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摘要 [目的] 为犬弓首蛔虫卵壳的鉴定奠定基础。[方法] 采用3种联合作用方法对犬弓首蛔虫卵壳进行裂解，提取虫卵基因组DNA，然后用犬弓首蛔虫的ITS2特异性引物进行PCR扩增。[结果] DNA提取试剂对虫卵卵壳的作用不明显，PCR扩增结果未见预期片段；冻融后抽提DNA对虫卵卵壳有一定作用，但大多数虫卵还保留基本形态，PCR扩增结果也未见预期片段；冻融15次+蛋白酶K消化2次过夜，然后抽提DNA，虫卵大多数被裂解，利用PCR扩增到目的片段。[结论] 破坏犬弓首蛔虫卵的卵壳采用冻融+蛋白酶K消化的联合方式效果明显，关键因素是作用时间。
关键词 犬弓首蛔虫卵；卵壳裂解；DNA抽提
中图分类号 S852.7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）22-103-03
Abstract [Objective] The research aimed to lay the foundation for the identification of Toxocara canis eggshell. [Method] The eggshell of T.canis was cracked by using three combined methods to extract genomic DNA from T.canis eggs. And ITS2 specific primers of T.canis were used for PCR amplification. [Result] The cracking effects of T.canis eggshell by using DNA extracting agent was not obvious， and target fragment wasn’t seen after PCR. The method of extracting DNA after freezethawing had some cracking effects on T.canis eggshell， but most of eggshells still remained the original forms and target fragment wasn’t seen after PCR. DNA was extracted from T.canis eggshell after they were frozenthawed for 15 times and digested with protease K， then overnight. By using this method， most eggshells were cracked and target fragment was seen after PCR. [Conclusion] The method of freezethawing and digesting with protease K had obvious cracking effects on T.canis eggshell， and its key factor was action time.
Key words Toxocara canis eggs； Cracking of eggshell； DNA extraction
犬弓首蛔虫是寄生于犬科的蛔虫，与猫科动物的蛔虫都属于弓首属（Toxocara）和弓蛔属（Toxascaris）[1]。弓首蛔虫是一种人兽共患的寄生虫[2]，它们的幼虫可以进入非特异宿主（包括人类）的组织中，引起幼虫移行症，在公共卫生学上具有重要意义[2]。
寄生线虫区别于原虫，在进行分子生物学研究中虫体可用作研究材料[3-9]，少见采用虫卵。这主要是因为虫卵作为研究材料的工作会相对复杂，例如胃肠道内容物或粪便中的虫卵，常常需要经过纯化的过程才能保证后续结果的正确稳定等。吴绍强等[10]研究表明有2份经过改良的漂浮法初步纯化到犬弓首蛔虫卵液。为了进一步鉴定虫卵的正确性，笔者采提取虫卵基因组DNA，然后用文献报道的犬弓首蛔虫的ITS2特异性引物[7-8]进行PCR扩增。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
样本及来源。2份经过初步纯化浓缩的疑似犬弓首蛔虫卵液，编号分别为T.-XN-1和T.-XN-2。
1.1.2
试剂。基因快速检测试剂盒、琼脂糖、核酸荧光染料、6×Loading buffer，均购自天根生物公司。
1.2 方法
1.2.1
