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[摘要]奶牛传染性鼻气管炎对奶牛的产奶量及繁殖性能有影响,奶牛群继发性流产有时高达50%。本研究于2006-2008年对某省部分奶牛场进行这5种疫病的血清学监测,以了解这些病的流行情况,尽早控制,减少损失,保障某省奶牛养殖业的快速发展。
[关键词]乙型肝炎;奶牛传染病;检测
一、材料与方法
1.材料
乙型肝炎诊断试剂盒购于上海某生物有限公司;牛传染性胸膜肺炎补体结合反应抗原、标准阴性血清和阳性血清、溶血素补体由某生物制品厂提供;牛传染性鼻气管炎抗原、IBR弱毒株、阳性血清购于中国兽医药品监察所,阴性血清取自检查牛;奶牛血清来源于某省市的奶牛场和奶牛专业户。
2.方法
(1)酶联免疫吸附试验检测奶牛类人乙型肝炎
①每孔加入待检样品50μL,设阴、阳性对照各2孔,每孔50μL,并设空白对照1孔。②手工洗板,弃去孔内液体,洗涤液注满每孔静置5s,甩干、重复5次。③每孔加入酶结合物50μL(空白对照除外),充分混匀,封板,置37℃孵育30min。④重复操作②。⑤每孔加显色剂A液、B液各50μL,充分混匀,封板,置37℃孵育15min。⑥每孔加入终止液50μL,混匀。⑦用酶标仪读数,取波长在450nm,先用空白孔校零,然后读取每孔D值。
(2)类人乙型肝炎病理形态学观察
用肝脏穿刺法观察类人乙型肝炎病理形态学。用长12~15cm,内径3mm的长注射针头对20头奶牛11~12肋间进行穿刺,取肝脏组织活体样本,将其保存于10%福尔马林中。同时解剖HBsAg、HBeAg双阳性奶牛,做病理切片观察。用HE、VanGieson-氏、过碘酸一苯肼Schiff(PAS)希夫氏染色法分别对肝脏组织切片.进行染色,同时用透视电镜做超微结构观察。另将一部分肝脏组织活体样本放在灭菌的平皿中,剪碎研磨,用灭菌生理盐水稀释后,吸取上清液1.5mL,置Eppendorf管中,经差数离心和饱和硫酸铵沉淀,初提物再经150、300、500g/L蔗糖梯度离心,PEG浓缩后,负染,电镜观察病毒颗粒。
(3)补体结合反应检测牛传染性胸膜肺炎
血清(包括被检血清(样品血清)、阳性血清(补体结合试验标准血清)、阴性血清(补体结合试验标准血清)、致敏红细胞(对照)、抗原(对照)孔分别加入抗原(补体结合试验抗原),阴性血清对照孔、致敏红细胞对照孔不加抗原;然后分别加入补体,致敏红细胞对照孔不加补体;再加入灭菌巴比妥缓冲液,振荡混匀后置37℃水浴30min;再加入6%致敏红细胞(绵羊红细胞与15个单位的溶血素混合液),振荡均匀后置37℃30min,2000r/min离心5min,观察结果。
二、试验结果
1.奶牛乙型肝炎
(1)奶牛肝功能检测
对HBsAg、HBeAg双阳性的奶牛进行肝功能检测,在10头双阳性中有8头的谷氨酸丙酮转氨酶(GPT)≥谷氨酸草酰酸转氨酶(GOT),GPT在400~600U/L之間,表现为急性病毒性乙型肝炎(AHB)。2头奶牛血清GPT缓慢上升,缓慢下降,GPT在200—300U/L之间,表现为慢性病毒性乙型肝炎(CHB)。
(2)奶牛乙型肝炎病毒形态学观察
将HB-sAg、HBeAg双阳性奶牛肝脏组织做电镜观察,发现肝脏组织中有密集的HBV颗粒,包括大球形Dane颗粒、小球形颗粒、管球形颗粒3种。这些颗粒与人HBV的颗粒相似(图1)。
(3)奶牛乙型肝炎病理组织学观察
病牛肝脏主要表现为肝细胞的变性:胞浆疏松、气球样变(水肿变性)、脂肪变性、嗜酸性变、毛玻璃样变,肝细胞坏死,炎症细胞浸润,肝实质细胞增生和间质组织增生(图2、3)。
(4)奶牛乙型肝炎超微结构观察
肝细胞胞浆内线粒体变性、坏死、溶解、消失。核膜的双层膜不清晰或破裂,核孔增大。胶质纤维变性、严重肿胀、变性、坏死(图4、5)。
2.奶牛传染性鼻气管炎
传染性鼻气管炎抗体滴度测定结果
对29份阳性反应奶牛血清中和抗体滴度进行测定,血清两倍递增稀释,从1:1~1:32,结果均为阳性反应(中和指数在50%以上为阳性)(表1)。
三、治疗
