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摘 要 以小麦秸秆纤维素为主要原料，在纤维素分解过程中，通过继代转接，筛选和驯化了一组高效而稳定的纤维素高效腐解菌系CMS-3。筛选出的复合菌系在50 ℃，静止培养条件下，在第7天可使未经任何处理的麦秸的分解率达到73%，其中纤维素、半纤维素的分解率分别为67%、75%，而对木质素的分解能力很低。复合菌系CMS-3经过多次继代筛选和培养，菌系种类组成和分解能力都具有较好的稳定性。复合菌系CMS-3中的菌种主要由隶属于芽孢杆菌属、梭菌属和瘤胃杆菌属组成，菌群结构稳定。
关键词 秸秆纤维素;分解特性;高效腐解菌系;CMS-3
中图分类号：Q946;S182 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.34.007
目前已有很多关于纤维素分解菌的报道，大部分都是以纯培养方法获得的，但单一菌株对天然纤维质成分的农业废弃物的分解能力很有限，近年来的一些研究表明，混合菌群对天然纤维质的分解能力明显高于单一菌株。本课题组在以小麦秸秆为主要原料的分解过程中，在不破坏微生物之间协同关系的条件下，筛选和驯化了一组高效而稳定的纤维素高效腐解菌系CMS-3，系统研究了该菌群的纤维素分解特性和稳定性，以及微生物种类构成。
1 材料与方法
1.1 培养条件
培养基：蛋白胨纤维素培养液（PCS），其成分为0.5%蛋白胨、0.5%麦秆粉、0.5%NaCl、0.2%CaCO3、0.1%酵母粉，在50 ℃静止培养，溶解氧DO值为0.02～0.40。
1.2 纤维素分解菌复合系CMS-3的筛选及驯化
分别用“麦秸+猪粪”“麦秸+鸡粪”“麦秸+牛粪”混合成C/N为25，含水量为65%的基质后堆积发酵。堆肥采用条垛翻堆系统，翻堆频率为每周2次，在堆肥CO2排放速率和净重减少率最大时间段取样。分别从各堆体取20 g样接种于100 mL PCS中，50 ℃静止培养;待浸在培养液中的麦秸呈糊状开始分解断裂时，转接于同样的新鲜培养液中。如此分别转接数代后，将pH检测反应偏酸和偏碱的培养物混合接种，在传代过程中筛选出麦秸分解速度快而且pH保持稳定的复合体，最终驯化成高效且稳定的复合系CMS-3。
1.3 纤维素分解活性的测定
1）CMC糖化法。将培养液直接以3 000 r·min-1离心15 min后提取粗酶液。酶促反应温度为60 ℃，反应时间为5 min，DNS显色反应时间5 min，测定波长为490 nm。
2）减重法。将1 g的滤纸作为唯一碳源配制100 mL PCS，接种10 mL CMS-3菌液，50 ℃静止培养72 h后，5 000 r·min-1离心，倒上清液，用盐酸和硝酸的混合液冲洗以消除菌体，离心，清水洗，再离心，最后105 ℃烘干后称重，计算失重量和失重率。
1.4 CMS-3对不同纤维素材料的分解能力
分别取1 g的滤纸、未经处理的麦秆和锯末作为唯一碳源，配制200 mL PCS，接种10 mL CMS-3菌液，50 ℃静止培养72 h后，用失重法测定分解能力。
1.5 连续培养条件下CMS-3发酵液的pH和纤维素分解能力的稳定性
在2 000 mL三角瓶中装1 500 mL PCS，每瓶加3 g麦秸，不调pH值。分2组：一组不再供应新的麦秸，在50 ℃下继续培养，每天测定1次培养液的pH值;另一组在第1次供应的麦秸大部分分解时开始每天追加1.5 g麦秸，每天测定1次pH值，并观察麦秸的分解情况。
1.6 麦秸残留中纤维素、半纤维素和木质素含量的测定
取1 g小麦秸秆作为唯一碳源，配制190 mL PCS，接种10 mL CMS-3菌液，50 ℃静止培养20 d。共设20个重复，分别在第0， 7， 15， 20天取样，每个时间点取3个重复样品。将烘干后的秸秆残渣粉碎，过1 mm的筛子，称取0.2～0.5 g装入滤袋，3个重复，采用范式洗涤法[1]测定秸秆的可溶性物质、纤维素、半纤维素和木质素。
1.7 发酵液中可溶性糖的测定
蒽酮比色法，设3次重复。
1.8 复合菌系CMS-3种类组成分析