虫卵卵壳裂解方案。①方案1：将装有虫卵液的离心管在液氮罐中放置5 min，然后迅速移入预加热至56 ℃的恒温水浴箱中水浴5 min，将此过程重复15次；经过冻融的含虫卵液离心管中加入20 μl蛋白酶水，56 ℃水浴24 h，然后用基因快速检测试剂盒提取基因组DNA，并扩增目的片段；②方案2：重复方案1中的冻融过程3次，加入蛋白酶水，水浴過夜，其他操作同方案1；③方案3：冻融过程同方案2，不经过蛋白酶K作用，直接提取DNA并扩增检测；④方案4：直接提取DNA并扩增检测。
1.2.2
虫卵卵壳裂解效果的检测。
1.2.2.1
基因组DNA抽提与目标片段的PCR扩增。DNA抽提和PCR检验采用试剂盒，操作严格按照说明书进行。将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.2.2.2
残余沉淀显微镜检。将提取完DNA后的沉淀重悬，滴于载玻片上，显微镜100倍镜检，拍照记录结果。
2 结果与分析
2.1 DNA提取裂解液对虫卵的裂解效果 按照基因快速检测试剂盒说明书提取DNA后的沉淀，加入少量生理盐水重悬镜检，可见到很多已经去掉卵壳但未破坏卵膜的形态存在（图1）。同時，用弓首蛔虫ITS序列的通用引物进行PCR扩增，也没有获得预期结果。这说明提取DNA所用的裂解液与10 000 r/min离心联合作用对虫卵的裂解效果不佳。
2.2 冻融对虫卵的裂解效果
用冻存管盛装虫卵液，在液氮中冷冻5 min，再56 ℃水浴5 min，重复3～5次。涂片镜检。从图2可以看出，虫卵基本保持原有形态，大多数虫卵出现空泡，说明冻融具有一定的作用，但试验中的方法还没有达到有效裂解卵壳的程度，说明增加重复次数可能会增加裂解效果。
2.3 冻融+蛋白酶K消化过夜处理
基于以上试验结果，对裂解方案改进进行：冻融（重复15次）+蛋白酶K消化过夜。从图3可以看出，仍然有许多虫卵未充分裂解，但可见到明显的虫卵碎片和破裂的虫卵，说明改进方法能有效裂解虫卵。同时，利用裂解后的虫卵液提取DNA，进行ITS片段扩增，电泳图谱中可见大小约650 bp的片段（图4）。
3 讨论
（1）分离虫卵基因组DNA，首先要有充分裂解虫卵外壳和卵膜的有效方法。蛔虫虫卵往往有坚硬的卵壳，裂解工作尤为重要。实际用于裂解卵壳的作用方式包括化学试剂裂解、冻融、蛋白酶K消化和高速离心等。其中，化学试剂裂解是分离DNA的必需步骤，所有差别分组中都相同，视作平行稳定因素，可以予以忽略。高速离心对普通细胞的作用相对明显，DNA提取试剂裂解后经过10 000 r/min离心10 min的沉淀涂片镜检结果，2种方式连续处理后的卵仍然不能很好裂解，说明采用的高速离心对蛔虫卵壳的作用极弱。这也表明发挥主要作用的是冻融与蛋白酶K消化。
（2）该研究中在裂解虫卵中发挥主要作用的因素是冻融联合蛋白酶K后筛选冻融的重复次数和蛋白酶K的消化时间。在保证虫卵液完全融解和结冰的情况下，冻融的重复次数越多，裂解效果越好。蛋白酶K的消化时间越长，裂解效果同样越好。但是，研究工作的目的是进行后续的核酸研究工作，因此保证核酸的质量是必要的前提之一，也就是说，必须在最短的操作时间内获得高质量的核酸。据报道，冻融重复次数20次[10]，联合蛋白酶K消化24 h可以充分裂解蛔虫卵。笔者试验了3种虫卵卵壳裂解方案，方案1和方案3的效果不理想，方案2则最终扩增到大小理想的核酸片段，基于研究中采用的引物是针对犬弓首蛔虫的特异性鉴定引物，可以认为方案2是该研究中理想的虫卵裂解方式。
4 结论
大多数生物学试剂公司都有成熟的提取基因组DNA的试剂盒，主要的应用对象为常见生物。对于那些不属于常见生物的样本，因其特有的生物结构和组成，常规的方法可能并不适用，这就需要通过改进现有的技术来实现。笔者通过将常见技术联合起来并适当增加工作时间，在犬弓首蛔虫卵卵壳的裂解上摸索出一个相对简便的方法。采用这种摸索试验的方式，有利于更多的结构复杂的生物膜壳的裂解和基因组DNA的获取。
参考文献
[1]朱兴全.小动物寄生虫病学[M].北京：中国农业科学技术出版社，2006.
[2] 唐仲璋，唐崇惕.人兽线虫学[M].北京：科学出版社，2009.
[3] 梁轩，刘毅.犬弓首蛔虫线粒体cox1基因的克隆及序列分析[J].中国动物检疫，2015（3）：112-115.
[4] 马光旭，朱宏宏，胡铃.犬弓首蛔虫性别相关基因Tc-vit、Tc-iom、Tc-tpk、Tc-stp在不同生殖器官中的差异表达分析[J].畜牧兽医学报，2015（3）：119-124.
[5] 李广生，张莹，盛中华.狮体内蛔虫的分子生物学鉴定[J].黑龙江八一农垦大学学报，2012（6）：26-28.
[6] 吴昌义，李冰，乔进平.猪蛔虫线粒体cox3基因部分序列的比较分析[J].畜牧与兽医，2011（1）：60-62.
[7] 王培园，陈武，贺现辉.棕蓑猫蛔虫ITS及5.8S rDNA序列的克隆与分析[J].中国兽医科学，2010（10）：1013-1016.
[8] 王培园，陈武，贺现辉.华南虎蛔虫ITS及5.8S rDNA序列扩增及分析[J].畜牧与兽医，2010，42（9）：74-76.
