plant Disease， 1982： 979986.
[2]TRIONE E J， HESS W M， STOCKWELL V O. Growth and sporulation of the dikaryons of the dwarf bunt fungus in wheat plants and in culture [J]. Canadian Journal of Botany， 1989， 67（6）： 16711680.
[3]郭予元. 中国农作物病虫害[M]. 北京： 中国农业出版社， 2014： 615618.
[4]魏淑秋， 章正， 郑耀水. 应用生物气候相似距对小麦矮化腥黑穗病在我国定殖可能性的研究[J]. 北京农业大学学报， 1995， 21（2）： 127132.
[5]陈克， 章正. 小麦矮腥黑穗病在中国定殖风险分析及区划研究[J]. 植物病理学报， 2002， 32（4）： 312318.
[6]周益林，段霞瑜，贾文明，等.小麥矮腥黑穗病（TCK）传入中国及其定殖的风险分析研究进展[J].植物保护，2007，33（2）：610.
[7]KOCHANOV M， ZOUHAR M， PROKINOV E， et al. Detection of Tilletia controversa and Tilletia caries in wheat by PCR method [J]. Plant Soil and Environment，2004，50（2）：7577.
[8]MCDONALD J G， WONG E， KLASSEN G R. Differentiation of Tilletia species by repPCR genomic fingerprinting[J]. Plant Disease， 2000， 84： 11211125.
[9]YUAN Qing， NIAN Siji， YIN Youping， et al. Development of a PCRbased diagnostic tool specific to wheat dwarf bunt， caused by Tilletia controversa[J]. European Journal of Plant Pathology， 2009， 124（4）： 585594.
[10]GAO Li， CHEN Wanquan， LIU Taiguo. Development of a SCAR marker by intersimple sequence repeat for diagnosis of dwarf bunt of wheat and detection of Tilletia controversa Kühn[J]. Folia Microbiologica， 2010， 55（3）： 258264.
[11]GAO Li， CHEN Wanquan， LIU Taiguo. An ISSRbased approach for the molecular detection and diagnosis of dwarf bunt of wheat， caused by Tilletia controversa Kühn [J]. Journal of Phytopathology， 2011， 159： 155158.
[12]KNIGHT N L， SUTHERLAND M W. A rapid differential staining technique for Fusarium pseudograminearum in cereal tissues during crown rot infections [J]. Plant Pathology， 2011， 60（6）： 11401143. [13]CHIU Wanling， NIWA Y， ZENG Weike， et al. Engineered GFP as a vital reporter in plants [J]. Current Biology， 1996， 6（3）： 325330.
[14]LORANG J M， TUORI R P， MARTINEZ J P， et al. Green fluorescent protein is lighting up fungal biology[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2001， 67（5）： 19871994.
[15]OREN L， EZRATI S， COHEN D， et al. Early events in the Fusarium verticillioidesmaize interaction characterized by using a green fluorescent proteinexpressing transgenic isolate[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2003， 69（3）： 16951701.
[16]RAJASEKARAN K， CARY J W， COTTY P J， et al. Development of a GFPexpressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion， colonization， and resistance in cottonseed [J]. Mycopathologia， 2008， 165（2）： 8997.
[17]徐莹， 刘太国， 何月秋， 等. 绿色荧光蛋白及其在丝状真菌研究中的应用[J]. 植物保护， 2008， 34（6）： 16.
[18]ANDARGIE M， LI Luoye， FENG Aiqing， et al. Development of a GFPexpressing Ustilaginoidea virens strain to study fungal invasion and colonization in rice spikelets [J]. South African Journal of Botany， 2015， 97： 1624.
[19]刘甜甜，周倩，吴秋云，等.马铃薯晚疫病菌侵染的Solophenyl Flavine荧光染色方法研究[J].植物科学学报，2016，34（2）：316324.
[20]HOCH H C， GALVANI C D， SZAROWSKI D H， et al. Two new fluorescent dyes applicable for visualization of fungal cell walls [J]. Mycologia， 2005， 97（3）： 580588.
[21]李惠霞， 刘永刚， 张俊莲， 等. 马铃薯对晚疫病水平抗性的组织细胞学观察[J]. 西北植物學报， 2015， 35（8）： 15541559.
[22]FERNANDEZ J A， DURAN R. Hypodermic inoculation， a rapid technique for producing dwarf bunt in wheat [J]. Plant Disease Reporter，1978， 62（4）： 336337.
[23]姚卓， 陈万权， 高利， 等. 小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发和室内人工接种方法的探索[J]. 植物保护， 2014， 40（3）： 122126.
[24]MIDOUX P， GRIVET J P， DELMOTTE F， et al. The binding of monosaccharides to wheat germ agglutinin： Fluorescence and NMR investigations [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 1984， 119（2）： 603611.
[25]LAMPRECHT A， SCHFER U F， LEHR C. Characterization of microcapsules by confocal laser scanning microscopy： structure， capsule wall composition and encapsulation rate [J]. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics， 2000， 49（1）： 19.