目前奶牛乙型肝炎、传染性鼻气管炎尚无有效的治疗药物,只有对症治疗。为防止细菌的继续感染,可应用抗病毒药物和广谱抗生素或磺胺类药物进行治疗,高热时可注射复方氨基比林20~40mL。同时,也可强心、补液、解毒治疗,如林格氏液1000~3000mL/次,安钠加2~5g/次、VC2~4g/次,每日2次。如关节痛可注射水杨酸钠溶液。
四、综合防制措施
从科学养殖人手,改善饲养环境,加强综合管理,采用合理的免疫程序。
1.预防注射
免疫是预防各种疫病的有效手段,特别是目前需要免疫的疫苗种类很多,一定要制定合理的免疫程序,适时做好奶牛类人乙型肝炎、传染性鼻气管炎的免疫。用牛传染性鼻气管炎灭活苗免疫奶牛,经过半年的观察,临床症状好转;对疫区和受威胁区6月龄以上的牛,必须每年接种1次牛传染性鼻气管炎灭活苗。当暴发本病时,应立即隔离,同时对所有牛进行牛传染性鼻气管炎的疫苗接种。牛传染性鼻气管炎疫苗目前有3种:鼻内注射苗、匈牙利热稳定苗和灭活疫苗(即为甲醛灭活的氢氧化铝胶浓苗),可根据疫苗说明书选用。不从疫区引进牛,发病地区建议在首次免疫后或紧急免疫后21~28d进行一次加强免疫。建议规模化奶牛场加强牛群免疫抗体的监测,抗体水平低下时应及时补免。
2.严格执行检疫制度
从没有疫情的地方购进奶牛,购买前要查看检疫证明,购进后一定要隔离饲养14d以上,无异常情况再混群饲养。
3.加强饲养管理
采用全进全出的养殖模式。冬天既要注意牛舍的保暖,又要注意通风。在高热季节,做好奶牛舍的通风和防暑降温,提供充足的清洁饮水。保持牛舍干燥,保持合理的饲养密度,降低应激因素。保证充足的营养,增强奶牛群抗病能力。
4.对饲养环境执行严格消毒
搞好环境卫生,及时清除奶牛舍粪便及排泄物,对各种污染物进行无害化处理。使用复合醛类等消毒剂对饲养场、奶牛舍内及周边环境进行消毒,农村散养奶牛专业户的牛圈舍可使用新鲜的生石灰进行消毒。
参考文献
[1]朱其太.牛传染性胸膜肺炎的研究概述[J].畜牧与兽医,1999,5:40~42
[2]姚春雨,张志刚,孙国权,等.酶联免疫吸附试验及其在奶牛疾病诊断中的应用[J].中国畜牧兽医,2008,35(3):61~63.
[3]律祥君,崔金良,邹丽,等.黄牛感染人乙型肝炎病毒的研究[J].中国兽医科技,1992,22(4):3~4
[关键词]乙型肝炎;奶牛传染病;检测
一、材料与方法
1.材料
乙型肝炎诊断试剂盒购于上海某生物有限公司;牛传染性胸膜肺炎补体结合反应抗原、标准阴性血清和阳性血清、溶血素补体由某生物制品厂提供;牛传染性鼻气管炎抗原、IBR弱毒株、阳性血清购于中国兽医药品监察所,阴性血清取自检查牛;奶牛血清来源于某省市的奶牛场和奶牛专业户。
2.方法
(1)酶联免疫吸附试验检测奶牛类人乙型肝炎
①每孔加入待检样品50μL,设阴、阳性对照各2孔,每孔50μL,并设空白对照1孔。②手工洗板,弃去孔内液体,洗涤液注满每孔静置5s,甩干、重复5次。③每孔加入酶结合物50μL(空白对照除外),充分混匀,封板,置37℃孵育30min。④重复操作②。⑤每孔加显色剂A液、B液各50μL,充分混匀,封板,置37℃孵育15min。⑥每孔加入终止液50μL,混匀。⑦用酶标仪读数,取波长在450nm,先用空白孔校零,然后读取每孔D值。
(2)类人乙型肝炎病理形态学观察
用肝脏穿刺法观察类人乙型肝炎病理形态学。用长12~15cm,内径3mm的长注射针头对20头奶牛11~12肋间进行穿刺,取肝脏组织活体样本,将其保存于10%福尔马林中。同时解剖HBsAg、HBeAg双阳性奶牛,做病理切片观察。用HE、VanGieson-氏、过碘酸一苯肼Schiff(PAS)希夫氏染色法分别对肝脏组织切片.进行染色,同时用透视电镜做超微结构观察。另将一部分肝脏组织活体样本放在灭菌的平皿中,剪碎研磨,用灭菌生理盐水稀释后,吸取上清液1.5mL,置Eppendorf管中,经差数离心和饱和硫酸铵沉淀,初提物再经150、300、500g/L蔗糖梯度离心,PEG浓缩后,负染,电镜观察病毒颗粒。
(3)补体结合反应检测牛传染性胸膜肺炎