[9] 周荣琼，夏庆友，黄汉成，等.犬弓首蛔虫ITS1基因的克隆及序列分析[J].中国预防兽医学报，2010，32（10）：818-820.
[10] 吴绍强，林祥梅，韩雪清，等.泡菜中蛔虫卵荧光PCR检测方法的建立及应用[J].食品科学，2007，28（11）：345-349.
关键词 犬弓首蛔虫卵；卵壳裂解；DNA抽提
中图分类号 S852.7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）22-103-03
Abstract [Objective] The research aimed to lay the foundation for the identification of Toxocara canis eggshell. [Method] The eggshell of T.canis was cracked by using three combined methods to extract genomic DNA from T.canis eggs. And ITS2 specific primers of T.canis were used for PCR amplification. [Result] The cracking effects of T.canis eggshell by using DNA extracting agent was not obvious， and target fragment wasn’t seen after PCR. The method of extracting DNA after freezethawing had some cracking effects on T.canis eggshell， but most of eggshells still remained the original forms and target fragment wasn’t seen after PCR. DNA was extracted from T.canis eggshell after they were frozenthawed for 15 times and digested with protease K， then overnight. By using this method， most eggshells were cracked and target fragment was seen after PCR. [Conclusion] The method of freezethawing and digesting with protease K had obvious cracking effects on T.canis eggshell， and its key factor was action time.
Key words Toxocara canis eggs； Cracking of eggshell； DNA extraction
犬弓首蛔虫是寄生于犬科的蛔虫，与猫科动物的蛔虫都属于弓首属（Toxocara）和弓蛔属（Toxascaris）[1]。弓首蛔虫是一种人兽共患的寄生虫[2]，它们的幼虫可以进入非特异宿主（包括人类）的组织中，引起幼虫移行症，在公共卫生学上具有重要意义[2]。
寄生线虫区别于原虫，在进行分子生物学研究中虫体可用作研究材料[3-9]，少见采用虫卵。这主要是因为虫卵作为研究材料的工作会相对复杂，例如胃肠道内容物或粪便中的虫卵，常常需要经过纯化的过程才能保证后续结果的正确稳定等。吴绍强等[10]研究表明有2份经过改良的漂浮法初步纯化到犬弓首蛔虫卵液。为了进一步鉴定虫卵的正确性，笔者采提取虫卵基因组DNA，然后用文献报道的犬弓首蛔虫的ITS2特异性引物[7-8]进行PCR扩增。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
样本及来源。2份经过初步纯化浓缩的疑似犬弓首蛔虫卵液，编号分别为T.-XN-1和T.-XN-2。
1.1.2
试剂。基因快速检测试剂盒、琼脂糖、核酸荧光染料、6×Loading buffer，均购自天根生物公司。
1.2 方法
1.2.1
虫卵卵壳裂解方案。①方案1：将装有虫卵液的离心管在液氮罐中放置5 min，然后迅速移入预加热至56 ℃的恒温水浴箱中水浴5 min，将此过程重复15次；经过冻融的含虫卵液离心管中加入20 μl蛋白酶水，56 ℃水浴24 h，然后用基因快速检测试剂盒提取基因组DNA，并扩增目的片段；②方案2：重复方案1中的冻融过程3次，加入蛋白酶水，水浴過夜，其他操作同方案1；③方案3：冻融过程同方案2，不经过蛋白酶K作用，直接提取DNA并扩增检测；④方案4：直接提取DNA并扩增检测。
1.2.2
