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【摘 要】 目的：建立高效液相色谱测定蓝花参中橙皮苷含量的方法。方法：色谱柱：BEH C18柱（100×2.1 mm，1.7 μm）；检测波长：268 nm；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；乙腈-1%乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。结果：橙皮苷回归方程：y=0.101x+0.401（r=0.9965），线性范围为4.144～82.88μg/mL；橙皮苷的平均加样回收率为97.63%，RSD为1.39%。结论：该法精密度、准确性良好，方法简便快捷，可用于蓝花参中橙皮苷的含量测定。
【关键词】 HPLC；蓝花参；橙皮苷
【中图分类号】R284 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）09-0008-03
蓝花参（Wahlenbergia marginata（Thunb.） A. DC.）为桔梗科蓝花参属的植物，入药部位为根或全草，具有益气健脾、祛痰止咳的功效，临床上常用于治疗气管炎、百日咳[1]等疾病。目前发现蓝花参中含有甾体类化合物如β-谷甾醇葡萄糖苷、多炔类化合物如党参炔苷、苯丙素类化合物如Wahlenbergioside及挥发油如n-十六烷酸[2-4]等化学成分。橙皮苷为课题组首次于蓝花参中发现的黄酮类物质，其相对分子量为610.56 kD[5]。大量的研究表明[6]，橙皮苷在抗肿瘤、心血管保护、神经保护及过敏性哮喘等方面皆有良好的治疗效果。本实验利用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）法测定蓝花参中橙皮苷含量，为建立快速准确测定蓝花参中的橙皮苷提供依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Waters H-class高效液相色谱仪（配有在线脱气机、四元泵、自动进样器，美国Waters公司）；SB-5200DT超声波提取器（宁波新芝生物科技股份有限公司，批号：131897）；BSA224S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，批号：2014-03）。
1.2 材料 蓝花参全草干品购于福州回春中药饮片厂有限公司（批号：14010507），经福建卫生职业技术学院药学系朱扶蓉副教授鉴定为[Wahlenbergia marginata（Thunb.） A.DC.]。
橙皮苷对照品（批号：K02M3C1，上海源叶生物科技有限公司），HPLC级乙腈（批号：20150402）、甲醇（批号：20160411，国药集团化学试剂有限公司）；AR，级乙酸（批号：0812181）、甲酸（批号：1608241，汕头市西陇化工厂有限公司）。
2 方法与结果
2.1 色譜条件与系统适用性试验 流动相乙腈（A）-1%乙酸水（B），梯度洗脱（0～1 min，5%～15%A；1～4 min，15%～20%A；4～7 min，20%～25%A；7～10 min，25%～30%A；10～13 min，30%～35%A；13～16 min，35%～40%A；16～20 min，40%～60%A；20～23 min，60%～70%A）；流速：0.3 mL/min；检测波长268 nm；柱温30 ℃；进样量2 μL。见图1所示。
2.2 对照品溶液制备 精密称定橙皮苷对照品1.036 mg于10 mL容量瓶中，加入甲醇，超声溶解，定容，得到浓度为1.036 mg/mL的对照品贮备液。
2.3 供试品溶液制备 精密称定蓝花参药材约2.0 g，精密加入40%乙醇50 mL，称定重量，超声30 min（250 W、50 Hz）后取出，放至室温，补足重量，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4 标准曲线制备 精密量取橙皮苷对照品溶液适量，稀释成一系列对照品溶液，按2.1项下色谱条件测定，以对照品溶液浓度（C）为横坐标x，峰面积（A）为纵坐标y，得回归方程：y=0.101x+0.401（r=0.9965），线性范围为4.144～82.88 μg/mL。如图2所示。
2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液2 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次。橙皮苷峰面积RSD为0.35%，橙皮苷保留时间（tR）RSD为0.14%，表明该仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验 精密称定蓝花参药材约2.0 g，按“2.3”项下制备供试品溶液，于0，1，2，4，8，12 h，按“2.1”项下色谱条件进样。橙皮苷峰面积RSD为0.51%，说明该供试品在12 h内稳定。
