角膜缘干细胞(LSCs)对维持角膜上皮的稳定和角膜组织透明性有重要作用。Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)抑制剂Y-27632能够促进人胚胎干细胞、角质上皮细胞等的增生，减少细胞凋亡。
目的探讨Y-27632对离体兔角膜保存和体外LSCs扩增能力的影响。
方法在细胞培养基MEM中加入质量分数12. 5%硫酸软骨素、质量分数10. 0%低分子右旋糖酐、20. 0 mg/L地塞米松、100 mg/L妥布霉素注射液、9. 5 g/L Hepes，使用时添加0. 375 mg/L L-谷氨酰胺，制备成角膜活性保存液。将新西兰大白兔的角膜组织片分别置于含或不含Y-27632的角膜活性保存液中保存4、7、14 d，采用质量分数0. 25%锥虫蓝和质量分数0. 2%茜素红染色法观察角膜内皮细胞密度及形态，采用Giemsa染色法并使用Image J图像分析软件计数克隆球数量和LSCs活性，计算LSCs存活率和克隆形成效率。
结果角膜片保存4 d时，Y-27632保存液组和单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞形态无明显差别，角膜片保存7 d时，Y-27632保存液组角膜内皮细胞形态仍保持规则的六边形，而单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞的细胞膜轻微皱缩，少数细胞体积变大。角膜片保存14 d时单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞可见较多的茜素红斑。单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞计数为(2 262±75)/mm2，Y-27632保存液组角膜内皮细胞计数为(2 425±95)/mm2，差异有统计学意义(P<0. 001)。新鲜角膜片和角膜片保存4 d时，Y-27632保存液组和单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆球均较大，其内细胞数较多，而保存7 d和14 d时，与Y-27632保存液组比较，单纯角膜中期保存液组LSCs克隆球直径明显缩小。新鲜分离的角膜片和角膜片保存4 d时，Y-27632保存液组与单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆形成率和角膜上皮细胞存活率的差异均无统计学意义(均P>0. 05)；角膜片保存7 d和14 d时，角膜缘上皮细胞的活性率分别为(73. 00±2. 12)%和(56. 00±0. 71)%，明显高于单纯角膜中期培养液组的(66. 00±4. 00)%和(49. 00±0. 71)%，差异均有统计学意义(t＝3. 098，P＝0. 018；t＝9. 798，P＝0. 000)；角膜片保存7 d和14 d时，Y-27632保存液组与单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆形成效率分别为(11. 05±0. 21)%和(3. 10±1. 97)%，明显高于单纯角膜中期保存液组中的(2. 05±1. 20)%和(0. 40±0. 14)%，差异均有统计学意义(t＝18. 107，P＝0. 000；t＝3. 184，P＝0. 017)。
结论角膜保存液中添加Y-27632可明显提高离体角膜保存的效果，同时可维持LSCs的活性及克隆形成能力。Y-27632可作为角膜保存液的有效添加成分。