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摘 要：对肇庆特色黄皮的果实进行研究，利用挥发油提取器，采用水蒸气蒸馏法提取果实中的挥发油，通过GCMS计算机联用仪鉴定其成分并采用峰面积归一法得到各组分的相对含量。结果分离出25个峰，鉴定了23种，其中β-水芹烯（36.97%）、4-萜烯醇（17.58%）、桧烯（13.76%）这三种物质含量相对较高。对挥发油抗氧化性研究时，探究了其对羟自由基清除率的影响，并发现在一定浓度范围内挥发油浓度与羟自由基的清除率成正相关。
关键词：肇庆； 黄皮果 ；挥发油；成分；GC-MS；羟自由基
中图分类号：S666.6 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20150940001
黄皮，为芸香科黄皮属植物，主要产于广东、广西、海南、云南、福建等地。黄皮具有较高的药用价值，其根、茎、叶、果实、果皮均可入药，具有消除胸腹胀满、生津、止渴、顺气、镇咳等功效。其中果实不仅香甜可口，性温味辛，具有丰富的营养价值，且能行气消食，润肺生津等，很受人们青睐。近年来，又有研究说明产地和环境气候的不同，各地的黄皮挥发油亦有不同，我们对肇庆特色黄皮果实挥发油成分进行提取和分析，有利于更好探究其药理作用，而探究挥发油对羟自由基清除率的影响则可初步了解其抗氧化性能，对肇庆黄皮在药用方面的开发和利用有重要意义。
1 材料、试剂与仪器
黄皮果（购于2013年8月，肇庆市），无水硫酸钠、无水乙醚、七水硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、无水乙醇（均为分析纯），岛津QP2010GCMS计算机联用仪，高速冷冻离心机、722型分光光度计、移液枪、分析天平。
2 实验方法
2.1 挥发油的提取
称取100g新鲜黄皮果，加蒸馏水捣成匀浆，用挥发油提取器进行提取，提取6h后，油水经高速冷冻离心机离心分离初步除水后，再加入少许无水硫酸钠除水后经0.45um滤膜过滤器过滤后得到无色透明的挥发油。
2.2 挥发油成分分析条件
2.2.1 色谱条件
色谱柱RTX-5MS石英毛细管柱（30m*0.25mm*
0.25um）；升温程序为60℃，停留5min，再以4℃/min升温至250℃，保留7min；载气为氦气，柱流量为1.5ml/min，进样量1ul，分流比为10：1。
2.2.2 质谱条件
离子源EI源，离子源温度230℃，电子能量70eV，接口温度为230℃，溶剂延迟4min，扫描范围30～600amu。
2.3 羟自由基清除能力研究
2.3.1 各浓度的挥发油溶液的制备
用二分法以60%乙醇为溶剂配制出1、2、4、8、16mg/ml的挥发油溶液备用。
2.3.2 其他溶液的配制
称取2.502g的七水硫酸亚铁，用水定溶到1000ml去离子水中，制得9mmol/L的硫酸亚铁溶液，置于阴暗处；称取1.243g的水杨酸晶体，用无水乙醇定溶到1000ml，制得9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液；取889ul30%的过氧化氢定，用去离子水定溶到1000ml，制得8.8mmol/L的过氧化氢溶液，备用。
2.3.3 挥发油的羟自由基清除率的测定
用移液枪取9mmol/L硫酸亚铁溶液 1mL、9mmol/L水杨酸-乙醇溶液1mL，不同浓度的样
品溶液1mL，最后加8.8mmol/L过氧化氢1mL启动反应，37℃反应30min；以蒸馏水为参比，在510nm下测定各浓度的吸光度。考虑到样品本身的吸光值，以9mmol/L硫酸亚铁溶液1mL、9mmol/L水杨酸-乙醇溶液1mL，不同浓度的样品溶液1mL和1mL蒸馏水作为样品的本底吸收值，重复做三次，以平均值为测定结果。按下式计算·OH清除率：
A0—空白对照液的吸光度；
Ax—加入样品溶液后的吸光度；
Ax0—不加显色剂H2O2 ，样品溶液本底的吸光度。
