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摘要 离体条件下测定并比较了10种杀菌剂对番茄早疫病菌、苹果斑点落叶病菌、梨黑斑病菌、烟草赤星病菌和甘蓝黑斑病菌等5种链格孢属植物病原真菌的抗菌活性。结果表明，不同种的链格孢属病菌对同一药剂的敏感性相近；咪鲜胺、啶菌恶唑、苯醚甲环唑、异菌脲、腐霉利等5种杀菌剂对供试病菌菌丝生长的抑制活性最好，其EC50在0.01～1.28ug/mL之间；百菌清对病菌分生孢子萌发的抑制活性最高，其次是醚菌酯和嘧菌酯。
关键词 杀菌剂；链格孢属病菌；菌丝生长；孢子萌发
中图分类号 S482.2
链格孢属(Alternaria Nees)真菌是重要的植物病原菌属之一，除少数种可侵染人和动物，引起皮癣、甲癣、颚骨髓炎等疾病外，大多数种可寄生于植物引起包括玉米、小麦、烟草、马铃薯、番茄、苹果、梨、甘蓝、人参等的几十种植物病害。这类病菌的代谢产物即毒素可导致受害植物产生各种症状，如黑斑病、褐斑病、茎枯病、赤星病等，严重影响作物的产量和品质，给农业生产带来了巨大损失。过去应用较多的苯并咪唑类杀菌剂如多菌灵等对这类病害的防效通常较差或无效，市场上专门用于防治这类病害的药剂品种较少，给生产上选择防治这类病害的药剂带来困难。
本文测定并比较了10种杀菌剂对5种常见链格孢属病菌的离体抗菌活性，旨在了解这些药剂对链格孢属真菌的活性，以及这些药剂对链格孢属病菌的作用特点，从而为生产上防治这类病害时科学用药以及企业开发混配药剂提供理论参考。
1 材料与方法
1．1 供试病菌
番茄早疫病菌(Alternaria solani)、苹果斑点落叶病菌(A.mali)、甘蓝黑斑病菌(A.brassicae)、梨黑斑病菌(A.kikuchiana)、烟草赤星病菌(A.lon-gipes)，均为本研究室保存菌种。
1．2 供试药剂
试验药剂为95.4％醚菌酯(kresoxim-methyl)原药(江苏耕耘化学有限公司)、98.1％腐霉利(pro-cymidone)原药(浙江禾益农化有限公司)、98.2％多菌灵(carbendazim)原药(江苏苏化集团新沂农化有限公司)、25％嘧菌酯(azoxystrobin)悬浮剂(先正达公司)、96％异菌脲(iprodione)原药(江苏苏化集团新沂农化有限公司)、95％三唑酮(triadimefon)原药(江苏苏化集团新沂农化有限公司)、99.3％咪鲜胺(prochloraz)原药(乐斯化学有限公司)、95.2％苯醚甲环唑(difenoconazole)原药(江苏耕耘化学有限公司)、84％啶菌恶唑(SYP-Z048)EC(沈阳化工研究院)、98％百菌清(chlorothalonil)原药(江苏宝灵化工有限公司)。除将25％嘧菌酯SC溶于无菌水外，其余原药均溶于丙酮中制成适当浓度的母液保存于4℃冰箱中备用。
1．3 供试病菌的培养及孢子悬浮液的制备
1．3．1 供试病菌的预培养
将5种供试病菌在马铃薯蔗糖琼脂(PSA)平板上，(25±1)℃下黑暗培养，待菌落边缘接近皿壁时，即可打取菌饼用于试验。
1．3．2 供试病菌孢子悬浮液的制备
将4种供试病菌番茄早疫病菌、甘蓝黑斑病菌、梨黑斑病菌、烟草赤星病菌在PSA平板上，(25±1)℃、12 h∥12 h(D∥L)光照条件下培养8 d后，向培养皿中加入10 mL无菌水，用无菌曲玻棒轻轻洗下菌落中的分生孢子，尽量减少菌丝断裂。两层无菌纱布过滤得到分生孢子悬浮液，在显微镜下(10×10倍)检查孢子数，平均每视野60～100個孢子即可。