2.7 重复性试验 精密称定蓝花参药材约2.0 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，平行操作6次。橙皮苷的平均含量为698.209 μg/g，RSD为0.47%，说明该方法的重复性良好。
2.8 加样回收率试验 精密称取同批蓝花参药材6份，每份约1.0 g，均精密加入橙皮苷对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样。橙皮苷的平均加样回收率为97.63%，RSD为1.39%。说明该方法准确性高。见表1。
2.9 样品测试 精密称取蓝花参2 g，平行3份，按照“2.3“项下制备供试品溶液，按”2.1”项下色谱条件分别对3份样品进行测定，橙皮苷含量分别为681.221 μg/g、675.365 μg/g、684.981 μg/g，平均值为680.522 μg/g，RSD为0.62%。
3 讨论
文献报道[7]橙皮苷具有较强的抗炎作用，对4种炎症模型均表现出剂量依赖性的抑制作用，而蓝花参经实验证实其高、中剂量均具有抗炎消肿作用[8]。由此推断橙皮苷有可能是其抗炎活性物质基础之一，其具体作用机制有待进一步实验证。
蓝花参中橙皮苷的含量测定未见文献报道，故试验采用HPLC-DAD法对蓝花参中橙皮苷含量进行快速检测，该法简便易行，且精密度、准确性、重复性均良好，为建立快速准确测定蓝花参中的橙皮苷提供依据。
参考文献
[1]国家中药管理局《中华本草》编委会.中华本草：第8册[M].上海：上海科学技术出版社，1999：130-135.
[2]张宗平，贾忠建，朱子清.细叶沙参化学成分的研究[J].兰州大学学报：自然科学版，1987，23（4）：159-160.
[3]W. G. M A， Tan R X， Fuzzati N， et al. Cheminform Abstract： Wahlenbergioside， a Phenylpropanoid Glucoside from Wahlenbergia marginata[J]. Phytochemistry， 1997， 45（2）：411-415.
[4]柯鹏颉.蓝花参中挥发油的气质联用分析[J].海峡药学，2006，18（3）：88-89.
[5]曾茂贵，张宽，罗兰.基于HPLC-DAD-Q-TOF-MS的蓝花参化学成分定性研究[J].中国医院药学杂志，2017，37（11）：23-28.
[6]李雪飞，江洪.橙皮苷药理学作用机制及研究进展[J].海南医学，2016，27（14）：2337-2340.
[7]李荣，胡成穆，姜辉，等.橙皮苷的提取及其抗炎活性研究[J].安徽医科大学学报，2007，42（5）：546-549.
[8]叶华，曾茂贵，罗戢彬凯，等.蓝花参抗炎、止痛的药效学与急性毒性试验研究[J].福建中医药，2012，43（5）：49-50，55.
（收稿日期：2018-03-09 编辑：陶希睿）
【关键词】 HPLC；蓝花参；橙皮苷
【中图分类号】R284 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）09-0008-03
蓝花参（Wahlenbergia marginata（Thunb.） A. DC.）为桔梗科蓝花参属的植物，入药部位为根或全草，具有益气健脾、祛痰止咳的功效，临床上常用于治疗气管炎、百日咳[1]等疾病。目前发现蓝花参中含有甾体类化合物如β-谷甾醇葡萄糖苷、多炔类化合物如党参炔苷、苯丙素类化合物如Wahlenbergioside及挥发油如n-十六烷酸[2-4]等化学成分。橙皮苷为课题组首次于蓝花参中发现的黄酮类物质，其相对分子量为610.56 kD[5]。大量的研究表明[6]，橙皮苷在抗肿瘤、心血管保护、神经保护及过敏性哮喘等方面皆有良好的治疗效果。本实验利用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）法测定蓝花参中橙皮苷含量，为建立快速准确测定蓝花参中的橙皮苷提供依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Waters H-class高效液相色谱仪（配有在线脱气机、四元泵、自动进样器，美国Waters公司）；SB-5200DT超声波提取器（宁波新芝生物科技股份有限公司，批号：131897）；BSA224S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，批号：2014-03）。
1.2 材料 蓝花参全草干品购于福州回春中药饮片厂有限公司（批号：14010507），经福建卫生职业技术学院药学系朱扶蓉副教授鉴定为[Wahlenbergia marginata（Thunb.） A.DC.]。
橙皮苷对照品（批号：K02M3C1，上海源叶生物科技有限公司），HPLC级乙腈（批号：20150402）、甲醇（批号：20160411，国药集团化学试剂有限公司）；AR，级乙酸（批号：0812181）、甲酸（批号：1608241，汕头市西陇化工厂有限公司）。