取复合菌系CMS-3对麦秸不同发酵天数（3， 7， 10， 15， 20 d）的發酵液。用氯苯法提取每个处理样品的总DNA，用变性梯度胶电泳（DGGE）法比较不同发酵天数的16S rDNA条带，分析菌种构成。用于DGGE分析的PCR扩增区域为16S rDNA的V3区。所采用的引物为细菌通用引物对357F-GC5′-CGCCCG-CCGCGCGCGGCGGGCGGGG CGGGGGC ACGGGGGGCCTACGGG AGGCAGCAG-3′）和517R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）。反应程序为95 ℃预变性10 min，前10个循环：93 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;接下来10个循环：93 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;最后10个循环：93 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;产物最终72 ℃延伸5 min。扩增产物用2%琼脂糖胶检测。DGGE回收条带检测所用PCR引物为357F和517R，退火温度为50 ℃，循环数为25，其余同上。PCR产物用于DGGE分析。从双变性梯度凝胶上回收16S rDNA的V3区条带，再扩增、浓缩后进行碱基序列分析，扩增引物为357F（5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和517R（5′-ATTACCGCG-GCTGCTGG-3′）。登录GenBank数据库，对碱基序列进行BLAST比对，根据亲缘关系进行相似性分析。 2 结果与分析
2.1 CMS-3的筛选与驯化
3种堆肥样品中均得到有较强纤维素分解能力的培养物。其中，“麦秸+牛粪”（编号为A）的培养物麦秸分解速度最快，经168 h后相当于培养物1.0%的麦秸大部分被分解，其后依次为“麦秸+猪粪”（B）、“麦秸+鸡粪（C）”的培养物（见表1）。但随着传代次数的增加，它们的纤维素分解速度变慢，发酵液的pH值也不稳定，在三种堆肥样品培养物中B和C发酵液逐渐趋于微酸性，A发酵液逐渐趋于微碱性，最终停止反应。将A， B， C三种发酵液互相混合接种，得到1组麦秸分解速度144 h的混合体。经多次的传代、驯化，混合体在发酵过程中的pH值已稳定在6.5左右，并在2 L的培养规模上连续投放麦秸的情况下分解活性保持1个月以上。此混合体即为含多种纤维素分解菌的高效而稳定的纤维素分解菌复合系（编号为CMS-3）。
2.2 CMS-3分解麦秸的纤维素酶活性及分解率
在含有1 g滤纸的200 mL PCS中，接CMS-3菌液10 mL，50 ℃静止培养，第48， 72， 96 h用CMC糖化力法分别测定纤维素酶活。结果酶活性分别为101.8±2.6， 97.5±1.4， 90.2±0.5 U·mL-1，第48 h的活性最高。在实际观察时，第48 h纸片变膨松，第72 h纸片大部分区域崩解，第96 h已完全崩解，说明最高的酶活性出现在外观上纸片变膨松的初期。第96 h用失重法测定结果，1 g滤纸失重0.83 g，分解率为83%。失重法能比较真实地反映该复合系的纤维分解能力。
2.3 CMS-3对不同纤维素材料分解能力的比较
用失重法测定CMS-3对滤纸、麦秆粉及锯末的分解率。其中，对滤纸的分解率最高，在96 h内200 mL培养液中1 g滤纸几乎全部被分解，分解率为（90±0.3）%;对麦秸、锯末的分解率分别为（73±0.2）%、（12±0.4）%。由此可见，CMS-3对含较纯木质纤维素的滤纸有很强的分解能力，对结构复杂木质纤维素的麦秸也有较强的分解能力，而对木质素含量较高的锯末分解能力很有限。
2.4 在连续培养条件下CMS-3发酵液pH和对纤维素分解能力的稳定性
未调pH的2瓶PCS培养液（A和B瓶）灭菌后的pH值为8.2和8.1。接种CMS-3培养48 h后，两者的pH值下降到6.3和6.4，在48～96 h维持同样pH并将3 g麦秸大部分分解;随后，A瓶的pH值就上升，到第7天稳定在8.2左右（见图1），此水平能维持30 d。B瓶在麦秸大部分被分解时（第7天）开始每天连续投放1.5 g麦秸，结果前20 d不仅投放的麦秸大部分分解，其pH值还一直稳定在6.2～6.4。这说明CMS-3的生长和纤维素分解功能相当稳定。