1．4 药剂敏感性测定方法
1．4．1 供试药剂对病菌菌丝生长的影响
采用平皿菌丝生长抑制法测定供试药剂对各病菌菌丝生长的抑制活性，即在预试验的基础上，选择各药剂对病菌菌丝生长抑制率在10％～90％范围内的5个浓度；将配制好的供试药剂母液按照设定的浓度比例加入到已融化并冷却至50℃左右的PSA培养基中，充分混匀后分别倒入3个灭菌的培养皿中，制成系列浓度的含药PSA平板，以不加药剂但含等量溶剂的PSA平板为对照。用直径为6 mm的打孔器在预培养的菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，菌丝面朝下接种到含药培养基平板中央，置于(25±1)℃下黑暗培养，待对照的菌落边缘接近皿壁时用十字交叉法测量各处理的菌落直径，并求出3次重复的平均值，得出各处理的平均菌落增长直径(一平均菌落直径-6mm)，并计算各药剂处理对病菌的菌丝生长抑制率。
抑制率＝[对照的菌落增长直径(mm)-处理的菌落增长直径(mm)]/[对照的菌落增长直径(mm)]×100％。
以试验中设定的浓度对数为横坐标(z)，抑制率几率值为纵坐标(y)，求出各药剂对供试病菌的毒力回归曲线方程y=a bx、相关系数r以及有效抑制中浓度(EC50)。最后根据EC50值，分析比较不同杀菌剂对供试病菌菌丝生长的影响。
1．4．2 供试药剂对4种病菌分生孢子萌发的影响
采用琼胶平板法测定药剂对病菌分生孢子萌发的影响。将各药剂分别加入到灭菌冷却至50℃左右的水琼胶培养基(琼脂2％，蔗糖1％)中，制成浓度为1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L的带毒琼胶平板，并设不加药剂的琼胶平板为对照。待琼胶平板完全凝固后，以移液枪取200#L孢子悬浮液加入平板中，用曲玻棒涂抹均匀，置于(25±1)℃下黑暗培养10～12 h。待对照孢子萌发率超过90％以上时，在显微镜下(10×10倍)检查各处理平板孢子萌发数，每处理计数200个以上孢子。与空白对照比较计算各药剂对病菌分生孢子萌发的抑制率，分析比较不同杀菌剂对供试病菌分生孢子萌发的影响。
2 结果与分析
2．1 对病菌菌丝生长的影响
供试10种药剂对5种链格孢属病原真菌菌丝生长的毒力测定结果见表1，从表中可见，异菌脲、腐霉利、咪鲜胺、苯醚甲环唑、啶菌恶唑等5种药剂对病菌菌丝生长的抑制活性均较高，除异菌脲对番茄早疫病菌的EC50为1.28ug/mL外，其余EC50均小于1ug/mL，且这些药剂对不同种的链格孢属病菌的活性差异较小，EC50均相差在5倍以内。此外，结果也表明生产上应用较多的苯并咪唑类杀菌剂多菌灵对这类病菌的活性较差，EC50均大于100 ug/mL。尽管三唑酮、咪鲜胺、苯醚甲环唑等均为病菌麦角甾醇生物合成抑制剂，但它们对链格孢属病菌的活性存在差异，后两种药剂均表现出了较高的活性。