3 实验结果
3.1 挥发油得率
采用水蒸气蒸馏法提取肇庆特色黄皮果所得得率为0.4%。
3.2 成分分析
根据2.2的分析条件，得到总离子流图，总离子流图中的各组分峰经质谱扫描后得到质谱图，并通过NIST27和NIST147质谱图谱库及人工解析对照，鉴定出各种成分，通过数据处理系统按峰面积归一法得到各组分的相对百分含量。从肇庆特色黄皮果分离出25种组分，鉴定了23种，其中主要包括萜类和醇类。而含量最高的是β-水芹烯，占了36.97%，另外4-萜烯醇、桧烯这两种物质含量也相对较高，分别占了17.58%和13.76% （见表1）。
3.3 挥发油对羟自由基清除率的影响
由挥发油的羟自由基清除率的测定可知，在1～16mg/ml的范围内，羟自由基清除率曲线是随着浓度的增在而增大的，当浓度为16mg/ml时，清除率达到最大为90.8%（如表2、图1）。
4 分析与讨论
肇庆特色黄皮果的得率与李瑞珍等人[1]所提的广州黄皮果挥发油得率0.4%相当，但略高于唐闻宁等人[2]所提的海南产黄皮果挥发油得率0.39%，从提取得率上看，基本相差不太大。主要差别在于成分及含量上。肇庆特色黄皮果挥发油成分主要是β-水芹烯（36.97%）、4-萜烯醇（17.58%）、桧烯（13.76%），而广州黄皮果挥发油含量较高的是4-萜烯醇（21.06%），γ- 松油烯 （ 12 . 9 0 % ）、 3 ， 7 ， 7 - 三甲基- 二环 [ 4 . 1 . 0 ] 己- 2 -烯 （ 9 . 3 2 % ）；海口黄皮果挥发油含量较高的则是4-萜烯醇（ 28 . 549 % ）、桧萜 （ 14 . 53 9 % ）、γ- 松油烯 （ 4 .868 % ）等。相比较这两个市的黄皮果，其挥发油成分虽大部分相同，但在含量上则明显存在差异，首次对肇庆黄皮果的挥发油进行分析研究，对肇庆特色黄皮在药用方面的开发利用意义重大。而在对肇庆特色黄皮果的挥发油进行抗氧化的初步研究时，得出挥发油对羟自由基有很好的清除效果，在一定浓度范围内，随着挥发油浓度的升高，其对羟自由基的清除率越大，挥发油的浓度与清除率之间有较好的相关性，在1～16mg/ml的范围内呈正相关性。羟自由基的清除率是物质抗氧化性能的重要指标，从实验结果来看，肇庆特色黄皮果挥发油具有一定的抗氧化性。各文献报道[3，4，5]，在一定浓度范围内，羟自由基清除率随着挥发油浓度升高而升高，而黄皮挥发油对羟自由基的影响规律也与文献基本相符。但是姜子涛等人[3]采用水杨酸法研究葛缕子精油对羟自由基清除率的影响时，得出在该精油0.1～0.4mg/ml浓度内即可达到较好的羟自由基清除效果，在该精油为0.4mg/ml浓度即可达到65%左右；陈思佳等人[4]也采用水杨酸法研究柠檬精油对羟自由基清除效果影响时，柠檬精油在0.09～0.72mg/ml浓度内就已有一定的羟自由基清除效果，在0.72mg/ml浓度时已达到60%左右，相比这两种精油，肇庆特色黄皮果挥发油（精油）在羟自由基清除作用方面要相对弱于这两种精油。目前来看，此黄皮果挥发油在抗氧化方面的研究还未有报道，本实验则是以清除羟自由基作用作为抗氧化性能的指标，对于抗氧化的其他重要指标还有待研究，以便更好开发并利用黄皮果挥发油的药用价值。
参考文献
[1]李瑞珍，廖华卫，陈飞苑.广州黄皮果挥发油成分研究[J].广东药学院学报，2007，23（2）：141-143
[2]唐闻宁，康文艺，穆淑珍，郝小江.黄皮果挥发油成分研究[J].天然产物研究与开发，2002 ， 14 （ 2 ）： 26-28 。
[3]姜子涛，孙莫雷，李荣。调味香料葛缕子精油的微波辅助提取及其抗氧化性研究[J].中国调味品，2012，37（4）：109-112.
[4] 陈思佳，刘雅丽，张晨，张向宇.柠檬精油抗氧化活性的研究[J].实用口腔医学杂志，2015，31（2）：66-70
[5] 张福平，汤艳姬，刘晓珍，陈焕彬，陈雪芬.黄皮叶黄酮类化合物的抗氧化性研究[J].南方农业学报，2013，44（8）：1343-1346.