血清(包括被检血清(样品血清)、阳性血清(补体结合试验标准血清)、阴性血清(补体结合试验标准血清)、致敏红细胞(对照)、抗原(对照)孔分别加入抗原(补体结合试验抗原),阴性血清对照孔、致敏红细胞对照孔不加抗原;然后分别加入补体,致敏红细胞对照孔不加补体;再加入灭菌巴比妥缓冲液,振荡混匀后置37℃水浴30min;再加入6%致敏红细胞(绵羊红细胞与15个单位的溶血素混合液),振荡均匀后置37℃30min,2000r/min离心5min,观察结果。
二、试验结果
1.奶牛乙型肝炎
(1)奶牛肝功能检测
对HBsAg、HBeAg双阳性的奶牛进行肝功能检测,在10头双阳性中有8头的谷氨酸丙酮转氨酶(GPT)≥谷氨酸草酰酸转氨酶(GOT),GPT在400~600U/L之間,表现为急性病毒性乙型肝炎(AHB)。2头奶牛血清GPT缓慢上升,缓慢下降,GPT在200—300U/L之间,表现为慢性病毒性乙型肝炎(CHB)。
(2)奶牛乙型肝炎病毒形态学观察
将HB-sAg、HBeAg双阳性奶牛肝脏组织做电镜观察,发现肝脏组织中有密集的HBV颗粒,包括大球形Dane颗粒、小球形颗粒、管球形颗粒3种。这些颗粒与人HBV的颗粒相似(图1)。
(3)奶牛乙型肝炎病理组织学观察
病牛肝脏主要表现为肝细胞的变性:胞浆疏松、气球样变(水肿变性)、脂肪变性、嗜酸性变、毛玻璃样变,肝细胞坏死,炎症细胞浸润,肝实质细胞增生和间质组织增生(图2、3)。
(4)奶牛乙型肝炎超微结构观察
肝细胞胞浆内线粒体变性、坏死、溶解、消失。核膜的双层膜不清晰或破裂,核孔增大。胶质纤维变性、严重肿胀、变性、坏死(图4、5)。
2.奶牛传染性鼻气管炎
传染性鼻气管炎抗体滴度测定结果
对29份阳性反应奶牛血清中和抗体滴度进行测定,血清两倍递增稀释,从1:1~1:32,结果均为阳性反应(中和指数在50%以上为阳性)(表1)。
三、治疗
目前奶牛乙型肝炎、传染性鼻气管炎尚无有效的治疗药物,只有对症治疗。为防止细菌的继续感染,可应用抗病毒药物和广谱抗生素或磺胺类药物进行治疗,高热时可注射复方氨基比林20~40mL。同时,也可强心、补液、解毒治疗,如林格氏液1000~3000mL/次,安钠加2~5g/次、VC2~4g/次,每日2次。如关节痛可注射水杨酸钠溶液。
四、综合防制措施
从科学养殖人手,改善饲养环境,加强综合管理,采用合理的免疫程序。
1.预防注射
免疫是预防各种疫病的有效手段,特别是目前需要免疫的疫苗种类很多,一定要制定合理的免疫程序,适时做好奶牛类人乙型肝炎、传染性鼻气管炎的免疫。用牛传染性鼻气管炎灭活苗免疫奶牛,经过半年的观察,临床症状好转;对疫区和受威胁区6月龄以上的牛,必须每年接种1次牛传染性鼻气管炎灭活苗。当暴发本病时,应立即隔离,同时对所有牛进行牛传染性鼻气管炎的疫苗接种。牛传染性鼻气管炎疫苗目前有3种:鼻内注射苗、匈牙利热稳定苗和灭活疫苗(即为甲醛灭活的氢氧化铝胶浓苗),可根据疫苗说明书选用。不从疫区引进牛,发病地区建议在首次免疫后或紧急免疫后21~28d进行一次加强免疫。建议规模化奶牛场加强牛群免疫抗体的监测,抗体水平低下时应及时补免。
2.严格执行检疫制度
从没有疫情的地方购进奶牛,购买前要查看检疫证明,购进后一定要隔离饲养14d以上,无异常情况再混群饲养。
3.加强饲养管理
采用全进全出的养殖模式。冬天既要注意牛舍的保暖,又要注意通风。在高热季节,做好奶牛舍的通风和防暑降温,提供充足的清洁饮水。保持牛舍干燥,保持合理的饲养密度,降低应激因素。保证充足的营养,增强奶牛群抗病能力。
4.对饲养环境执行严格消毒
搞好环境卫生,及时清除奶牛舍粪便及排泄物,对各种污染物进行无害化处理。使用复合醛类等消毒剂对饲养场、奶牛舍内及周边环境进行消毒,农村散养奶牛专业户的牛圈舍可使用新鲜的生石灰进行消毒。
参考文献
[1]朱其太.牛传染性胸膜肺炎的研究概述[J].畜牧与兽医,1999,5:40~42
[2]姚春雨,张志刚,孙国权,等.酶联免疫吸附试验及其在奶牛疾病诊断中的应用[J].中国畜牧兽医,2008,35(3):61~63.
[3]律祥君,崔金良,邹丽,等.黄牛感染人乙型肝炎病毒的研究[J].中国兽医科技,1992,22(4):3~4