2．2 对分生孢子萌发的影响 由于本研究所用苹果斑点落叶病菌菌株的分生孢子产生量较低，因此仅测定了其余4种链格孢属真菌的分生孢子萌发对10种药剂的敏感性。结果表明(表2)，不同药剂对同一种链格孢真菌分生孢子萌发的抑制活性不同，但同一药剂对不同种链格孢病菌的活性相近。在药剂浓度为100ug/mL时，百菌清对4种供试病菌分生孢子萌发的相对抑制率达到了94.28％～100％，抑制作用最强，其次是醚菌酯(78.02％～91.79％)、嘧菌酯(78.04％～89.95％)、啶菌恶唑(69.50％～88.39％)、腐霉利(68.00％～85.72％)，抑制作用较低的杀菌剂有异菌脲(48.70％～73.79％)、咪鲜胺(14.72％～75.63％)、苯醚甲环唑(15.45％～51.93％)，抑制作用最低的杀菌剂有三唑酮(1.74％～20.84％)和多菌灵(5.67％～12.35％)。在药剂浓度为10ug/mL时，除百菌清、醚菌酯、嘧菌酯、啶菌恶唑4种杀菌剂仍具有较高的相对抑制率外，其余6种杀菌剂的相对抑制率均低于25％。在药剂浓度为1/ug/mL时，百菌清对4种供试病菌分生孢子的萌发仍有80％以上的相对抑制率，醚菌酯和嘧菌酯则具有20.01％～52.09％的相对抑制率，啶菌恶唑仅有11.00％～25.23％的相对抑制率。
3 讨论
本文所选用的5种供试植物病原菌所致病害均是生产上发生普遍、危害严重的链格孢属病菌，如番茄早疫病又称轮纹病，全国各地普遍发生，是番茄重要病害之一，发病严重时引起落叶、落果和断枝，对产量影响很大，常年减产20％～30％，严重时达50％以上，甚至绝产；烟草赤星病是烟叶成熟后期重要的叶部病害，是烟草生产上威胁最大的病害之一，对烟草的产量和品质均造成严重影响，自1892年首次报道烟草赤星病以来，曾几次给世界烟叶生产带来巨大的经济损失。对这类病害的防治目前均缺乏有效的抗病作物品种，主要依赖于化学药剂进行防治，过去防治此类病害使用的药剂主要有二硫代氨基甲酸酯类、芳烃类、二甲酰亚胺类等，常见的品种如代森锰锌、百菌清、菌核净、异菌脲、腐霉利等，但这些药剂防治效果较好，治疗效果差，而且这些杀菌剂已经使用了十几年甚至几十年，有些品种的施用量已经达到原有用量的數倍，抗药性问题严重，这不仅提高了农业生产成本，而且由于过量用药导致环境污染严重，危害生物安全。因此，研究使用新型高效、广谱、作用机理不同、结果新颖的杀菌剂以及科学合理使用现有药剂防治这类病害是生产上亟待解决的问题。
本研究表明，同一药剂对不同种类的链格孢属植物病菌的活性相近，因此，生产上在选择药剂防治此类病害时可相互借鉴用药方案，但不同种的链格孢病菌由于用药历史和防治水平的差异，其抗药性发生状况也不尽相同。结果表明苯并咪唑类的多菌灵无论对菌丝生长还是孢子萌发的活性均较低；百菌清虽然对菌丝生长的抑制活性较差，但对孢子萌发的抑制活性高，其为多作用位点保护性杀菌剂，使用多年来未出现抗药性问题，建议与其他高效内吸性药剂混配使用防治这类病害；异菌脲和腐霉利均为二甲酰亚胺类杀菌剂，均对菌丝生长的抑制活性较高，但对孢子萌发的抑制作用较低，且内吸性较差，抗性风险较高；三唑酮、咪鲜胺、苯醚甲环唑等均是麦角甾醇生物合成抑制剂，均对孢子萌发的抑制活性较差，但后面两种药剂对菌丝生长抑制活性较高；啶菌恶唑是我国自主研制的新颖结构杀菌剂，对菌丝生长的抑制活性较高，对孢子萌发也有一定的抑制活性；醚菌酯和嘧菌酯为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，均是新近开发的线粒体呼吸抑制剂，对病菌孢子萌发活性较高，但由于在离体培养基平板上没有抑制病菌旁路呼吸代谢途径的物质，因此降低了其对菌丝生长的抑制活性，而在植物体内存在抑制旁路氧化酶(AOX)的(类)黄酮类物质，因此在植物活体上的活性较高，已有报道其在防治番茄早疫病及苹果斑点落叶病具有优良的防治效果，但已有报道病菌对甲氧基丙烯酸酯类药剂产生了抗性问题。因此，生产上可根据这些药剂的活性和作用特点，轮换或混配使用用于链格孢属真菌病害的防治，以达到理想的防治效果，并能延长这些药剂的使用寿命。