[26]HONG Ren， LIU Yong， SUN Jingsan. Observation of rice embryo sac development with confocal laser scanning microscopy [J]. Acta Botanica Sinica， 1998， 40（9）： 786789.
[27]KELLIHER T， WALBOT V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule [J]. Developmental Biology， 2011， 350（1）： 3249.
[28]GAO Li， KELLIHER T， NGUYEN L， et al. Ustilago maydis reprograms cell proliferation in maize anthers [J].Plant Journal for Cell and Molecular Biology，2013，75（6）：903914.
[29]蔚慧欣，高利，沈慧敏，等.小麦矮腥黑粉菌在小麦体内侵染过程的显微观察[J].中国科学：生命科学，2016，46（5）：637645.
（责任编辑：田喆）
关键词小麦矮腥黑粉菌;碘化丙啶;麦胚凝集素;激光共聚焦显微镜
中图分类号：S 435.121
文献标识码：A
DOI：10.16688/j.zwbh.2018059
小麦矮腥黑粉菌Tilletia controversa Kühn（TCK）引起的小麦矮腥黑穗病对小麦的安全生产危害巨大[1]。被小麦矮腥黑粉菌侵染发病的小麦植株多分蘖和矮化，正常的籽粒被发育成熟的孢子团（菌癭）完全取代形成病粒，通常发病率约等于产量损失率[12]。除了导致小麦产量损失外，小麦矮腥黑粉菌冬孢子中含有的三甲胺会严重影响小麦面粉的品质和人体健康，而且该病菌在2007年被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》[3]。我国的部分冬麦区也面临小麦矮腥黑粉菌传入和定殖的风险[46]。当前大多数研究都集中在对小麦矮腥黑粉菌的风险分析和分子鉴定[79]上，并取得了长足的进展和广泛的应用，使得小麦矮腥黑粉菌的检测灵敏度可以达到0.1 fg/μL[1011]。然而，小麦矮腥黑粉菌与寄主互作方面的研究却极少见，该方面的研究将加深我们对小麦矮腥黑粉菌侵染机制的理解，并为小麦矮腥黑穗病的有效防治提供理论依据。
病原菌在寄主体内的显微观察是了解病原菌侵染过程较为直观的方式。传统的观察方法是将寄主组织整体透明染色后借助显微镜观察，操作步骤十分耗时和繁琐，制片过程中还有可能破坏幼嫩的植物组织[12]。而利用绿色荧光蛋白标记病原菌再借助荧光显微镜观察的方法是过去十几年发展比较成熟的另一种技术[1315]，在许多病原菌的侵染观察上获得应用[1618]。但绿色荧光蛋白的转化对于某些真菌难度很大，被标记病原菌的荧光表达量差异也制约着该方法的准确性[19]。当前，借助某些荧光染料对菌丝染色并在荧光显微镜下观察菌丝的方法取得了显著的效果，如Solophenyl Flavine 7GFE[12，20]和苯胺蓝[21]等，这种利用荧光染料与菌丝细胞质成分特异性结合的方法在操作上十分便捷，荧光成像质量高，有着广泛的前景。然而，小麦矮腥黑粉菌侵染小麦子房的细胞学研究一直以来都停留在组织切片技术上[2，22]。因此，有必要开发一种更直观便捷的方法来观察小麦矮腥黑粉菌对寄主的侵染状况。本文借鉴当前菌丝染色的方法结合寄主组织染色，在激光共聚焦显微镜下可实现方便、快捷、准确地观察小麦矮腥黑粉菌侵染小麦子房的显微过程。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1供试样品
本试验所需的小麦矮腥黑穗病发病样品是参照姚卓等[23]的人工培养和室内接种方法，在中国农业科学院植物保护研究所国家生物安全中心中高危病原菌实验室的超低温植物培养箱内培养获得。接种用的供试菌株由美国农业部农业研究院（United States Department of Agriculture， Agricultural Research Service）提供。
1.1.2主要试剂和仪器
本试验所需的主要试剂：无水乙醇、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline， PBS， pH=7.4）和吐温20（Tween 20）购自北京广达恒益生物科技有限公司，碘化丙啶（propidium iodide， PI）和Alexa Flour 488（AF 488）标记的麦胚凝集素（wheat germ agglutinin， WGA）由北京冰达生物科技有限公司代购。
主要仪器：镊子（DUMONT 41005AntimagneticE， China）、体视显微镜（Laica S6D， Germany）、全自动倒置荧光显微镜（Olympus IX83， Japan）、激光共聚焦显微镜（Leica SP8， Germany）。