虫卵卵壳裂解效果的检测。
1.2.2.1
基因组DNA抽提与目标片段的PCR扩增。DNA抽提和PCR检验采用试剂盒，操作严格按照说明书进行。将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.2.2.2
残余沉淀显微镜检。将提取完DNA后的沉淀重悬，滴于载玻片上，显微镜100倍镜检，拍照记录结果。
2 结果与分析
2.1 DNA提取裂解液对虫卵的裂解效果 按照基因快速检测试剂盒说明书提取DNA后的沉淀，加入少量生理盐水重悬镜检，可见到很多已经去掉卵壳但未破坏卵膜的形态存在（图1）。同時，用弓首蛔虫ITS序列的通用引物进行PCR扩增，也没有获得预期结果。这说明提取DNA所用的裂解液与10 000 r/min离心联合作用对虫卵的裂解效果不佳。
2.2 冻融对虫卵的裂解效果
用冻存管盛装虫卵液，在液氮中冷冻5 min，再56 ℃水浴5 min，重复3～5次。涂片镜检。从图2可以看出，虫卵基本保持原有形态，大多数虫卵出现空泡，说明冻融具有一定的作用，但试验中的方法还没有达到有效裂解卵壳的程度，说明增加重复次数可能会增加裂解效果。
2.3 冻融+蛋白酶K消化过夜处理
基于以上试验结果，对裂解方案改进进行：冻融（重复15次）+蛋白酶K消化过夜。从图3可以看出，仍然有许多虫卵未充分裂解，但可见到明显的虫卵碎片和破裂的虫卵，说明改进方法能有效裂解虫卵。同时，利用裂解后的虫卵液提取DNA，进行ITS片段扩增，电泳图谱中可见大小约650 bp的片段（图4）。
3 讨论
（1）分离虫卵基因组DNA，首先要有充分裂解虫卵外壳和卵膜的有效方法。蛔虫虫卵往往有坚硬的卵壳，裂解工作尤为重要。实际用于裂解卵壳的作用方式包括化学试剂裂解、冻融、蛋白酶K消化和高速离心等。其中，化学试剂裂解是分离DNA的必需步骤，所有差别分组中都相同，视作平行稳定因素，可以予以忽略。高速离心对普通细胞的作用相对明显，DNA提取试剂裂解后经过10 000 r/min离心10 min的沉淀涂片镜检结果，2种方式连续处理后的卵仍然不能很好裂解，说明采用的高速离心对蛔虫卵壳的作用极弱。这也表明发挥主要作用的是冻融与蛋白酶K消化。
（2）该研究中在裂解虫卵中发挥主要作用的因素是冻融联合蛋白酶K后筛选冻融的重复次数和蛋白酶K的消化时间。在保证虫卵液完全融解和结冰的情况下，冻融的重复次数越多，裂解效果越好。蛋白酶K的消化时间越长，裂解效果同样越好。但是，研究工作的目的是进行后续的核酸研究工作，因此保证核酸的质量是必要的前提之一，也就是说，必须在最短的操作时间内获得高质量的核酸。据报道，冻融重复次数20次[10]，联合蛋白酶K消化24 h可以充分裂解蛔虫卵。笔者试验了3种虫卵卵壳裂解方案，方案1和方案3的效果不理想，方案2则最终扩增到大小理想的核酸片段，基于研究中采用的引物是针对犬弓首蛔虫的特异性鉴定引物，可以认为方案2是该研究中理想的虫卵裂解方式。
4 结论
大多数生物学试剂公司都有成熟的提取基因组DNA的试剂盒，主要的应用对象为常见生物。对于那些不属于常见生物的样本，因其特有的生物结构和组成，常规的方法可能并不适用，这就需要通过改进现有的技术来实现。笔者通过将常见技术联合起来并适当增加工作时间，在犬弓首蛔虫卵卵壳的裂解上摸索出一个相对简便的方法。采用这种摸索试验的方式，有利于更多的结构复杂的生物膜壳的裂解和基因组DNA的获取。
参考文献
[1]朱兴全.小动物寄生虫病学[M].北京：中国农业科学技术出版社，2006.
[2] 唐仲璋，唐崇惕.人兽线虫学[M].北京：科学出版社，2009.
[3] 梁轩，刘毅.犬弓首蛔虫线粒体cox1基因的克隆及序列分析[J].中国动物检疫，2015（3）：112-115.
[4] 马光旭，朱宏宏，胡铃.犬弓首蛔虫性别相关基因Tc-vit、Tc-iom、Tc-tpk、Tc-stp在不同生殖器官中的差异表达分析[J].畜牧兽医学报，2015（3）：119-124.
[5] 李广生，张莹，盛中华.狮体内蛔虫的分子生物学鉴定[J].黑龙江八一农垦大学学报，2012（6）：26-28.
[6] 吴昌义，李冰，乔进平.猪蛔虫线粒体cox3基因部分序列的比较分析[J].畜牧与兽医，2011（1）：60-62.
[7] 王培园，陈武，贺现辉.棕蓑猫蛔虫ITS及5.8S rDNA序列的克隆与分析[J].中国兽医科学，2010（10）：1013-1016.
[8] 王培园，陈武，贺现辉.华南虎蛔虫ITS及5.8S rDNA序列扩增及分析[J].畜牧与兽医，2010，42（9）：74-76.
[9] 周荣琼，夏庆友，黄汉成，等.犬弓首蛔虫ITS1基因的克隆及序列分析[J].中国预防兽医学报，2010，32（10）：818-820.
[10] 吴绍强，林祥梅，韩雪清，等.泡菜中蛔虫卵荧光PCR检测方法的建立及应用[J].食品科学，2007，28（11）：345-349.