关键词 杀菌剂；链格孢属病菌；菌丝生长；孢子萌发
中图分类号 S482.2
链格孢属(Alternaria Nees)真菌是重要的植物病原菌属之一，除少数种可侵染人和动物，引起皮癣、甲癣、颚骨髓炎等疾病外，大多数种可寄生于植物引起包括玉米、小麦、烟草、马铃薯、番茄、苹果、梨、甘蓝、人参等的几十种植物病害。这类病菌的代谢产物即毒素可导致受害植物产生各种症状，如黑斑病、褐斑病、茎枯病、赤星病等，严重影响作物的产量和品质，给农业生产带来了巨大损失。过去应用较多的苯并咪唑类杀菌剂如多菌灵等对这类病害的防效通常较差或无效，市场上专门用于防治这类病害的药剂品种较少，给生产上选择防治这类病害的药剂带来困难。
本文测定并比较了10种杀菌剂对5种常见链格孢属病菌的离体抗菌活性，旨在了解这些药剂对链格孢属真菌的活性，以及这些药剂对链格孢属病菌的作用特点，从而为生产上防治这类病害时科学用药以及企业开发混配药剂提供理论参考。
1 材料与方法
1．1 供试病菌
番茄早疫病菌(Alternaria solani)、苹果斑点落叶病菌(A.mali)、甘蓝黑斑病菌(A.brassicae)、梨黑斑病菌(A.kikuchiana)、烟草赤星病菌(A.lon-gipes)，均为本研究室保存菌种。
1．2 供试药剂
试验药剂为95.4％醚菌酯(kresoxim-methyl)原药(江苏耕耘化学有限公司)、98.1％腐霉利(pro-cymidone)原药(浙江禾益农化有限公司)、98.2％多菌灵(carbendazim)原药(江苏苏化集团新沂农化有限公司)、25％嘧菌酯(azoxystrobin)悬浮剂(先正达公司)、96％异菌脲(iprodione)原药(江苏苏化集团新沂农化有限公司)、95％三唑酮(triadimefon)原药(江苏苏化集团新沂农化有限公司)、99.3％咪鲜胺(prochloraz)原药(乐斯化学有限公司)、95.2％苯醚甲环唑(difenoconazole)原药(江苏耕耘化学有限公司)、84％啶菌恶唑(SYP-Z048)EC(沈阳化工研究院)、98％百菌清(chlorothalonil)原药(江苏宝灵化工有限公司)。除将25％嘧菌酯SC溶于无菌水外，其余原药均溶于丙酮中制成适当浓度的母液保存于4℃冰箱中备用。
1．3 供试病菌的培养及孢子悬浮液的制备
1．3．1 供试病菌的预培养
将5种供试病菌在马铃薯蔗糖琼脂(PSA)平板上，(25±1)℃下黑暗培养，待菌落边缘接近皿壁时，即可打取菌饼用于试验。
1．3．2 供试病菌孢子悬浮液的制备
将4种供试病菌番茄早疫病菌、甘蓝黑斑病菌、梨黑斑病菌、烟草赤星病菌在PSA平板上，(25±1)℃、12 h∥12 h(D∥L)光照条件下培养8 d后，向培养皿中加入10 mL无菌水，用无菌曲玻棒轻轻洗下菌落中的分生孢子，尽量减少菌丝断裂。两层无菌纱布过滤得到分生孢子悬浮液，在显微镜下(10×10倍)检查孢子数，平均每视野60～100個孢子即可。
1．4 药剂敏感性测定方法
1．4．1 供试药剂对病菌菌丝生长的影响