2.5 CMS-3分解麦秸过程中可溶性物质、纤维素、半纤维素和木质素的含量
CMS-3分解麦秸过程中可溶性物质、纤维素、半纤维素和木质素的含量见图2。可以看出，CMS-3对小麦秸秆具有较强的分解能力，在第7天时，纤维素、半纤维素的分解率达67%和75%，木质素的分解率仅为5.4%;在第15天和20天，纤维素、半纤维素和木质素的分解率均略有降低。由此可知，CMS-3对小麦秸秆在第7天可完成大部分的分解，且主要分解半纤维素、纤维素，而对木质素的分解能力很低。
2.6 CMS-3分解麦秸过程中可溶性糖的含量
CMS-3分解麦秸过程中，0， 7， 15， 20 d可溶性糖的含量分别为0.16±0.04， 0.07±0.005， 0.055±0.004， 0.050±0.003 mg·mL-1。可见，培养体系的可溶性糖从开始的较高水平一直下降，且在第7天时可溶性糖的下降幅度最大，秸秆分解率与分解体系的可溶性糖的积累量呈负相关。
2.7 复合菌系CMS-3种类的组成
复合菌系CMS-3在分解麦秸过程中各时间点的16S rDNA条带PCR的变性梯度胶电泳（DGGE）结果见图3，菌系种类组成见表2。由图3可知，不同时间点的DGGE主要条带变化不大，这说明该复合菌系在分解麦秸过程中菌种組成稳定。由表2可知，该复合菌系有好氧的芽孢杆菌属、厌氧的梭菌属和瘤胃杆菌属。已有研究表明，这几类菌种都与纤维素的分解有关，其中梭菌属能牢牢地沾附在秸秆上，且能利用纤维二糖、木糖、葡萄糖和蔗糖产生乙酸、乳酸和H2。复合菌系CMS-3具有强分解麦秸的能力可能是上述几类菌种协同作用的结果，其协同机理还有待进一步研究。
3 结论
从三种堆肥样品中筛选出的复合菌系CMS-3在50 ℃，静止培养条件下，在第7天可使未经任何处理的麦秸的分解率达到73%，其中纤维素、半纤维素的分解率分别为67%、75%，而对木质素的分解能力很低。与已有研究结果相比，该复合菌系的分解能力处于较高水平。
复合菌系CMS-3经过多次继代筛选和培养，菌系种类组成和分解能力都具有较好的稳定性。复合菌系CMS-3中的菌种主要由隶属于芽孢杆菌属、梭菌属和瘤胃杆菌属组成，其较强的麦秸分解能力可能是这几类菌种的协同作用的结果。
复合菌系CMS-3作为农业纤维质固体废弃物的高效腐解菌，在农业废弃物处理利用中具有广泛的应用前景。
参考文献：
[1] 戴晓虎，于春晓，李宁，等.有机负荷对醋糟厌氧消化系统启动的影响[J].环境科学，2017，38（3）：1144-1150.
关键词 秸秆纤维素;分解特性;高效腐解菌系;CMS-3
中图分类号：Q946;S182 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.34.007
目前已有很多关于纤维素分解菌的报道，大部分都是以纯培养方法获得的，但单一菌株对天然纤维质成分的农业废弃物的分解能力很有限，近年来的一些研究表明，混合菌群对天然纤维质的分解能力明显高于单一菌株。本课题组在以小麦秸秆为主要原料的分解过程中，在不破坏微生物之间协同关系的条件下，筛选和驯化了一组高效而稳定的纤维素高效腐解菌系CMS-3，系统研究了该菌群的纤维素分解特性和稳定性，以及微生物种类构成。
1 材料与方法
1.1 培养条件
培养基：蛋白胨纤维素培养液（PCS），其成分为0.5%蛋白胨、0.5%麦秆粉、0.5%NaCl、0.2%CaCO3、0.1%酵母粉，在50 ℃静止培养，溶解氧DO值为0.02～0.40。
1.2 纤维素分解菌复合系CMS-3的筛选及驯化
分别用“麦秸+猪粪”“麦秸+鸡粪”“麦秸+牛粪”混合成C/N为25，含水量为65%的基质后堆积发酵。堆肥采用条垛翻堆系统，翻堆频率为每周2次，在堆肥CO2排放速率和净重减少率最大时间段取样。分别从各堆体取20 g样接种于100 mL PCS中，50 ℃静止培养;待浸在培养液中的麦秸呈糊状开始分解断裂时，转接于同样的新鲜培养液中。如此分别转接数代后，将pH检测反应偏酸和偏碱的培养物混合接种，在传代过程中筛选出麦秸分解速度快而且pH保持稳定的复合体，最终驯化成高效且稳定的复合系CMS-3。
1.3 纤维素分解活性的测定
1）CMC糖化法。将培养液直接以3 000 r·min-1离心15 min后提取粗酶液。酶促反应温度为60 ℃，反应时间为5 min，DNS显色反应时间5 min，测定波长为490 nm。
