【摘 要】
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根据GenBank中已登陆的fedEF(登录号为:Z26520)核苷酸序列设计出一对引物,用PCR方法从致仔猪水肿病溶血性大肠杆菌W96株的基因组DNA中扩增出约900bp的核酸片段,将该基因克隆到pET28b(+)的Sal Ⅰ-,Hind Ⅲ位点,经PCR及多组限制性内切酶分析确定为阳性的重组子进行序列测定,结果表明插入片段为843bp,表达框读码正确.将重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细
【机 构】
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西南农业大学蚕学及生物技术学院 西南农业大学蚕学及生物技术学院;重庆永健生物技术有限责任公司(重庆
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根据GenBank中已登陆的fedEF(登录号为:Z26520)核苷酸序列设计出一对引物,用PCR方法从致仔猪水肿病溶血性大肠杆菌W96株的基因组DNA中扩增出约900bp的核酸片段,将该基因克隆到pET28b(+)的Sal Ⅰ-,Hind Ⅲ位点,经PCR及多组限制性内切酶分析确定为阳性的重组子进行序列测定,结果表明插入片段为843bp,表达框读码正确.将重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞,在LB培养基中培养至OD600为0.6-0.8时用1mM的诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测目的蛋白约---KD,以包涵体形式存在.用Ni<+>亲和柱层析纯化Histag融合蛋白,用透析法对其进行复性,当尿素降到0后有大量沉淀出现,经12000转/分离心20分钟后,上清经SDS-PAGE电泳有单一分子量的蛋白质条带出现.以该重组蛋白作为包被抗原检测平板凝集价为1:20的F18菌毛的多克隆抗体,ELISA效价为1:4000.实验结果说明我们克隆到了F18菌毛的优势抗原基因fedF,其与表达产物经复性后有良好的ELISA反应原性.
其他文献
利用PCR方法将W96株的SLT-Ⅱe B亚单位基因与其F18菌毛的优势粘附因子FedF亚单位基因以24nt的寡核苷酸连接,两亚单位均不含信号肽序列.将该合基因克隆到pUC19后测序列表明所有核苷酸序列均正确.亚克隆到pET28b后转入宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测发现约44KD的目的蛋白主要以包涵体形式存在.用Ni亲和柱层析纯化到了相应分子量的蛋白质.
根据报道的EHEC 107/86株F18ab菌毛的基因序列设计一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增重庆地区仔猪水肿病流行强毒株(W96)F18菌毛的主要亚单位基因(fedA).将该片段克隆到pET28b(+)的SalI-HindIII位点之间,序列测定结果显示该克隆片段长447bp,与107/86株EHEC fedA核苷酸序列有99.4﹪的同源性,三处核苷酸发生变异,其中两个为同义突变,另
猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性传染病,国际兽役局(OIE)将其列为A类16种法定传染病之一,我国亦将其列为一类动物传染病.据统计资料,近些年我国由病死亡猪数占饲养总数的8﹪~10﹪,其中1/3是由猪瘟引起的死亡,而更严重的是近二三十年出现了非典型的温和型猪瘟,它在病原生态、流行病学、临床表现形式等方面发生了很大变化,这给猪瘟的诊断和防制带来了难题.对此,迫切需要建立快速、灵敏、准确、便捷的诊
本研究应用分子生物学技术从App1、3型中扩增ApxⅣ的部分基因,并克隆到大肠杆菌中,经诱导体外高效表达了这种毒素,将表达产物作为抗原建立了间接ELISA,为App感染的血清学检测奠定了基础.
通过小白鼠生物过滤方法从重庆地区仔猪水肿病流行病例中分离到一株溶血性大肠杆菌,经毒力试验证明该菌对小白鼠LD小于3×10个/0.5mL,经0.2mg/mL硫酸多粘菌素B作用的细菌悬液,除菌过滤后能使小白鼠发生典型的后肢瘫痪等毒素后效应症状;分别用SLT-IIV/B引物(P1,P2)和fedA(P3,P4)引物以分离菌悬液为模板,能扩增出约200bp和500bp的特异核酸片断;经培养特性、生化试验以
从重庆某动物园死亡的大熊猫肝脏中分离到一株病毒,经鉴定为犬冠状病毒(命名为CCV DXMV).本实验根据CCV K378和CCV Insavc-1株基因序列设计合成了普通PCR引物SF-SR和SF-SR,以及半套式引物SF-SR、SRI、SFI、SF-SR和SFI,分段扩增了CCV DXMV 81-1 166位以外的S基因,得到了368bp、792bp、737bp、1 178bp和985bp 5个
用禽流感病毒番鸭分离株ZM(A/Muscovy/Zhejiang/2000(H5N1),接种11日龄SPF鸡胚,收集死亡胚尿囊液经适当方法处理后作为免疫原免疫BALB/C小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,细胞融合后经间接ELISA检测,得到一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为BB,制备的单抗腹水效价为18Log2.免疫印迹(Western-Blot)和琼脂扩散试验表明所得单抗是针对禽流感H5亚型
将鸡伤寒沙门氏菌Sg9脂多糖(LPS)抗原包被于渗滤盒检测区(T区),针对沙门氏菌O抗原单克隆抗体3-47-0包被在质控区(C区),用胶体金标记鸡伤寒沙门氏菌LPS抗原,建立了一种抗原夹心法快速检测鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌抗体的斑点免疫金渗滤法(DIGFA).人工感染鸡试验表明,DIGFA在感染后第7天即可从32只鸡中的7只检测到抗体,在时间上早于玻板凝集试验(PAT).722份现场检测血清的检疫结
用KM2培养基(含马血清)培养猪肺炎支原体(Mhp)ZCF23株.高速离心收获培养物并用PBS悬浮,经反复冻融裂解后作为免疫原,腹腔注射免疫BALB/c小鼠.利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得了5株分泌特异性抗体的单克隆细胞株,分别命名为:11C6、14C11、11B6-1、10C11-2和12E7-1.生物学特性鉴定表明,五株腹水单抗的间接ELISA效价均在1:10000左右;免疫球蛋白亚类均为IgG