1.2方法
1.2.1采样
在小麦生长到孕穗期后开始采样，每隔24 h进行采样，每次采样只采集小穗上的一粒并迅速置于无水乙醇中保存。
1.2.2子房和胚珠的分离
采集的小穗在体视显微镜下进行观察并使用镊子解剖。剥掉外稃、内稃和花药，将子房从小穗轴上剥离并将离体子房浸入无水乙醇中保存。利用镊子破坏膨大子房的子房壁组织获得离体胚珠。全自动倒置荧光显微成像系统测量离体子房和胚珠的直径大小。
1.2.3染色
离体子房和胚珠先后置于10 μg/mL PI和0.1%吐温20分别染色60 min，再置于20 μg/mL WGAAF 488中染色60 min;染色完成后使用10×PBS冲洗4～6次，每次冲洗时间不少于2 min。将完成染色处理的离体子房和胚珠保存在10×PBS溶液中准备观察。所有染色过程均在室温下进行。
1.2.4样品的观察
将染色处理后的离体子房和胚珠放置玻片上，并倒置于激光共聚焦显微镜成像系统的载物台上，进行观察并层扫拍照。激光发射光波的设定参数为WGAAF 488激发蓝光波长488 nm，发射光波长为510～570 nm;PI激发绿光波长561 nm，发射光波长为590～820 nm。
2结果和分析
在染色过程中，WGA作为从谷物中分离的植物源凝集素蛋白，可特异性地与真菌细胞壁中的几丁质结合并诱导寄主和病原菌之间的特异性识别[24]。Alexa Flour 488偶联蛋白优于包括Cy2在内的其他荧光素，不仅亮度更高，而且光稳定性更好，在pH为4～10的范围内均可以保持稳定状态。Alexa Flour 488与WGA共轭结合所制成的染料可以使小麦矮腥黑粉菌菌丝在激光共聚焦显微镜的特定光波下呈现绿色。PI是一种常见的荧光染料，可以与寄主细胞内的核酸结合使细胞在激光共聚焦显微镜的特定光波下呈现红色。小麦矮腥黑穗病发病样品的整个培养过程都处于无菌和消毒的环境中，所有的用具都经过灭菌，确保只接种小麦矮腥黑粉菌。因此，综合利用WGAAF 488和PI染色可以在激光共聚焦显微镜下显示小麦矮腥黑粉菌菌丝在小麦子房或胚珠中的侵染状态和分布区域（图1）。 3讨论
本试验为研究病原菌侵染植物组织提供了一种三维立体构象技术，采用本试验所述的方法，能够实现对小麦矮腥黑粉菌侵染小麦子房和胚珠的过程进行追踪和观察。结果显示，这种方法能够对离体子房和胚珠内部细胞的结构进行准确成像，并识别小麦矮腥黑粉菌的菌丝。
当前，激光共聚焦显微镜被广泛应用于分子细胞生物学的研究，并在病原菌亚细胞定位、组织细胞生理代谢观察和侵染循环研究等方面发挥着重要作用，相比于其他显微镜技术，CLSM大大提高了荧光图像的分辨率和准确率[2526]。利用激光共聚焦显微镜追踪和观察植物体内的病原菌已有先例，Kelliher等[27]利用激光共聚焦显微镜揭示了玉米花药中5种细胞的发育历程和分裂模式;Gao等[28]在此基础上利用激光共聚焦显微镜并结合数据统计分析发现玉米瘤黑粉菌Ustilago maydis能够影响并延迟玉米花药细胞的发育;蔚慧欣等[29]也利用WGAAF 488和PI染色，观察了小麦矮腥黑粉菌在小麦叶片中的初步侵染。在激光共聚焦显微镜的操作上，我们适当提高了发射光波的长度范围以更好地识别染料的荧光。在我们的研究中还发现，当离体子房直径比较大的时候，激光共聚焦显微镜对子房内部结构尤其是胚珠的成像相较于外部子房壁细胞是比较模糊的，因此我们对子房进一步解剖并分离出胚珠，获得了胚珠细胞的清晰图像（图1d～f）。
与传统的植物石蜡切片技术相比，本试验的方法避免了制片过程中对子房和胚珠内部结构的破坏，尤其是对组织细胞的变形和损伤。传统技术方法所呈现的二维平面图像无法对整个小麦子房和胚珠的立体结构进行扫描，而本试验的方法在精准获取植物组织细胞图像的基础上，还能够对病原菌进行标记和示踪。从结果上来看，本试验的方法为研究病原菌侵染寄主组织提供了一种有意义的解决方案。
参考文献
[1]HOFFMAN J A. Bunt of wheat [J]. Plant Disease， 1982： 979986.
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[18]ANDARGIE M， LI Luoye， FENG Aiqing， et al. Development of a GFPexpressing Ustilaginoidea virens strain to study fungal invasion and colonization in rice spikelets [J]. South African Journal of Botany， 2015， 97： 1624.
[19]刘甜甜，周倩，吴秋云，等.马铃薯晚疫病菌侵染的Solophenyl Flavine荧光染色方法研究[J].植物科学学报，2016，34（2）：316324.
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（责任编辑：田喆）