采用平皿菌丝生长抑制法测定供试药剂对各病菌菌丝生长的抑制活性，即在预试验的基础上，选择各药剂对病菌菌丝生长抑制率在10％～90％范围内的5个浓度；将配制好的供试药剂母液按照设定的浓度比例加入到已融化并冷却至50℃左右的PSA培养基中，充分混匀后分别倒入3个灭菌的培养皿中，制成系列浓度的含药PSA平板，以不加药剂但含等量溶剂的PSA平板为对照。用直径为6 mm的打孔器在预培养的菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，菌丝面朝下接种到含药培养基平板中央，置于(25±1)℃下黑暗培养，待对照的菌落边缘接近皿壁时用十字交叉法测量各处理的菌落直径，并求出3次重复的平均值，得出各处理的平均菌落增长直径(一平均菌落直径-6mm)，并计算各药剂处理对病菌的菌丝生长抑制率。
抑制率＝[对照的菌落增长直径(mm)-处理的菌落增长直径(mm)]/[对照的菌落增长直径(mm)]×100％。
以试验中设定的浓度对数为横坐标(z)，抑制率几率值为纵坐标(y)，求出各药剂对供试病菌的毒力回归曲线方程y=a bx、相关系数r以及有效抑制中浓度(EC50)。最后根据EC50值，分析比较不同杀菌剂对供试病菌菌丝生长的影响。
1．4．2 供试药剂对4种病菌分生孢子萌发的影响
采用琼胶平板法测定药剂对病菌分生孢子萌发的影响。将各药剂分别加入到灭菌冷却至50℃左右的水琼胶培养基(琼脂2％，蔗糖1％)中，制成浓度为1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L的带毒琼胶平板，并设不加药剂的琼胶平板为对照。待琼胶平板完全凝固后，以移液枪取200#L孢子悬浮液加入平板中，用曲玻棒涂抹均匀，置于(25±1)℃下黑暗培养10～12 h。待对照孢子萌发率超过90％以上时，在显微镜下(10×10倍)检查各处理平板孢子萌发数，每处理计数200个以上孢子。与空白对照比较计算各药剂对病菌分生孢子萌发的抑制率，分析比较不同杀菌剂对供试病菌分生孢子萌发的影响。
2 结果与分析
2．1 对病菌菌丝生长的影响
供试10种药剂对5种链格孢属病原真菌菌丝生长的毒力测定结果见表1，从表中可见，异菌脲、腐霉利、咪鲜胺、苯醚甲环唑、啶菌恶唑等5种药剂对病菌菌丝生长的抑制活性均较高，除异菌脲对番茄早疫病菌的EC50为1.28ug/mL外，其余EC50均小于1ug/mL，且这些药剂对不同种的链格孢属病菌的活性差异较小，EC50均相差在5倍以内。此外，结果也表明生产上应用较多的苯并咪唑类杀菌剂多菌灵对这类病菌的活性较差，EC50均大于100 ug/mL。尽管三唑酮、咪鲜胺、苯醚甲环唑等均为病菌麦角甾醇生物合成抑制剂，但它们对链格孢属病菌的活性存在差异，后两种药剂均表现出了较高的活性。
2．2 对分生孢子萌发的影响 由于本研究所用苹果斑点落叶病菌菌株的分生孢子产生量较低，因此仅测定了其余4种链格孢属真菌的分生孢子萌发对10种药剂的敏感性。结果表明(表2)，不同药剂对同一种链格孢真菌分生孢子萌发的抑制活性不同，但同一药剂对不同种链格孢病菌的活性相近。在药剂浓度为100ug/mL时，百菌清对4种供试病菌分生孢子萌发的相对抑制率达到了94.28％～100％，抑制作用最强，其次是醚菌酯(78.02％～91.79％)、嘧菌酯(78.04％～89.95％)、啶菌恶唑(69.50％～88.39％)、腐霉利(68.00％～85.72％)，抑制作用较低的杀菌剂有异菌脲(48.70％～73.79％)、咪鲜胺(14.72％～75.63％)、苯醚甲环唑(15.45％～51.93％)，抑制作用最低的杀菌剂有三唑酮(1.74％～20.84％)和多菌灵(5.67％～12.35％)。