作者简介：梁桥辉（1992-），男，肇庆学院2011级生物技术专业学生。李充璧，肇庆学院生命科学学院教授。
关键词：肇庆； 黄皮果 ；挥发油；成分；GC-MS；羟自由基
中图分类号：S666.6 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20150940001
黄皮，为芸香科黄皮属植物，主要产于广东、广西、海南、云南、福建等地。黄皮具有较高的药用价值，其根、茎、叶、果实、果皮均可入药，具有消除胸腹胀满、生津、止渴、顺气、镇咳等功效。其中果实不仅香甜可口，性温味辛，具有丰富的营养价值，且能行气消食，润肺生津等，很受人们青睐。近年来，又有研究说明产地和环境气候的不同，各地的黄皮挥发油亦有不同，我们对肇庆特色黄皮果实挥发油成分进行提取和分析，有利于更好探究其药理作用，而探究挥发油对羟自由基清除率的影响则可初步了解其抗氧化性能，对肇庆黄皮在药用方面的开发和利用有重要意义。
1 材料、试剂与仪器
黄皮果（购于2013年8月，肇庆市），无水硫酸钠、无水乙醚、七水硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、无水乙醇（均为分析纯），岛津QP2010GCMS计算机联用仪，高速冷冻离心机、722型分光光度计、移液枪、分析天平。
2 实验方法
2.1 挥发油的提取
称取100g新鲜黄皮果，加蒸馏水捣成匀浆，用挥发油提取器进行提取，提取6h后，油水经高速冷冻离心机离心分离初步除水后，再加入少许无水硫酸钠除水后经0.45um滤膜过滤器过滤后得到无色透明的挥发油。
2.2 挥发油成分分析条件
2.2.1 色谱条件
色谱柱RTX-5MS石英毛细管柱（30m*0.25mm*
0.25um）；升温程序为60℃，停留5min，再以4℃/min升温至250℃，保留7min；载气为氦气，柱流量为1.5ml/min，进样量1ul，分流比为10：1。
2.2.2 质谱条件
离子源EI源，离子源温度230℃，电子能量70eV，接口温度为230℃，溶剂延迟4min，扫描范围30～600amu。
2.3 羟自由基清除能力研究
2.3.1 各浓度的挥发油溶液的制备
用二分法以60%乙醇为溶剂配制出1、2、4、8、16mg/ml的挥发油溶液备用。
2.3.2 其他溶液的配制
称取2.502g的七水硫酸亚铁，用水定溶到1000ml去离子水中，制得9mmol/L的硫酸亚铁溶液，置于阴暗处；称取1.243g的水杨酸晶体，用无水乙醇定溶到1000ml，制得9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液；取889ul30%的过氧化氢定，用去离子水定溶到1000ml，制得8.8mmol/L的过氧化氢溶液，备用。
2.3.3 挥发油的羟自由基清除率的测定
用移液枪取9mmol/L硫酸亚铁溶液 1mL、9mmol/L水杨酸-乙醇溶液1mL，不同浓度的样
品溶液1mL，最后加8.8mmol/L过氧化氢1mL启动反应，37℃反应30min；以蒸馏水为参比，在510nm下测定各浓度的吸光度。考虑到样品本身的吸光值，以9mmol/L硫酸亚铁溶液1mL、9mmol/L水杨酸-乙醇溶液1mL，不同浓度的样品溶液1mL和1mL蒸馏水作为样品的本底吸收值，重复做三次，以平均值为测定结果。按下式计算·OH清除率：
A0—空白对照液的吸光度；
Ax—加入样品溶液后的吸光度；
Ax0—不加显色剂H2O2 ，样品溶液本底的吸光度。
3 实验结果
3.1 挥发油得率
采用水蒸气蒸馏法提取肇庆特色黄皮果所得得率为0.4%。
3.2 成分分析