2）减重法。将1 g的滤纸作为唯一碳源配制100 mL PCS，接种10 mL CMS-3菌液，50 ℃静止培养72 h后，5 000 r·min-1离心，倒上清液，用盐酸和硝酸的混合液冲洗以消除菌体，离心，清水洗，再离心，最后105 ℃烘干后称重，计算失重量和失重率。
1.4 CMS-3对不同纤维素材料的分解能力
分别取1 g的滤纸、未经处理的麦秆和锯末作为唯一碳源，配制200 mL PCS，接种10 mL CMS-3菌液，50 ℃静止培养72 h后，用失重法测定分解能力。
1.5 连续培养条件下CMS-3发酵液的pH和纤维素分解能力的稳定性
在2 000 mL三角瓶中装1 500 mL PCS，每瓶加3 g麦秸，不调pH值。分2组：一组不再供应新的麦秸，在50 ℃下继续培养，每天测定1次培养液的pH值;另一组在第1次供应的麦秸大部分分解时开始每天追加1.5 g麦秸，每天测定1次pH值，并观察麦秸的分解情况。
1.6 麦秸残留中纤维素、半纤维素和木质素含量的测定
取1 g小麦秸秆作为唯一碳源，配制190 mL PCS，接种10 mL CMS-3菌液，50 ℃静止培养20 d。共设20个重复，分别在第0， 7， 15， 20天取样，每个时间点取3个重复样品。将烘干后的秸秆残渣粉碎，过1 mm的筛子，称取0.2～0.5 g装入滤袋，3个重复，采用范式洗涤法[1]测定秸秆的可溶性物质、纤维素、半纤维素和木质素。
1.7 发酵液中可溶性糖的测定
蒽酮比色法，设3次重复。
1.8 复合菌系CMS-3种类组成分析
取复合菌系CMS-3对麦秸不同发酵天数（3， 7， 10， 15， 20 d）的發酵液。用氯苯法提取每个处理样品的总DNA，用变性梯度胶电泳（DGGE）法比较不同发酵天数的16S rDNA条带，分析菌种构成。用于DGGE分析的PCR扩增区域为16S rDNA的V3区。所采用的引物为细菌通用引物对357F-GC5′-CGCCCG-CCGCGCGCGGCGGGCGGGG CGGGGGC ACGGGGGGCCTACGGG AGGCAGCAG-3′）和517R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）。反应程序为95 ℃预变性10 min，前10个循环：93 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;接下来10个循环：93 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;最后10个循环：93 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min;产物最终72 ℃延伸5 min。扩增产物用2%琼脂糖胶检测。DGGE回收条带检测所用PCR引物为357F和517R，退火温度为50 ℃，循环数为25，其余同上。PCR产物用于DGGE分析。从双变性梯度凝胶上回收16S rDNA的V3区条带，再扩增、浓缩后进行碱基序列分析，扩增引物为357F（5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和517R（5′-ATTACCGCG-GCTGCTGG-3′）。登录GenBank数据库，对碱基序列进行BLAST比对，根据亲缘关系进行相似性分析。 2 结果与分析
2.1 CMS-3的筛选与驯化
3种堆肥样品中均得到有较强纤维素分解能力的培养物。其中，“麦秸+牛粪”（编号为A）的培养物麦秸分解速度最快，经168 h后相当于培养物1.0%的麦秸大部分被分解，其后依次为“麦秸+猪粪”（B）、“麦秸+鸡粪（C）”的培养物（见表1）。但随着传代次数的增加，它们的纤维素分解速度变慢，发酵液的pH值也不稳定，在三种堆肥样品培养物中B和C发酵液逐渐趋于微酸性，A发酵液逐渐趋于微碱性，最终停止反应。将A， B， C三种发酵液互相混合接种，得到1组麦秸分解速度144 h的混合体。经多次的传代、驯化，混合体在发酵过程中的pH值已稳定在6.5左右，并在2 L的培养规模上连续投放麦秸的情况下分解活性保持1个月以上。此混合体即为含多种纤维素分解菌的高效而稳定的纤维素分解菌复合系（编号为CMS-3）。