2 方法与结果
2.1 色譜条件与系统适用性试验 流动相乙腈（A）-1%乙酸水（B），梯度洗脱（0～1 min，5%～15%A；1～4 min，15%～20%A；4～7 min，20%～25%A；7～10 min，25%～30%A；10～13 min，30%～35%A；13～16 min，35%～40%A；16～20 min，40%～60%A；20～23 min，60%～70%A）；流速：0.3 mL/min；检测波长268 nm；柱温30 ℃；进样量2 μL。见图1所示。
2.2 对照品溶液制备 精密称定橙皮苷对照品1.036 mg于10 mL容量瓶中，加入甲醇，超声溶解，定容，得到浓度为1.036 mg/mL的对照品贮备液。
2.3 供试品溶液制备 精密称定蓝花参药材约2.0 g，精密加入40%乙醇50 mL，称定重量，超声30 min（250 W、50 Hz）后取出，放至室温，补足重量，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4 标准曲线制备 精密量取橙皮苷对照品溶液适量，稀释成一系列对照品溶液，按2.1项下色谱条件测定，以对照品溶液浓度（C）为横坐标x，峰面积（A）为纵坐标y，得回归方程：y=0.101x+0.401（r=0.9965），线性范围为4.144～82.88 μg/mL。如图2所示。
2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液2 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次。橙皮苷峰面积RSD为0.35%，橙皮苷保留时间（tR）RSD为0.14%，表明该仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验 精密称定蓝花参药材约2.0 g，按“2.3”项下制备供试品溶液，于0，1，2，4，8，12 h，按“2.1”项下色谱条件进样。橙皮苷峰面积RSD为0.51%，说明该供试品在12 h内稳定。
2.7 重复性试验 精密称定蓝花参药材约2.0 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，平行操作6次。橙皮苷的平均含量为698.209 μg/g，RSD为0.47%，说明该方法的重复性良好。
2.8 加样回收率试验 精密称取同批蓝花参药材6份，每份约1.0 g，均精密加入橙皮苷对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样。橙皮苷的平均加样回收率为97.63%，RSD为1.39%。说明该方法准确性高。见表1。
2.9 样品测试 精密称取蓝花参2 g，平行3份，按照“2.3“项下制备供试品溶液，按”2.1”项下色谱条件分别对3份样品进行测定，橙皮苷含量分别为681.221 μg/g、675.365 μg/g、684.981 μg/g，平均值为680.522 μg/g，RSD为0.62%。
3 讨论
文献报道[7]橙皮苷具有较强的抗炎作用，对4种炎症模型均表现出剂量依赖性的抑制作用，而蓝花参经实验证实其高、中剂量均具有抗炎消肿作用[8]。由此推断橙皮苷有可能是其抗炎活性物质基础之一，其具体作用机制有待进一步实验证。
蓝花参中橙皮苷的含量测定未见文献报道，故试验采用HPLC-DAD法对蓝花参中橙皮苷含量进行快速检测，该法简便易行，且精密度、准确性、重复性均良好，为建立快速准确测定蓝花参中的橙皮苷提供依据。
参考文献
[1]国家中药管理局《中华本草》编委会.中华本草：第8册[M].上海：上海科学技术出版社，1999：130-135.
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[3]W. G. M A， Tan R X， Fuzzati N， et al. Cheminform Abstract： Wahlenbergioside， a Phenylpropanoid Glucoside from Wahlenbergia marginata[J]. Phytochemistry， 1997， 45（2）：411-415.
[4]柯鹏颉.蓝花参中挥发油的气质联用分析[J].海峡药学，2006，18（3）：88-89.
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[6]李雪飞，江洪.橙皮苷药理学作用机制及研究进展[J].海南医学，2016，27（14）：2337-2340.
[7]李荣，胡成穆，姜辉，等.橙皮苷的提取及其抗炎活性研究[J].安徽医科大学学报，2007，42（5）：546-549.
[8]叶华，曾茂贵，罗戢彬凯，等.蓝花参抗炎、止痛的药效学与急性毒性试验研究[J].福建中医药，2012，43（5）：49-50，55.
（收稿日期：2018-03-09 编辑：陶希睿）