在药剂浓度为10ug/mL时，除百菌清、醚菌酯、嘧菌酯、啶菌恶唑4种杀菌剂仍具有较高的相对抑制率外，其余6种杀菌剂的相对抑制率均低于25％。在药剂浓度为1/ug/mL时，百菌清对4种供试病菌分生孢子的萌发仍有80％以上的相对抑制率，醚菌酯和嘧菌酯则具有20.01％～52.09％的相对抑制率，啶菌恶唑仅有11.00％～25.23％的相对抑制率。
3 讨论
本文所选用的5种供试植物病原菌所致病害均是生产上发生普遍、危害严重的链格孢属病菌，如番茄早疫病又称轮纹病，全国各地普遍发生，是番茄重要病害之一，发病严重时引起落叶、落果和断枝，对产量影响很大，常年减产20％～30％，严重时达50％以上，甚至绝产；烟草赤星病是烟叶成熟后期重要的叶部病害，是烟草生产上威胁最大的病害之一，对烟草的产量和品质均造成严重影响，自1892年首次报道烟草赤星病以来，曾几次给世界烟叶生产带来巨大的经济损失。对这类病害的防治目前均缺乏有效的抗病作物品种，主要依赖于化学药剂进行防治，过去防治此类病害使用的药剂主要有二硫代氨基甲酸酯类、芳烃类、二甲酰亚胺类等，常见的品种如代森锰锌、百菌清、菌核净、异菌脲、腐霉利等，但这些药剂防治效果较好，治疗效果差，而且这些杀菌剂已经使用了十几年甚至几十年，有些品种的施用量已经达到原有用量的數倍，抗药性问题严重，这不仅提高了农业生产成本，而且由于过量用药导致环境污染严重，危害生物安全。因此，研究使用新型高效、广谱、作用机理不同、结果新颖的杀菌剂以及科学合理使用现有药剂防治这类病害是生产上亟待解决的问题。
本研究表明，同一药剂对不同种类的链格孢属植物病菌的活性相近，因此，生产上在选择药剂防治此类病害时可相互借鉴用药方案，但不同种的链格孢病菌由于用药历史和防治水平的差异，其抗药性发生状况也不尽相同。结果表明苯并咪唑类的多菌灵无论对菌丝生长还是孢子萌发的活性均较低；百菌清虽然对菌丝生长的抑制活性较差，但对孢子萌发的抑制活性高，其为多作用位点保护性杀菌剂，使用多年来未出现抗药性问题，建议与其他高效内吸性药剂混配使用防治这类病害；异菌脲和腐霉利均为二甲酰亚胺类杀菌剂，均对菌丝生长的抑制活性较高，但对孢子萌发的抑制作用较低，且内吸性较差，抗性风险较高；三唑酮、咪鲜胺、苯醚甲环唑等均是麦角甾醇生物合成抑制剂，均对孢子萌发的抑制活性较差，但后面两种药剂对菌丝生长抑制活性较高；啶菌恶唑是我国自主研制的新颖结构杀菌剂，对菌丝生长的抑制活性较高，对孢子萌发也有一定的抑制活性；醚菌酯和嘧菌酯为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，均是新近开发的线粒体呼吸抑制剂，对病菌孢子萌发活性较高，但由于在离体培养基平板上没有抑制病菌旁路呼吸代谢途径的物质，因此降低了其对菌丝生长的抑制活性，而在植物体内存在抑制旁路氧化酶(AOX)的(类)黄酮类物质，因此在植物活体上的活性较高，已有报道其在防治番茄早疫病及苹果斑点落叶病具有优良的防治效果，但已有报道病菌对甲氧基丙烯酸酯类药剂产生了抗性问题。因此，生产上可根据这些药剂的活性和作用特点，轮换或混配使用用于链格孢属真菌病害的防治，以达到理想的防治效果，并能延长这些药剂的使用寿命。