2.2 CMS-3分解麦秸的纤维素酶活性及分解率
在含有1 g滤纸的200 mL PCS中，接CMS-3菌液10 mL，50 ℃静止培养，第48， 72， 96 h用CMC糖化力法分别测定纤维素酶活。结果酶活性分别为101.8±2.6， 97.5±1.4， 90.2±0.5 U·mL-1，第48 h的活性最高。在实际观察时，第48 h纸片变膨松，第72 h纸片大部分区域崩解，第96 h已完全崩解，说明最高的酶活性出现在外观上纸片变膨松的初期。第96 h用失重法测定结果，1 g滤纸失重0.83 g，分解率为83%。失重法能比较真实地反映该复合系的纤维分解能力。
2.3 CMS-3对不同纤维素材料分解能力的比较
用失重法测定CMS-3对滤纸、麦秆粉及锯末的分解率。其中，对滤纸的分解率最高，在96 h内200 mL培养液中1 g滤纸几乎全部被分解，分解率为（90±0.3）%;对麦秸、锯末的分解率分别为（73±0.2）%、（12±0.4）%。由此可见，CMS-3对含较纯木质纤维素的滤纸有很强的分解能力，对结构复杂木质纤维素的麦秸也有较强的分解能力，而对木质素含量较高的锯末分解能力很有限。
2.4 在连续培养条件下CMS-3发酵液pH和对纤维素分解能力的稳定性
未调pH的2瓶PCS培养液（A和B瓶）灭菌后的pH值为8.2和8.1。接种CMS-3培养48 h后，两者的pH值下降到6.3和6.4，在48～96 h维持同样pH并将3 g麦秸大部分分解;随后，A瓶的pH值就上升，到第7天稳定在8.2左右（见图1），此水平能维持30 d。B瓶在麦秸大部分被分解时（第7天）开始每天连续投放1.5 g麦秸，结果前20 d不仅投放的麦秸大部分分解，其pH值还一直稳定在6.2～6.4。这说明CMS-3的生长和纤维素分解功能相当稳定。
2.5 CMS-3分解麦秸过程中可溶性物质、纤维素、半纤维素和木质素的含量
CMS-3分解麦秸过程中可溶性物质、纤维素、半纤维素和木质素的含量见图2。可以看出，CMS-3对小麦秸秆具有较强的分解能力，在第7天时，纤维素、半纤维素的分解率达67%和75%，木质素的分解率仅为5.4%;在第15天和20天，纤维素、半纤维素和木质素的分解率均略有降低。由此可知，CMS-3对小麦秸秆在第7天可完成大部分的分解，且主要分解半纤维素、纤维素，而对木质素的分解能力很低。
2.6 CMS-3分解麦秸过程中可溶性糖的含量
CMS-3分解麦秸过程中，0， 7， 15， 20 d可溶性糖的含量分别为0.16±0.04， 0.07±0.005， 0.055±0.004， 0.050±0.003 mg·mL-1。可见，培养体系的可溶性糖从开始的较高水平一直下降，且在第7天时可溶性糖的下降幅度最大，秸秆分解率与分解体系的可溶性糖的积累量呈负相关。
2.7 复合菌系CMS-3种类的组成
复合菌系CMS-3在分解麦秸过程中各时间点的16S rDNA条带PCR的变性梯度胶电泳（DGGE）结果见图3，菌系种类组成见表2。由图3可知，不同时间点的DGGE主要条带变化不大，这说明该复合菌系在分解麦秸过程中菌种組成稳定。由表2可知，该复合菌系有好氧的芽孢杆菌属、厌氧的梭菌属和瘤胃杆菌属。已有研究表明，这几类菌种都与纤维素的分解有关，其中梭菌属能牢牢地沾附在秸秆上，且能利用纤维二糖、木糖、葡萄糖和蔗糖产生乙酸、乳酸和H2。复合菌系CMS-3具有强分解麦秸的能力可能是上述几类菌种协同作用的结果，其协同机理还有待进一步研究。
3 结论
从三种堆肥样品中筛选出的复合菌系CMS-3在50 ℃，静止培养条件下，在第7天可使未经任何处理的麦秸的分解率达到73%，其中纤维素、半纤维素的分解率分别为67%、75%，而对木质素的分解能力很低。与已有研究结果相比，该复合菌系的分解能力处于较高水平。
复合菌系CMS-3经过多次继代筛选和培养，菌系种类组成和分解能力都具有较好的稳定性。复合菌系CMS-3中的菌种主要由隶属于芽孢杆菌属、梭菌属和瘤胃杆菌属组成，其较强的麦秸分解能力可能是这几类菌种的协同作用的结果。
复合菌系CMS-3作为农业纤维质固体废弃物的高效腐解菌，在农业废弃物处理利用中具有广泛的应用前景。
参考文献：
[1] 戴晓虎，于春晓，李宁，等.有机负荷对醋糟厌氧消化系统启动的影响[J].环境科学，2017，38（3）：1144-1150.