根据2.2的分析条件，得到总离子流图，总离子流图中的各组分峰经质谱扫描后得到质谱图，并通过NIST27和NIST147质谱图谱库及人工解析对照，鉴定出各种成分，通过数据处理系统按峰面积归一法得到各组分的相对百分含量。从肇庆特色黄皮果分离出25种组分，鉴定了23种，其中主要包括萜类和醇类。而含量最高的是β-水芹烯，占了36.97%，另外4-萜烯醇、桧烯这两种物质含量也相对较高，分别占了17.58%和13.76% （见表1）。
3.3 挥发油对羟自由基清除率的影响
由挥发油的羟自由基清除率的测定可知，在1～16mg/ml的范围内，羟自由基清除率曲线是随着浓度的增在而增大的，当浓度为16mg/ml时，清除率达到最大为90.8%（如表2、图1）。
4 分析与讨论
肇庆特色黄皮果的得率与李瑞珍等人[1]所提的广州黄皮果挥发油得率0.4%相当，但略高于唐闻宁等人[2]所提的海南产黄皮果挥发油得率0.39%，从提取得率上看，基本相差不太大。主要差别在于成分及含量上。肇庆特色黄皮果挥发油成分主要是β-水芹烯（36.97%）、4-萜烯醇（17.58%）、桧烯（13.76%），而广州黄皮果挥发油含量较高的是4-萜烯醇（21.06%），γ- 松油烯 （ 12 . 9 0 % ）、 3 ， 7 ， 7 - 三甲基- 二环 [ 4 . 1 . 0 ] 己- 2 -烯 （ 9 . 3 2 % ）；海口黄皮果挥发油含量较高的则是4-萜烯醇（ 28 . 549 % ）、桧萜 （ 14 . 53 9 % ）、γ- 松油烯 （ 4 .868 % ）等。相比较这两个市的黄皮果，其挥发油成分虽大部分相同，但在含量上则明显存在差异，首次对肇庆黄皮果的挥发油进行分析研究，对肇庆特色黄皮在药用方面的开发利用意义重大。而在对肇庆特色黄皮果的挥发油进行抗氧化的初步研究时，得出挥发油对羟自由基有很好的清除效果，在一定浓度范围内，随着挥发油浓度的升高，其对羟自由基的清除率越大，挥发油的浓度与清除率之间有较好的相关性，在1～16mg/ml的范围内呈正相关性。羟自由基的清除率是物质抗氧化性能的重要指标，从实验结果来看，肇庆特色黄皮果挥发油具有一定的抗氧化性。各文献报道[3，4，5]，在一定浓度范围内，羟自由基清除率随着挥发油浓度升高而升高，而黄皮挥发油对羟自由基的影响规律也与文献基本相符。但是姜子涛等人[3]采用水杨酸法研究葛缕子精油对羟自由基清除率的影响时，得出在该精油0.1～0.4mg/ml浓度内即可达到较好的羟自由基清除效果，在该精油为0.4mg/ml浓度即可达到65%左右；陈思佳等人[4]也采用水杨酸法研究柠檬精油对羟自由基清除效果影响时，柠檬精油在0.09～0.72mg/ml浓度内就已有一定的羟自由基清除效果，在0.72mg/ml浓度时已达到60%左右，相比这两种精油，肇庆特色黄皮果挥发油（精油）在羟自由基清除作用方面要相对弱于这两种精油。目前来看，此黄皮果挥发油在抗氧化方面的研究还未有报道，本实验则是以清除羟自由基作用作为抗氧化性能的指标，对于抗氧化的其他重要指标还有待研究，以便更好开发并利用黄皮果挥发油的药用价值。
参考文献
[1]李瑞珍，廖华卫，陈飞苑.广州黄皮果挥发油成分研究[J].广东药学院学报，2007，23（2）：141-143
[2]唐闻宁，康文艺，穆淑珍，郝小江.黄皮果挥发油成分研究[J].天然产物研究与开发，2002 ， 14 （ 2 ）： 26-28 。
[3]姜子涛，孙莫雷，李荣。调味香料葛缕子精油的微波辅助提取及其抗氧化性研究[J].中国调味品，2012，37（4）：109-112.
[4] 陈思佳，刘雅丽，张晨，张向宇.柠檬精油抗氧化活性的研究[J].实用口腔医学杂志，2015，31（2）：66-70
[5] 张福平，汤艳姬，刘晓珍，陈焕彬，陈雪芬.黄皮叶黄酮类化合物的抗氧化性研究[J].南方农业学报，2013，44（8）：1343-1346.
作者简介：梁桥辉（1992-），男，肇庆学院2011级生物技术专业学生。李充璧，肇庆学院生命科学学院教授。